CN114609294B - 一种食品中重要呈滋味物质同时测定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食品中重要呈滋味物质同时测定的方法，属于食品检测领域。本发明基于特定的Agilent InfinityLab Poroshell 120HILIC‑Z(2.1mm×150mm,2.7μm)色谱柱和特定的正、负离子模式流动相结合，采用高效液相色谱质谱联用技术，实现了同时检测更多的滋味物质，为食品中重要呈滋味物质的研究提供重要工具。而且，本发明将四大类(有机酸、核苷酸及其代谢物、有机碱、氨基酸)51种组分进行同时检测，实现了食品中51种重要呈滋味物质同步快速检测，节约了检测样品及相关使用试剂的消耗，有效提高了检测工作效率，能够直观的反应不同食品中呈滋味物质的含量差异。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品中重要呈滋味物质同时测定的方法，属于食品检测领域。
背景技术
食品的色香味，是消费者选择一个产品的重要指标，其中味觉对食品品质及选择偏好尤为重要。味觉是由滋味物质和舌头上、味蕾上的受体之间的相互作用所影响的。滋味物质可以溶解在唾液或食物溶液中，刺激味蕾产生味觉化学物质。不同的食品原料、加工工艺、食用方式等，都会对食品最终呈现给消费者的滋味产生影响，而对不同阶段、不同产品的呈滋味物质进行检测，不仅能够监测产品品质，同时为产品研发与升级提供可靠依据。
滋味物质包括游离氨基酸、核苷酸及其代谢物、有机碱(甜菜碱、氧化三甲胺)、有机酸等。食物丰富而独特的味道通常是由多种滋味化合物共同作用而产生的。味觉特征的变化可以通过对给定食物的全部关键呈滋味物质进行高精度、高通量质谱分析来监测。因此，需要测定食品中的多种呈滋味物质，以确定其主要呈味化合物。
虽然食品中呈滋味物质种类繁多，但都具有特定的水溶性和较高的沸点。因此，常采用液相色谱结合多种检测器进行定量分析。目前，食品中呈滋味物质的检测方法大多只能同时检测一到两种物质，虽具有分离性好、灵敏度高、检测快速稳定的特点，但当食品基质复杂，主要呈滋味化合物种类较多时，采用单一物质的测定方法无法满足检测要求，而采用多种检测方法将大大增加检测样品及相关试剂的消耗量且所需检测时间较长。因此，迫切需要开发一种更高效的检测方法，实现对食品中多种呈滋味物质的同时测定。
发明内容
[技术问题]
目前，食品中呈滋味物质的检测方法大多只能同时检测一到两种物质；而采用多种检测方法检测多种物质，时间长且成本高。
[技术方案]
为了解决上述问题，本发明基于特定的Agilent InfinityLab Poroshell 120HILIC-Z(2.1mm×150mm,2.7μm)色谱柱和特定的正、负离子模式流动相结合，采用高效液相色谱质谱联用技术，实现了同时检测更多的滋味物质，为食品中重要呈滋味物质的研究提供重要工具。而且，本发明的方法更为快捷，高效。
本发明的第一个目的是提供一种食品中重要呈滋味物质同时测定的方法，包括如下步骤：
(1)配置混合内标的工作液：
配制终浓度为50-400ng/mL的混合内标的工作液；
(2)样品前处理：
称取1-5g样品加入1-7mL的超纯水和1-8mL的冰甲醇，匀浆；再加入5-15mL的甲基叔丁基醚，漩涡震荡、离心，取下层液体，加入甲醇/异丙醇混合溶液，离心后取上清液，得到待挥干样品；将待挥干样品干燥后用与待挥干样品相同体积的混合内标的工作液重新溶解，离心后取上清液，得到待测呈滋味物质检测样品；
(3)进行测试：
采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z(2.1mm×150mm,2.7μm)色谱柱，通过高效液相色谱与三重四极杆质谱联用仪测定；其中，高效液相色谱的测试的条件为：
进样量：5μL；
采集模式：MRM；
柱温：40℃；
正离子模式流动相：A相为乙腈/水(20:80,v/v)0.02％乙酸+10mM乙酸铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.02％乙酸+10mM乙酸铵；即：A相是在乙腈/水(20:80,v/v)中加入乙酸和乙酸铵，使得乙酸的体积浓度为0.02％，乙酸铵的浓度为10mM；B相是在乙腈/水(90:10,v/v)加入乙酸和乙酸铵，使得乙酸的体积浓度为0.02％，乙酸铵的浓度为10mM；
负离子模式流动相：A相为乙腈/水(20:80,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸铵；即：A相是在乙腈/水(20:80,v/v)中加入氨水和乙酸铵，使得氨水的体积浓度为0.1％，碳酸铵的浓度为10mM；B相是在乙腈/水(90:10,v/v)加入氨水和乙酸铵，使得氨水的体积浓度为0.1％，碳酸铵的浓度为10mM；
