CN115575526A - 一种同时检测食物中22种有机酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测食物中22种有机酸的方法，属于食品检测技术领域。本发明的一种同时检测食物中22种有机酸的方法，所述方法包括采用超高效液相色谱‑串联三重四极杆质谱仪，选用特定色谱柱Waters Torus DEA(2.1mm×100mm,1.7μm)以及碳酸氢铵水溶液和乙腈形成的流动相，检测待测样品中22种有机酸的含量；该方法能同时使得22种有机酸得到很好的分离，并且检测灵敏度高、重复性好，回收率能够满足检测标准要求，能够广泛应用于食品中有机酸的定量分析检测，并且拓展了Waters Torus DEA色谱柱的应用范围，增加其实用性。

Description

一种同时检测食物中22种有机酸的方法
技术领域
本发明涉及一种同时检测食物中22种有机酸的方法；属于食品检测技术领域。
背景技术
有机酸广泛存在于生物体中，它在生物代谢活动中起到关键作用，参与三羧酸循环、糖酵解和糖异生等重要代谢途径。有机酸具有独特的酸味和口感，是食品中重要的呈味物质。不同有机酸具有不同风味特性。如苹果酸呈味持久，爽口但有苦涩感，柠檬酸酸味柔和爽快，后味持续时间较短。丁二酸味酸，但其钠盐具有鲜味，是贝类中重要的鲜味物质。
发酵食品中，微生物的代谢活动和酶的水解作用会产生大量有机酸，赋予食品特有的发酵风味。除感官特性外，有机酸还具有多种生理活性，如抗氧化、抗菌和抗炎特性等。食品中有机酸组成是评价食品风味和营养品质重要指标，也是发酵食品生产过程中重要标志物。因此，有机酸的测定在食品加工生产中至关重要，快速准确的有机酸分析手段受到越来越多的关注。
目前多种分析方法应用于有机酸的检测，包括酶生物传感器、红外光谱、毛细管电泳、高效液相色谱、气相色谱-质谱联用等。但这些方法都存在一定的缺陷，如酶生物传感器方法单次仅能测定一种有机酸，难以实现多种有机酸同时检测的目标。应用光谱法分析时，有机酸间存在光谱信号干扰，会影响特定有机酸的分离和定量，限制该方法在复杂的样品基质中有机酸分析的应用。因此，迫切需要开发一种更高效的检测方法，实现对食品中多种有机酸同时定量分析。
近年来，超高效液相色谱-串联质谱已成为目标化合物定性定量的有力工具。结合多反应监测扫描模式，可以显著提高分析方法选择性和灵敏度。同时，有机酸作为强极性化合物，具有一至多个羧基官能团，并且部分有机酸母离子和特征子离子具有相同的质荷比；有机酸的结构和性质相似性使其较难在常规的液相进行有效分离，这也影响多种有机酸同时测定方法的建立。同时不同流动相和添加剂，对化合物在质谱端的响应强度也有较大影响，从而影响方法的灵敏度。因此，有机酸在色谱系统有效分离和质谱端的高效离子化对多种有机酸同时测定方法的开发至关重要。
发明内容
[技术问题]
有机酸是强极性化合物，结构相似，部分有机酸的母离子和特征子离子质荷比相同，现有技术较难实现多种有机酸的同时定量分析。
[技术方案]
为了解决上述问题，本发明提供了一种同时检测食物中多种有机酸的方法，具体是采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，选用特定色谱柱Waters Torus DEA(2.1mm×100mm,1.7μm)和碳酸氢铵水溶液和乙腈形成的流动相，分离效果好、检测灵敏度高，有效实现了食品中多种重要有机酸的同时定量测定。
本发明的目的是提供一种同时检测食物中22种有机酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)配制由22种有机酸和内标物形成的一系列浓度的混合标准液；
(2)待测食物样品前处理；
(3)采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪测定步骤(1)中的一系列浓度的混合标准液和步骤(2)前处理后的待测液；根据有机酸混合标准工作液中的有机酸组分浓度与有机酸组分和内标物的峰面积比值构建定量关系模型；并依据此定量关系模型和待测液峰面积比值，计算待测食物样品中22种有机酸的含量；所述超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪使用的色谱柱为Waters Torus DEA 2.1mm×100mm，1.7μm。