洗脱流速：0.3mL/min；
洗脱梯度：0-1min：100％B；1-15min：100-30％B；15-17min：30％B；17-17.1min：30-100％B；17-25.4min：100％B；
(4)定量：
将测试结果得到的待测呈滋味物质检测样品中的待测组分峰面积和内标峰面积的比值带入标准曲线进行计算，得到待测呈滋味物质样品中呈滋味物质的含量。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述配置混合内标的工作液采用的溶剂为乙腈/水混合溶剂；乙腈和水的体积比为1：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述配置混合内标的工作液采用D3-丙氨酸(D3-Alanine)、D3-谷氨酸(D3-Glutamic acid)、D3-天冬氨酸(D3-Aspartic acid)、D3-次黄嘌呤(D3-Hypoxanthine)、D9-氧化三甲胺(D9-TMAO)、13C2-琥珀酸(13C2-succinic acid)、13C3-胞苷单磷酸(13C3-CMP)作为内标。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述匀浆是在4000-8000rpm的条件下匀浆1-2min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述漩涡震荡的时间为1-2min，漩涡震荡后的离心是在6000-10000g下离心5-15min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述加入甲醇/异丙醇混合溶液后的离心为在15000-25000g下离心1-5min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述下层液体和甲醇/异丙醇混合溶液的体积比为1：3。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述甲醇/异丙醇混合溶液中甲醇和异丙醇的体积比为2:3-3:2。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述重新溶解之后的离心为在15000-25000g下离心1-5min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述干燥是采用Scan Speed 40离心浓缩干燥仪干燥。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中质谱采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式和负离子模式进行检测；ESI源参数设置为：
气帘气(CUR)：35psi；
离子化温度(TEM)：600℃；
雾化气(GS1)：60psi；
辅助加热气(GS2)：60psi；
碰撞气(CAD)：Medium；
在正离子模式下，射入电压(EP)：10V，喷雾电压(IS)：5500V；
在负离子模式下，射入电压(EP)：-10V，喷雾电压(IS)：-4500V。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中所述的标准曲线的构建方法包括如下步骤：
选用腺嘌呤(Ade)、腺嘌呤核苷(Ado)、腺苷单磷酸(AMP)、胞嘧啶(Cyt)、胞嘧啶核苷(Cyd)、胞苷单磷酸(CMP)、鸟嘌呤(Gua)、鸟嘌呤核苷(Guo)、鸟苷单磷酸(GMP)、次黄嘌呤(Hx)、肌苷(Ino)、肌苷单磷酸(IMP)、尿嘧啶(Ura)、尿嘧啶核苷(Urd)、尿苷单磷酸(UMP)、黄嘌呤(Xan)、黄嘌呤核苷(Xao)、水杨酸(Salicylic acid)、富马酸(Fumaric acid)、丙酮酸(Pyruvic acid)、莽草酸(Shikimic acid)、琥珀酸(Succinic acid)、顺式-乌头酸(Cis-Aconitic acid)、苹果酸(Malic acid)、焦谷氨酸(Pyroglutamic acid)、半乳糖醛酸(Galacturonic acid)、乳酸(Lactic acid)、氧化三甲胺(TMAO)、三甲胺(TMA)、甜菜碱(Betaine)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、丝氨酸(Ser)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、赖氨酸(Lys)、羟脯氨酸(Hyp)和牛磺酸(Tau)作为标准品，采用体积比为1：1的乙腈/水作为溶剂，分别配制浓度为0.10,0.50,1.00,10.00,25.00,50.00,100.00,200.00,500.00,700.00,1000.00,1200.00,1500.00,1700.00,2000.00,2500.00,3000.00μg/mL的标准品工作液；
采用D3-丙氨酸(D3-Alanine)、D3-谷氨酸(D3-Glutamic acid)、D3-天冬氨酸(D3-Aspartic acid)、D3-次黄嘌呤(D3-Hypoxanthine)、D9-氧化三甲胺(D9-TMAO)、13C2-琥珀酸(13C2-succinic acid)、13C3-胞苷单磷酸(13C3-CMP)作为内标，体积比为1：1的乙腈/水混合溶液作为溶剂，配制的标准曲线内标工作液中各内标终浓度为D3-丙氨酸(200μg/mL)、D3-谷氨酸(200μg/mL)、D3-天冬氨酸(400μg/mL)、D3-次黄嘌呤(100μg/mL)、D9-氧化三甲胺(50μg/mL)、13C2-琥珀酸(50μg/mL)、13C3-胞苷单磷酸(300μg/mL)；
将不同浓度的标准品工作液、标准曲线内标工作液和体积比为1：1的乙腈/水按照体积比1：1：998混合均匀，形成待测溶液；
将得到的不同标准品、不同浓度的待测溶液采用Agilent InfinityLabPoroshell 120 HILIC-Z(2.1mm×150mm,2.7μm)色谱柱，通过高效液相色谱与三重四极杆质谱联用仪测定；其中，高效液相色谱的测试的条件为：
进样量：5μL；
采集模式：MRM；
柱温：40℃；
正离子模式流动相：A相为乙腈/水(20:80,v/v)0.02％乙酸+10mM乙酸铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.02％乙酸+10mM乙酸铵；
负离子模式流动相：A相为乙腈/水(20:80,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸铵；
洗脱流速：0.3mL/min；
洗脱梯度：0-1min,100％B；1-15min,100-30％B；15-17min,30％B；17-17.1min,30-100％B；17-25.4min,100％B；
质谱采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式和负离子模式进行检测；ESI源参数设置为：
气帘气(CUR)：35psi；
离子化温度(TEM)：600℃；
雾化气(GS1)：60psi；
辅助加热气(GS2)：60psi；
碰撞气(CAD)：Medium；
在正离子模式下，射入电压(EP)：10V，喷雾电压(IS)：5500V；
在负离子模式下，射入电压(EP)：-10V，喷雾电压(IS)：-4500V；
根据工作液中标准品的浓度与待测呈滋味物质检测样品组分和内标峰面积的比值做线性回归，得到呈滋味物质标准曲线。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的标准曲线为：Y＝aX+b；其中，X＝待测组分峰面积/内标峰面积，Y＝待测呈滋味物质含量。
在本发明的一种实施方式中，所述的食品中重要呈滋味物质同时测定的方法可以同时检测51种重要呈滋味物质；所述的51种重要呈滋味物质包括腺嘌呤(Ade)、腺嘌呤核苷(Ado)、腺苷单磷酸(AMP)、胞嘧啶(Cyt)、胞嘧啶核苷(Cyd)、胞苷单磷酸(CMP)、鸟嘌呤(Gua)、鸟嘌呤核苷(Guo)、鸟苷单磷酸(GMP)、次黄嘌呤(Hx)、肌苷(Ino)、肌苷单磷酸(IMP)、尿嘧啶(Ura)、尿嘧啶核苷(Urd)、尿苷单磷酸(UMP)、黄嘌呤(Xan)、黄嘌呤核苷(Xao)、水杨酸(Salicylic acid)、富马酸(Fumaric acid)、丙酮酸(Pyruvic acid)、莽草酸(Shikimicacid)、琥珀酸(Succinic acid)、顺式-乌头酸(Cis-Aconitic acid)、苹果酸(Malicacid)、焦谷氨酸(Pyroglutamic acid)、半乳糖醛酸(Galacturonic acid)、乳酸(Lacticacid)、氧化三甲胺(TMAO)、三甲胺(TMA)、甜菜碱(Betaine)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、丝氨酸(Ser)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、赖氨酸(Lys)、羟脯氨酸(Hyp)和牛磺酸(Tau)。
在本发明的一种实施方式中，所述的食品中重要呈滋味物质同时测定的方法的检出限在＜0.1-100ng/mL，定量限在＜0.1-500ng/mL。