在一种实施方式种，所述22种有机酸包括水杨酸、富马酸、顺丁烯二酸、丙酮酸、丙二酸、己二酸、莽草酸、丁二酸、α-酮戊二酸、顺式乌头酸、苹果酸、酒石酸、焦谷氨酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、草酰乙酸、草酸、尿酸、奎尼酸、柠檬酸、异柠檬酸、乳酸。
在一种实施方式中，所述内标物为1,4-13C2-丁二酸，浓度50-500ng/mL。
在一种实施方式中，所述混合标准液的浓度为0.1～6000ng/mL，13C2-丁二酸的终浓度50ng/mL。
在一种实施方式中，所述待测食物样品为动物源样品时的前处理为：取1-5g样品加入2-5mL超纯水和3-10mL冰甲醇，冰水浴均质1-3min，然后加入10-20mL的甲基叔丁基醚，漩涡震荡，高速离心取下层液体，使用甲醇/水将取得的下层液体稀释，然后置于离心管中；加入内标物标准液，然后再加入甲醇/异丙醇溶液；漩涡震荡，高速离心后取上清液；将上清液浓缩，然后再加入等体积的乙腈/水复溶，漩涡震荡，超声，离心取上清液，即得到动物源样品待测液。
在一种实施方式中，所述甲醇/水的比例为体积比1:1。
在一种实施方式中，所述待测食物样品为植物源样品时的前处理为：取1-5g粉碎的植物源样品，加入6-15mL冰甲醇，冰水浴均质1-3min，高速离心后取上清液，使用甲醇/水将取得的上清液体稀释，然后置于离心管中，加入内标物标准液，然后再加入甲醇/异丙醇，漩涡震荡，高速离心后取上清液；将上清液浓缩，然后再加入等体积的乙腈/水复溶；漩涡震荡，超声，离心取上清，即得到植物源样品待测液。
在一种实施方式中，所述甲醇/水的比例为体积比1:1。
在一种实施方式中，所述漩涡震荡的时间为1-3min；高速离心是指10000～20000×g下离心2-15min，温度为4-8℃。
在一种实施方式中，所述均质条件为5000-10000rpm，时间为1-3min。
在一种实施方式中，所述加入甲醇/异丙醇前的样品溶液与甲醇/异丙醇混合溶液的体积比为1:3-1:5。
在一种实施方式中，所述加入甲醇/异丙醇混合溶液的体积比为1:1。
在一种实施方式中，所述乙腈/水溶液的体积比为1:1-1:4。
在一种实施方式中，所述超高效液相色谱的检测条件为：进样量：20～25μL；柱温：25℃；流动相：A相60mmol/L碳酸氢铵水溶液；B相为乙腈；洗脱流速：0.3～0.0.6mL/min；洗脱梯度：80％A相等度洗脱，自动进样器温度：10℃。
在一种实施方式中，所述串联三重四极杆质谱仪的质谱采集条件：采用电喷雾电离源(ESI)；负离子模式进行检测；采集模式：多反应监测模式(MRM)；ESI源参数设置为：气帘气(CUR)：35psi；离子化温度(TEM)：600℃；喷雾气(GS1)：60psi；辅助加热气(GS2)：60psi；碰撞气：Medium；离子化电压：-4500V。
在一种实施方式中，步骤(3)在测定样品前，用5～10mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)的乙腈/水(1:4,v/v)溶液冲洗液相系统，去除色谱系统中的金属离子，避免其对有机酸保留和测定影响。
本发明的另一目的是提供一种由上述所述方法在食品检测领域中的应用。
在一种实施方式中，所述食品包括畜禽、水产、蔬果中的一种或多种。
本发明的有益效果：
(1)本发明基于通过高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术进行定量分析；应用MRM采集模式可有效筛选目标母离子和子离子信号，实现了对食品22种重要有机酸高选择性和灵敏度检测。该方法还具有定量范围广、分析速度快、重现性好、样品及试剂消耗量小等优点，在食品中有机酸定量分析具有良好的应用前景；对比现有的有机酸检测方法，如高效液相色谱、离子色谱、气相色谱等方法，该发明的检测灵敏度更高。
(2)Waters Torus DEA(2.1mm×100mm,1.7μm)色谱柱目前多应用于阴离子型极性农药检测，也少量应用与甾醇、黄酮的检测。本发明首次应用于高效液相色谱模式下有机酸的检测；有机酸与色谱柱之间亲水和弱阴离子交换相互作用有助于其有效分离。本发明拓展了该色谱柱的应用范围，增加其实用性。
(3)在该色谱柱Waters Torus DEA(2.1mm×100mm,1.7μm)的条件下，不同流动相组成和配比对有机酸的分离效果有显著影响。经过流动相配比和添加剂的优化，在使用40-60mmol/L的碳酸氢铵水溶液和乙腈作为流动相，进行有机酸的分离。在此液相条件下，有机酸条件分离效果较好，6min可实现全物质洗脱；其中部分有机酸洗脱时间发生重叠，质谱检测器可实现对共流出有机酸的分辨和定量检测。同时，碳酸氢铵添加剂的应用，有助于有机酸在负离子模式下的氢离子脱除，形成可检测的带电离子，因此针对部分有机酸的检测灵敏度显著优于现有技术中的同类方法。
附图说明
图1为本发明实施例1混合标准品色谱图；
图2为对比例1得到的混合标准品色谱图；
图3为对比例2得到的混合标准品色谱图；
图4为对比例3得到的混合标准品色谱图；
图5为对比例4得到的混合标准品色谱图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1标准曲线、检出限及定量限的测定
(1)混合标准工作液配置
标准样品制备：称取水杨酸、富马酸、顺丁烯二酸、丙酮酸、丙二酸、己二酸、莽草酸、丁二酸、α-酮戊二酸、顺式乌头酸、苹果酸、酒石酸、焦谷氨酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、草酰乙酸、草酸、尿酸、奎尼酸、柠檬酸、异柠檬酸、乳酸22种标准品，用甲醇/水(1:1v/v)配置成浓度为1mg/mL的单标贮备液；使用乙腈/水(1:1,v/v)将单标贮备液稀释，然后将多种单标溶液混合，并加入浓度为500ng/mL的13C2-丁二酸内标工作液，分别配置成0.01、0.1、0.5、1、10、50、100、200、500、700、1000、1500、2000、3000、6000ng/mL浓度的混合标准工作液(内标13C2-丁二酸的终浓度50ng/mL)；
(2)混合工作液测定
采用超高效液相色谱(LC-30AD，日本岛津)-串联三重四极杆质谱仪(5500 QtrapSystem，美国AB Sciex)测定混合标准工作液中多种有机酸，得到混合标准工作液的有机酸组分及内标峰面积，根据有机酸混合标准工作液中的有机酸组分浓度与组分和内标的峰面积比值做线性回归；
色谱柱为Waters Torus DEA(2.1mm×100mm,1.7μm)色谱柱；
具体检测条件为：进样量：20μL；柱温：25℃；流动相：A相60mmol/L碳酸氢铵水溶液；B相为乙腈；洗脱流速：0.5mL/min；洗脱梯度：80％A相等度洗脱，自动进样器温度：10℃；
质谱采集条件：采用电喷雾电离源(ESI)；负离子模式进行检测；采集模式：多反应监测模式(MRM)；ESI源参数设置为：气帘气(CUR)：35psi；离子化温度(TEM)：600℃；喷雾气(GS1)：60psi；辅助加热气(GS2)：60psi；碰撞气：Medium；离子化电压：-4500V。不同有机酸的扫描参数如表1所示：
表1有机酸的扫描参数
Figure BDA0003863949190000051
Figure BDA0003863949190000061
所得的混合标准液中各个有机酸标准品色谱图见图1，并得出有机酸标准曲线、检出限、定量限、线性范围和相关系数见表2；如图1所示有机酸可在6min内洗脱出来，并形成峰形良好的色谱峰。22种有机酸均可以实现较好线性(R2均大于0.98)。有机酸的检出限为0.02-271.5ng/mL，定量限为0.1-678.8ng/mL。
表2化合物标准曲线、检出限、定量限、线性范围和相关系数