本发明的第二个目的是本发明所述的方法在食品检测领域的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的食品包括畜禽、水产、农产品。
[有益效果]
(1)本发明基于通过高效液相色谱(LC-30AD,日本岛津)三重四极杆质谱(5500Qtrap System,美国AB Sciex)联用技术进行定量分析。高效液相色谱质谱联用方法(UPLC-MS/MS)可同时实现上百种化合物定量分析，是药物开发、风味物质鉴定、污染物检测及蛋白质组学应用的理想选择。使用三重四极杆仪器的多反应监测(MRM)扫描，即选择一个或几个特定离子，经碰撞碎裂之后，在其子离子中选择出某种特定离子，只有同时满足母离子和子离子选定的一对离子时，才有信号产生；可以降低噪音，提高信噪比；在目标物的定量分析中具有高选择性、重复性好和高灵敏度的优势。
(2)本发明使用的色谱柱是Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z(2.1mm×150mm,2.7μm)亲水作用色谱柱，它的固定相使用结合到稳定杂化颗粒上的新型两性离子固定相，能够在高达80℃和高达PH 12的条件下保持稳定。与传统的反向色谱柱相比，Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z色谱柱能够保留和分离各种极性的分析物，这使得本发明中所选择的化合物都获得了良好的分离度和色谱峰形。HILIC色谱柱还可以提高电喷雾电离质谱(Electrospray-ionization-mass spectrometry,ESI-MS)检测的灵敏度。但目前Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z色谱柱只应用过分离糖化合物和检测生长培养基的养分(葡萄糖及少量氨基酸)及代谢废物方面的研究。本发明使用Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z色谱柱测定食品中重要呈滋味化合物，且所检测到的化合物种类及数量较多，实现了将Agilent InfinityLab Poroshell 120HILIC-Z色谱柱首次应用于检测食品中重要呈滋味化合物的应用创新。为食品中呈滋味物质的定量分析提供了重要的检测工具。
(3)本发明将四大类(有机酸、核苷酸及其代谢物、有机碱、氨基酸)51种组分进行同时检测，实现了食品中51种重要呈滋味物质同步快速检测，节约了检测样品及相关使用试剂的消耗，有效提高了检测工作效率，能够直观的反应不同食品中呈滋味物质的含量差异。
(4)本发明的方法在食品中呈滋味物质的定量分析中具有良好的应用前景，可为食品的加工利用提供有价值的数据参考。
附图说明
图1是实施例1得到的正离子模式下的标准品色谱图。
图2是实施例1得到的负离子模式下的标准品色谱图。
图3为对比例1的测试结果。
图4为对比例2的测试结果。
图5为对比例3的测试结果。
图6为对比例4的测试结果。
图7为对比例5的测试结果。
图8为对比例6的测试结果。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1标准曲线的构建
标准曲线的构建方法，包括如下步骤：
(1)标准品工作液的制备：
选用腺嘌呤(Ade)、腺嘌呤核苷(Ado)、腺苷单磷酸(AMP)、胞嘧啶(Cyt)、胞嘧啶核苷(Cyd)、胞苷单磷酸(CMP)、鸟嘌呤(Gua)、鸟嘌呤核苷(Guo)、鸟苷单磷酸(GMP)、次黄嘌呤(Hx)、肌苷(Ino)、肌苷单磷酸(IMP)、尿嘧啶(Ura)、尿嘧啶核苷(Urd)、尿苷单磷酸(UMP)、黄嘌呤(Xan)、黄嘌呤核苷(Xao)、水杨酸(Salicylic acid)、富马酸(Fumaric acid)、丙酮酸(Pyruvic acid)、莽草酸(Shikimic acid)、琥珀酸(Succinic acid)、顺式-乌头酸(Cis-Aconitic acid)、苹果酸(Malic acid)、焦谷氨酸(Pyroglutamic acid)、半乳糖醛酸(Galacturonic acid)、乳酸(Lactic acid)、氧化三甲胺(TMAO)、三甲胺(TMA)、甜菜碱(Betaine)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、丝氨酸(Ser)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、赖氨酸(Lys)、羟脯氨酸(Hyp)和牛磺酸(Tau)作为标准品，采用体积比为1：1的乙腈/水作为溶剂，分别配制浓度为0.10,0.50,1.00,10.00,25.00,50.00,100.00,200.00,500.00,700.00,1000.00,1200.00,1500.00,1700.00,2000.00,2500.00,3000.00μg/mL的标准品工作液；
(2)混合内标的工作液的制备：
采用D3-丙氨酸(D3-Alanine)、D3-谷氨酸(D3-Glutamic acid)、D3-天冬氨酸(D3-Aspartic acid)、D3-次黄嘌呤(D3-Hypoxanthine)、D9-氧化三甲胺(D9-TMAO)、13C2-琥珀酸(13C2-succinic acid)、13C3-胞苷单磷酸(13C3-CMP)作为内标，体积比为1：1的乙腈/水混合溶液作为溶剂，配制的标准曲线内标工作液中各内标终浓度为D3-丙氨酸(200μg/mL)、D3-谷氨酸(200μg/mL)、D3-天冬氨酸(400μg/mL)、D3-次黄嘌呤(100μg/mL)、D9-氧化三甲胺(50μg/mL)、13C2-琥珀酸(50μg/mL)、13C3-胞苷单磷酸(300μg/mL)；
(3)待测溶液的制备：
将不同浓度的标准品工作液、标准曲线内标工作液和体积比为1：1的乙腈/水按照体积比1：1：998混合均匀，形成待测溶液；
(4)进行检测：
将得到的不同标准品、不同浓度的待测溶液采用Agilent InfinityLabPoroshell 120 HILIC-Z(2.1mm×150mm,2.7μm)色谱柱，通过高效液相色谱与三重四极杆质谱联用仪测定；其中，高效液相色谱的测试的条件为：
进样量：5μL；
采集模式：MRM；
柱温：40℃；
正离子模式流动相：A相为乙腈/水(20:80,v/v)0.02％乙酸+10mM乙酸铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.02％乙酸+10mM乙酸铵；
负离子模式流动相：A相为乙腈/水(20:80,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸铵；
洗脱流速：0.3mL/min；
洗脱梯度：0-1min,100％B；1-15min,100-30％B；15-17min,30％B；17-17.1min,30-100％B；17-25.4min,100％B；
质谱采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式和负离子模式进行检测；ESI源参数设置为：
气帘气(CUR)：35psi；
离子化温度(TEM)：600℃；
雾化气(GS1)：60psi；
辅助加热气(GS2)：60psi；
碰撞气(CAD)：Medium；
在正离子模式下，射入电压(EP)：10V，喷雾电压(IS)：5500V；
在负离子模式下，射入电压(EP)：-10V，喷雾电压(IS)：-4500V；
(5)构建标准曲线：
根据工作液中标准品的浓度与待测呈滋味物质检测样品组分和内标峰面积的比值做线性回归，得到呈滋味物质标准曲线，具体见表1：
表1化合物保留时间及标准曲线方程
测试的正离子模式色谱图见图1，负离子模式色谱图见图2；从图1和图2可以看出：各物质在保留时间上都有相应峰形良好的色谱峰，使用校准曲线通过线性回归分析线性范围，所有分析物的相关系数(R2均大于0.99)。51种组分的检出限在＜0.1-100ng/mL，定量限在＜0.1-500ng/mL。
实施例2回收率和精密度的测试
(1)混合内标的工作液的制备：
采用D3-丙氨酸(D3-Alanine)、D3-谷氨酸(D3-Glutamic acid)、D3-天冬氨酸(D3-Aspartic acid)、D3-次黄嘌呤(D3-Hypoxanthine)、D9-氧化三甲胺(D9-TMAO)、13C2-琥珀酸(13C2-succinic acid)、13C3-胞苷单磷酸(13C3-CMP)作为内标，体积比为1：1的乙腈/水混合溶液作为溶剂，配制的混合内标工作液中各内标终浓度为D3-丙氨酸(200ng/mL)、D3-谷氨酸(200ng/mL)、D3-天冬氨酸(400ng/mL)、D3-次黄嘌呤(100ng/mL)、D9-氧化三甲胺(50ng/mL)、13C2-琥珀酸(50ng/mL)、13C3-胞苷单磷酸(300ng/mL)；
(2)样品前处理：
分别称取2g黄鱼和北极甜虾样品，加入2.5mL超纯水和3mL冰甲醇，在6000rpm的条件下匀浆1min；再加入10mL的甲基叔丁基醚，漩涡震荡2min，在8000g下离心10min后，取下层液体10μL，加入99990μL体积比为1：1的甲醇-水溶液稀释10000倍，然后取100μL稀释后的溶液，加入50μL体积比为1：1的甲醇-水溶液，再分别添加100μL浓度级别水平分别为超低、低、中、高浓度的标准溶液。
按照1:3(v/v)加入甲醇/异丙醇(1:1,v/v)，在20000g下离心2min后取250μL上清液，得到待挥干样品；
取所述待挥干样品采用Scan Speed 40离心浓缩干燥仪干燥后用与待挥干样品相同体积的混合内标工作液重新溶解，在20000g下离心2min后取上清液，得到待测呈滋味物质检测样品；