Figure BDA0003863949190000062
实施例2回收率及精密度测定
(1)同位素内标工作液制备
称取1,4-13C2-丁二酸标准品10mg，用甲醇/水(1:1,v/v)定容至10mL，配置成浓度为1mg/mL的单标贮备液；使用乙腈/水(1:1,v/v)将单标贮备液稀释为终浓度500ng/mL的内标工作液。
(2)样品处理：
动物源样品：取2g高白鲑背部肌肉，加入2.5mL超纯水和3mL冰甲醇，冰水浴均质2min(6000rpm)，加入10mL的甲基叔丁基醚，漩涡震荡2min；在4℃，12000×g下离心10min，取下层液体，用甲醇/水(1:1,v/v)稀释2000倍。取稀释后的溶液到离心管中，并按照1:3(v/v)加入甲醇/异丙醇(1:1,v/v)；漩涡震荡1min，在4℃，20000×g下离心2min后取上清液100-500μL；然后使用CentriVap真空浓缩离心机干燥挥干；再用等体积乙腈/水(1:1,v/v)溶解挥干物；在4℃，20000×g下离心2min后取上清液，依次向样品上清液中添加200μL浓度分别为低、中、高浓度的混合标准溶液，具体浓度如表3，得到待测样品。
植物源样品：取苹果果肉部分打碎，取2g加入6mL冰甲醇，冰水浴均质2min(6000rpm)；在4℃，12000×g下离心10min，取上清液，使用甲醇/水(1:1,v/v)稀释8000倍；取稀释后的溶液到离心管中，并按照1:3(v/v)加入甲醇/异丙醇(1:1,v/v)；漩涡震荡1min，在4℃，20000×g下离心2min后取上清液100-500μL；然后使用CentriVap真空浓缩离心机干燥挥干；再用等体积乙腈/水(1:1,v/v)溶解挥干物。在4℃，20000×g下离心2min后取上清液，依次向样品中添加200μL浓度为低、中、高浓度的混合标准溶液，具体浓度如表3，得到待测样品。
表3低、中、高水平的混合标准溶液浓度(ng/mL)
Figure BDA0003863949190000071
Figure BDA0003863949190000081
(3)回收率和精密度分析
采用实施例1步骤(2)进行测试，每个浓度设置5个重复样品，每个样品进行3次平行测定试验，并计算平均回收率；验证该方法的回收率和精密度，回收率通过以下公式计算：
回收率(％)＝(加入标准溶液的样品中目标化合物含量-空白样品中目标化合物含量)/样品中添加的标准溶液浓度×100。
在低、中、高三个浓度水平下对高白鲑和苹果样品中22种有机酸的回收率及相对标准偏差RSD测定结果见表4和表5，其中每个样品平行测定三次，结果取均值。
表4高白鲑中有机酸回收率及RSD(％)
Figure BDA0003863949190000082
Figure BDA0003863949190000091
表5苹果中有机酸回收率及RSD(％)
Figure BDA0003863949190000092
Figure BDA0003863949190000101
上述回收率结果表明，在低、中、高三种浓度下，大多数化合物的回收率80％～120％之间，RSD低于10％，满足准确定量要求。
实施例3食品中多种有机酸的测定
(1)样品制备
动物源样品：分别取2.5g阿拉斯加狭鳕鱼，高白鲑背部肌肉，加入3mL超纯水和5mL冰甲醇，冰水浴均质2min(6000rpm)，加入10mL的甲基叔丁基醚，漩涡震荡2min；在4℃，10000×g下离心15min，取下层液体，甲醇/水(1:1,v/v)稀释20倍。取稀释后的溶液到离心管中，加入内标工作液，并按照1:3(v/v)加入甲醇/异丙醇(1:1,v/v)。漩涡震荡1min，在4℃，18000×g下离心5min后取上清液200μL。使用CentriVap真空浓缩离心机干燥挥干；再用等体积乙腈/水(1:2,v/v)溶解挥干物。在4℃，18000×g下离心5min后取上清液，得到待测样品。