各化合物在分别添加超低、低、中、高浓度水平的混合标准溶液的待测呈滋味物质检测样品中的终浓度见表2。
表2分别添加超低、低、中、高浓度水平的混合标准溶液的待测呈滋味物质检测样品中各化合物的浓度(ng/mL)
/>
/>
(3)按照实施例1步骤(4)进行测试，每个浓度样品进行3次平行测定试验，来验证食品中重要呈滋味物质同时测定方法的回收率和精密度，通过以下公式计算回收率：
回收率(％)＝(加入标准溶液的样品中目标化合物含量-空白样品中目标化合物含量)/样品中添加的标准溶液浓度×100
在超低、低、中、高四个浓度水平下对黄鱼和北极甜虾样品中51种呈滋味物质的回收率及RSD测定结果见表3，其中每个样品平行测定三次，结果取均值。
表3两种样品中化合物回收率及RSD数据
/>
从表3可以看出：在4个浓度下，大多数化合物的回收率在60％-130％之间，RSD均低于15％。其中，鸟嘌呤、三甲胺和腺苷单磷酸的加标回收率均较低，为42.46％-58.39％，RSD≤11.64％。两种样品中大部分化合物的加标回收率相似。但两种样品中有少量化合物存在差异，如鸟嘌呤核苷、腺苷单磷酸和乳酸。一方面，核苷类化合物如鸟嘌呤和肌苷容易降解，这可能是由于样品测定前在-30℃保存时发生降解所致。因此，样品中的一些化合物在储存过程中的不稳定性应该被考虑。另一方面原因可能是，这些化合物可能比其他化合物更容易受到样品基质的干扰。因此，在建立检测方法时，应考虑尽量减少样品基质对待检测化合物的干扰。
实施例3
一种食品中重要呈滋味物质同时测定的方法，包括如下步骤：
(1)混合内标的工作液的制备：
采用D3-丙氨酸(D3-Alanine)、D3-谷氨酸(D3-Glutamic acid)、D3-天冬氨酸(D3-Aspartic acid)、D3-次黄嘌呤(D3-Hypoxanthine)、D9-氧化三甲胺(D9-TMAO)、13C2-琥珀酸(13C2-succinic acid)、13C3-胞苷单磷酸(13C3-CMP)作为内标，体积比为1：1的乙腈/水混合溶液作为溶剂，配制的混合内标工作液中各内标终浓度为D3-丙氨酸(200ng/mL)、D3-谷氨酸(200ng/mL)、D3-天冬氨酸(400ng/mL)、D3-次黄嘌呤(100ng/mL)、D9-氧化三甲胺(50ng/mL)、13C2-琥珀酸(50ng/mL)、13C3-胞苷单磷酸(300ng/mL)；
(2)样品前处理：
分别称取2g羊肉、牛肉、猪肉、鸡腿肉、鸭腿肉、鹅腿肉样品加入2.5mL超纯水和3mL冰甲醇，在6000rpm的条件下匀浆1min；再加入10mL的甲基叔丁基醚，漩涡震荡2min，在8000g下离心10min后，取下层液体，按照1:3(v/v)加入甲醇/异丙醇(1:1,v/v)，在20000g下离心2min后取250μL上清液，得到待挥干样品；
取所述待挥干样品采用Scan Speed 40离心浓缩干燥仪干燥后用与待挥干样品相同体积的混合内标工作液重新溶解，在20000g下离心2min后取上清液，得到待测呈滋味物质检测样品；
(3)进行检测：
将待测呈滋味物质检测样品采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z(2.1mm×150mm,2.7μm)色谱柱，通过高效液相色谱与三重四极杆质谱联用仪测定；其中，高效液相色谱的测试的条件为：
进样量：5μL；
采集模式：MRM；
柱温：40℃；
正离子模式流动相：A相为乙腈/水(20:80,v/v)0.02％乙酸+10mM乙酸铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.02％乙酸+10mM乙酸铵；
负离子模式流动相：A相为乙腈/水(20:80,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸铵；
洗脱流速：0.3mL/min；
洗脱梯度：0-1min,100％B；1-15min,100-30％B；15-17min,30％B；17-17.1min,30-100％B；17-25.4min,100％B；
质谱采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式和负离子模式进行检测；ESI源参数设置为：
气帘气(CUR)：35psi；
离子化温度(TEM)：600℃；
雾化气(GS1)：60psi；
辅助加热气(GS2)：60psi；
碰撞气(CAD)：Medium；
在正离子模式下，射入电压(EP)：10V，喷雾电压(IS)：5500V；
在负离子模式下，射入电压(EP)：-10V，喷雾电压(IS)：-4500V；
(4)定量：
将测试结果得到的待测呈滋味物质检测样品中的待测组分峰面积和内标峰面积的比值带入实施例1的标准曲线进行计算，得到待测呈滋味物质样品中呈滋味物质的含量，具体如下表4：
表4六种样品中51种呈滋味物质含量(μg/g)
/>
nd.未检出
对比例1
调整实施例1中的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1×150mm，1.7μm粒径，Waters)，其他和实施例1保持一致，进行测试；
结果发现：在所选取的51种待测呈滋味化合物中，大部分化合物有保留但峰形较差。部分化合物没有保留如色氨酸、酪氨酸、尿嘧啶核苷、鸟嘌呤、苹果酸、丙酮酸、半乳糖醛酸等。且部分化合物的响应值明显降低如胞嘧啶、腺嘌呤核苷、尿嘧啶等。负离子模式中5’-核苷单磷酸有保留，但信号极低且峰形很差。结果见图3。
对比例2
调整实施例1中的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1×150mm，1.7μm粒径，Waters)，其他和实施例1保持一致，进行测试；
结果发现：大多数化合物提供了合理的保留，但一些游离氨基酸(苏氨酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸)和有机酸(顺乌头酸、苹果酸、半乳糖醛酸、乳酸等)没有保留。5’-核苷单磷酸信号极低且峰形很差。结果见图4。
对比例3
调整实施例1中的负离子模式流动相为乙腈/水(20:80,v/v)0.02％乙酸+10mM乙酸铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.02％乙酸+10mM乙酸铵，其他和实施例1保持一致，进行测试；
结果发现：化合物的响应值降低，且部分化合物的峰形很差，如琥珀酸、腺苷单磷酸、胞苷单磷酸、鸟苷单磷酸、肌苷单磷酸和尿苷单磷酸。其中琥珀酸的峰形有明显分叉。结果见图5。
对比例4
调整实施例1中的正和负离子模式流动相为乙腈/水(20:80,v/v)0.02％甲酸+10mM乙酸铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.02％甲酸+10mM乙酸铵，其他和实施例1保持一致，进行测试；
结果发现：结果发现：负离子模式中化合物的响应值普遍降低，且部分化合物的峰形很差，如琥珀酸、腺苷单磷酸、胞苷单磷酸、鸟苷单磷酸、肌苷单磷酸和尿苷单磷酸。其中琥珀酸的峰形有明显分叉。正离子模式中虽然有少部分化合物响应值升高，但大部分氨基酸的响应值明显降低。结果见图6。
对比例5
调整实施例1中的负离子模式流动相为乙腈/水(20:80,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸氢铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸氢铵，其他和实施例1保持一致，进行测试；
结果发现：负离子模式中，虽然五种核苷单磷酸的峰形都略有改善但响应值依然较低，琥珀酸和丙酮酸的峰形都有分叉，苹果酸的峰形拖尾严重。结果见图7。
对比例6
调整实施例1中的正离子模式流动相为乙腈/水(20:80,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸铵；B相为乙腈/水(90:10,v/v)0.1％氨水+10mM碳酸铵，其他和实施例1保持一致，进行测试；
结果发现：部分化合物的响应值降低，如精氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、黄嘌呤核苷、等，三甲胺、组氨酸的峰形很差且响应低。结果见图8。
本发明提供并验证了一种食品中重要呈滋味物质同时测定的方法。本发明方法的重复性、线性、精密度和回收率均符合要求。采用本发明建立的方法测定了6个不同食品样品中51种呈滋味物质的含量，大部分呈滋味化合物被检测到；通过含量差异可以看出物种差异。本发明建立的方法对食品中呈滋味物质的定量分析中具有良好的应用前景。
Claims (9)
1.一种食品中重要呈滋味物质同时测定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）配置混合内标的工作液：
配制终浓度为50-400 ng/mL的混合内标的工作液；
（2）样品前处理：
称取1-5 g样品加入1-7mL的超纯水和1-8mL的冰甲醇，匀浆；再加入5-15 mL的甲基叔丁基醚，漩涡震荡、离心，取下层液体，加入甲醇/异丙醇混合溶液，离心后取上清液，得到待挥干样品；将待挥干样品干燥后用与待挥干样品相同体积的混合内标的工作液重新溶解，离心后取上清液，得到待测呈滋味物质检测样品；
（3）进行测试：
采用Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱，通过高效液相色谱与三重四极杆质谱联用仪测定；