植物源样品：将圣女果，卷心菜打碎，取2.5g加入8mL冰甲醇，冰水浴均质2min(6000rpm)；在4℃，10000×g下离心15min，取上清液，使用甲醇/水(1:1,v/v)稀释500倍。取稀释后的溶液到离心管中，加入内标工作液，并按照1:3(v/v)加入甲醇/异丙醇(1:1,v/v)。漩涡震荡1min，在4℃，18000×g下离心5min后取上清液200μL。使用CentriVap真空浓缩离心机干燥挥干。再用等体积乙腈/水(1:2,v/v)溶解挥干物。在4℃，18000×g下离心5min后取上清液，得到待测样品。
(2)样品检测
应用实施例1步骤(2)进行测试，每个样品设置5个重复样品，每个重复样品测定3次；将待检测样品的待测组分和内标的峰面积比值带入实施例1绘制的标准曲线进行计算，可得到动物源和植物源基质中有机酸的含量；结果见表6；
表6四种样品的有机酸含量(mg/kg)
Figure BDA0003863949190000102
Figure BDA0003863949190000111
实施例4食品中有机酸测定
(1)样品制备
动物源样品：分别取4g北极贝贝柱，牛肉加入4mL超纯水和8mL冰甲醇，冰水浴均质2min(8000rpm)，加入13mL的甲基叔丁基醚，漩涡震荡2min；在4℃，11000×g下离心10min，取下层液体，甲醇/水(1:1,v/v)稀释50倍。取稀释后的溶液到离心管中，加入内标工作液，并按照1:4(v/v)加入甲醇/异丙醇(1:1,v/v)；漩涡震荡1min，在6℃，15000×g下离心12min后取上清液100μL。使用CentriVap真空浓缩离心机干燥挥干。用等体积乙腈/水(1:3,v/v)溶解挥干物。在6℃，15000×g下离心12min后取上清液，得到待测样品。
植物源样品：将猕猴桃，苹果打碎，取4g加入10mL冰甲醇，冰水浴均质2min(8000rpm)；在4℃，11000×g下离心10min，取上清液，使用甲醇/水(1:1,v/v)稀释1000倍。取稀释后的溶液到离心管中，加入内标工作液，并按照1:4(v/v)加入甲醇/异丙醇(1:1,v/v)。漩涡震荡1min，在6℃，15000×g下离心12min后取上清液100μL。使用CentriVap真空浓缩离心机干燥挥干。用等体积乙腈/水(1:3,v/v)溶解挥干物。在6℃，15000×g下离心12min后取上清液，得到待测样品。
(2)样品检测
应用实施例1步骤(2)进行测试，每个浓度样品进行4次平行测定试验。根据有机酸混合标准工作液中的有机酸组分浓度与组分和内标的峰面积比值做线性回归，得到有机酸标准曲线；将待检测样品的待测组分和内标的峰面积比值带入标准曲线进行计算，可得到动物源和植物源基质中有机酸的含量。本发明测定的样品中有机酸含量见表7。
表7食品中有机酸含量(mg/kg)
Figure BDA0003863949190000121
对比例1
调整实施例1中的色谱柱为安捷伦InfinityLabPoroshell 120 HILIC-Z(2.1mm×150mm,2.7μm)色谱柱，其他和实施例1保持一致，进行测试；
结果发现：在所选取的22种有机酸，大部分化合物有保留但峰形较差，尤其是顺乌头酸和异柠檬酸，存在明显的色谱峰拖尾和分叉，并且大部分有机酸基本在1min和3-4min集中洗脱，无法实现有效分离，详细结果如图2所示。
对比例2
调整实施例1中的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1×150mm，1.7μm粒径，Waters)，其他和实施例1保持一致，进行测试；
结果发现：在所选取的22种有机酸，大部分化合物有保留但峰形较差，如丙二酸和莽草酸；重要有机酸同分异构体柠檬酸和异柠檬酸无法分离，结果见图3。
对比例3
调整实施例1中的流动相为碳酸铵，其他和实施例1保持一致，进行测试；
结果发现：在所选取的22种有机酸，大部分化合物能被检测，但是分离效果和峰形较差，均在0.6-1.1min内洗脱出来。结果见图4。
对比例4
调整实施例1中的流动相中的碳酸氢铵浓度为10mmol/L，其他和实施例1保持一致，进行测试；结果发现，部分化合物洗脱效果较差，有明显的拖尾；色谱峰后移，部分有机酸3min后洗脱出来；部分有机酸信号强度较低，如尿酸；结果见图5。