其中，色谱柱的规格为2.1 mm × 150 mm, 2.7 µm；
高效液相色谱的测试的条件为：
进样量：5 µL；
采集模式：MRM；
柱温：40 ℃；
正离子模式流动相：A相是在体积比为20：80的乙腈/水的混合溶剂中加入乙酸和乙酸铵，使得乙酸的体积浓度为0.02%，乙酸铵的浓度为10mM；B相是在体积比为90：10的乙腈/水的混合溶剂中加入乙酸和乙酸铵，使得乙酸的体积浓度为0.02%，乙酸铵的浓度为10mM；
负离子模式流动相：A相是在体积比为20：80的乙腈/水的混合溶剂中加入氨水和乙酸铵，使得氨水的体积浓度为0.1%，碳酸铵的浓度为10mM；B相是在体积比为90：10的乙腈/水的混合溶剂中加入氨水和乙酸铵，使得氨水的体积浓度为0.1%，碳酸铵的浓度为10mM；
洗脱流速：0.3 mL/min；
洗脱梯度：0-1min：100%B；1-15min：100-30%B；15-17min：30%B；17-17.1min：30-100%B；17-25.4min：100%B；
（4）定量：
将测试结果得到的待测呈滋味物质检测样品中的待测组分峰面积和内标峰面积的比值带入标准曲线进行计算，得到待测呈滋味物质样品中呈滋味物质的含量；
其中，所述的食品中重要呈滋味物质同时测定的方法同时检测51种重要呈滋味物质；所述的51种重要呈滋味物质包括腺嘌呤（Ade）、腺嘌呤核苷（Ado）、腺苷单磷酸（AMP）、胞嘧啶（Cyt）、胞嘧啶核苷（Cyd）、胞苷单磷酸（CMP）、鸟嘌呤（Gua）、鸟嘌呤核苷（Guo）、鸟苷单磷酸（GMP）、次黄嘌呤（Hx）、肌苷（Ino）、肌苷单磷酸（IMP）、尿嘧啶（Ura）、尿嘧啶核苷（Urd）、尿苷单磷酸（UMP）、黄嘌呤（Xan）、黄嘌呤核苷（Xao）、水杨酸（Salicylic acid）、富马酸（Fumaric acid）、丙酮酸（Pyruvic acid）、莽草酸（Shikimic acid）、琥珀酸（Succinicacid）、顺式-乌头酸（Cis-Aconitic acid）、苹果酸（Malic acid）、焦谷氨酸（Pyroglutamicacid）、半乳糖醛酸（Galacturonic acid）、乳酸（Lactic acid）、氧化三甲胺（TMAO）、三甲胺（TMA）、甜菜碱（Betaine）、脯氨酸（Pro）、苏氨酸（Thr）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、赖氨酸（Lys）、羟脯氨酸（Hyp）和牛磺酸（Tau）。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述配置混合内标的工作液采用D3-丙氨酸（D3-Alanine）、D3-谷氨酸（D3-Glutamic acid）、D3-天冬氨酸（D3-Asparticacid）、D3-次黄嘌呤（D3-Hypoxanthine)、D9-氧化三甲胺（D9-TMAO）、13C2-琥珀酸（13C2-succinic acid）、13C3-胞苷单磷酸（13C3-CMP）作为内标。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中质谱采用电喷雾电离源（ESI）；正离子模式和负离子模式进行检测；ESI源参数设置为：
气帘气（CUR）：35 psi；
离子化温度（TEM）：600℃；
雾化气（GS1）：60 psi；
辅助加热气（GS2）：60 psi；
碰撞气（CAD）：Medium；
在正离子模式下，射入电压（EP）：10 V，喷雾电压（IS）：5500V；
在负离子模式下，射入电压（EP）：- 10V，喷雾电压（IS）：- 4500V。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述配置混合内标的工作液采用的溶剂为乙腈/水混合溶剂；乙腈和水的体积比为1：1。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述匀浆是在4000-8000 rpm的条件下匀浆1-2 min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述下层液体和甲醇/异丙醇混合溶液的体积比为1：3。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述甲醇/异丙醇混合溶液中甲醇和异丙醇的体积比为2:3-3:2。
8.权利要求1-7任一项所述的方法在食品检测领域的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的食品包括畜禽、水产、农产品。
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