以上所述，实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时检测食物中22种有机酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)配制由22种有机酸和内标物形成的一系列浓度的混合标准液；
(2)待测食物样品前处理；
(3)采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪测定步骤(1)中的一系列浓度的混合标准液和步骤(2)前处理后的待测液；根据有机酸混合标准工作液中的有机酸组分浓度与有机酸组分和内标物的峰面积比值构建定量关系模型；并依据此定量关系模型和待测液峰面积比值，计算待测食物样品中22种有机酸的含量；所述超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪使用的色谱柱为Waters Torus DEA 2.1mm×100mm，1.7μm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述22种有机酸包括水杨酸、富马酸、顺丁烯二酸、丙酮酸、丙二酸、己二酸、莽草酸、丁二酸、α-酮戊二酸、顺式乌头酸、苹果酸、酒石酸、焦谷氨酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、草酰乙酸、草酸、尿酸、奎尼酸、柠檬酸、异柠檬酸、乳酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标物为1,4-13C2-丁二酸，浓度50-500ng/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测食物样品为动物源样品时的前处理为：取动物源样品加入超纯水和冰甲醇，冰水浴均质，然后加入甲基叔丁基醚，漩涡震荡，离心取下层液体，使用甲醇/水将取得的下层液体稀释，置于离心管中；加入内标物标准液，再加入甲醇/异丙醇溶液；漩涡震荡，离心后取上清液；将上清液浓缩，再加入等体积的乙腈/水复溶，漩涡震荡，超声，离心取上清液，即得动物源样品待测液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测食物样品为植物源样品时的前处理为：取粉碎的植物源样品，加入冰甲醇，冰水浴均质，离心取上清液，使用甲醇/水将取得的上清液体稀释，置于离心管中，加入内标物标准液，然后再加入甲醇/异丙醇，漩涡震荡，离心后取上清液；将上清液浓缩，然后再加入等体积的乙腈/水复溶；漩涡震荡，超声，离心取上清，即得植物源样品待测液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的检测条件为：进样量：20～25μL；柱温：25℃；流动相：A相为碳酸氢铵水溶液；B相为乙腈；洗脱流速：0.3～0.6mL/min；洗脱梯度：80％A相等度洗脱，自动进样器温度：10℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碳酸氢铵水溶液的浓度为40～60mmol/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述串联三重四极杆质谱仪的质谱采集条件：采用电喷雾电离源ESI；负离子模式进行检测；采集模式：多反应监测模式MRM；ESI源参数设置为：气帘气CUR：35psi；离子化温度TEM：600℃；喷雾气GS1：60psi；辅助加热气GS2：60psi；碰撞气：Medium；离子化电压：-4500V。
9.由权利要求1～8任一项所述的方法在食品检测领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述食品包括畜禽、水产、蔬果中的一种或多种。
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