CN117451903A - 一种同时检测果酒中14种有机酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测果酒中14种有机酸的方法，属于食品检测技术领域。本发明同时检测果酒中14种有机酸的方法具体包括：将果酒加水稀释定容，并调pH值至9~10，得样液；然后将样液上样到活化好的MAX固相萃取柱，依次用水和甲醇淋洗，弃去流出液，再用甲酸甲醇洗脱，收集洗脱液吹干，复溶，过膜，即得待测样，采用UPLC‑MS/MS进行测定，并依据标准曲线模型，计算得到待测样中14种有机酸含量。该方法是首次在果酒中测出丙酮酸、a‑酮戊二酸、丙二酸、水杨酸等物质；并且线性良好，且方法的灵敏度、稳定性及重复性好，适用于果酒种14种有机酸的准确测定，为果酒生产加工和风味控制提供必要的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时检测果酒中14种有机酸的方法，属于食品检测技术领域。
背景技术
有机酸是一类含有羧基、磺酸基及亚磺酸基等基团的酸性有机化合物（不包括氨基酸），广泛存在，种类繁多；并且有机酸还有助于增加食品的感官特性和健康特性，对食品的品质控制起到重要作用。
近年来提倡低度酒代替高度酒，饮用果酒已逐渐成为一种趋势。果酒中有机酸对果酒的口感、风味、观感和品质有重要的影响；果酒的风味是衡量果酒品质的一个重要指标，适量的有机酸对果酒的风味有着重要的影响。有机酸可加速多糖的转化和果胶物质的分解，促进果酒的老熟和澄清，有机酸含量过高会使酒口感生涩，过低会使酒平淡乏味。因此果酒中有机酸含量的测定及分析对果酒的研究具有重要意义。
目前有机酸的检测方法有很多，比如离子色谱法和离子色谱质谱法、气相色谱法和气相色谱质谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法，其中气相色谱法需要进行衍生化，衍生化试剂毒性危险性较高，操作繁琐，重现性较差；液相色谱法和离子色谱法分析法，多种有机酸会出现共洗脱现象，不能达到良好分离，易受基质干扰导致定性定量不准确；HPLC-MS/MS方法具有基质干扰少，方法灵敏度高的特点，综合运用保留时间、母离子、子离子和多反应监测模式确保目标分析物定性及定量结果的准确，是目前公认的高效检测技术。
现有技术公开了同时测定酒类产品草酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、奎尼酸、乌头酸和乳酸10种有机酸类化合物的离子色谱-串联质谱分析方法（穆瑛琦等.“离子色谱-串联质谱法检测果酒产品中10种有机酸”，色谱40.12（2022）：8），但该方法未对果酒中莽草酸，丙酮酸，a-酮戊二酸，丙二酸，己二酸，苯甲酸，水杨酸等有机酸的检测方法作出规定，且该方法单针分析时间为35分钟，检测时间较长，检测效率较低，部分物质的峰形明显拖尾。
莽草酸、丙酮酸、a-酮戊二酸、丙二酸、苯甲酸、水杨酸等在果酒中少量存在含量很低，极难检出，现有的方法多采用高效液相色谱法测定果酒中这几种物质，但由于液相灵敏度低，杂质干扰较多，在果酒中几乎从未检出这几种物质。丙酮酸、a-酮戊二酸在液质上响应较低，检测难度较大，且很难实现酒石酸、苹果酸，柠檬酸、丙二酸、己二酸、奎宁酸、水杨酸、a-酮戊二酸，莽草酸、丙酮酸、苯甲酸、富马酸、乳酸、琥珀酸14种有机酸的有效分离。
因此，如何提供一种选择性强、灵敏度高、可以准确同时测定果酒中酒石酸、苹果酸，柠檬酸、丙二酸、己二酸、奎宁酸、水杨酸、a-酮戊二酸，莽草酸、丙酮酸、苯甲酸、富马酸、乳酸、琥珀酸14种有机酸的检测方法，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷与不足，本发明提供了一种同时检测果酒中14种有机酸的方法，该方法能够高效、准确的分离出果酒中的14种有机酸，实现同时对14种有机酸的定性以及定量检测，并且检测时间短、灵敏度高。
本发明的目的是提供一种同时检测果酒中14种有机酸的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）样品前处理
移取果酒加水稀释定容，并调pH值至9~10，得样液；然后将样液上样到活化好的Waters Osis MAX固相萃取柱，依次用水和甲醇淋洗，弃去流出液，再用甲酸甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液吹至近干，复溶，过膜，即得待测样；
（2）待测样品中14种有机酸含量测定
将步骤（1）获得的待测样采用UPLC-MS/MS进行测定，并依据标准曲线模型，计算得到待测样中14种有机酸含量；
所述UPLC-MS/MS的色谱柱条件为：Eclipse Plus RRHD C18：3.0*150mm，1.8μm；色谱柱温度为35℃；流速为0.5mL/min；进样量为10μL；流动相A为乙腈，流动相B为含有0.4%甲酸水；梯度洗脱：0~4min，100%B；4~10min，100%~40%B；10~12min，40%B；12.1~15.0，100%B。
所述UPLC-MS/MS的质谱条件：ESI离子源，负离子扫描（ESI-），结合动态多反应监测模式，离子化电压（IonSpray Voltage）:-4500V；气帘气（Curtain Gas）：275.80 k Pa（40psi）；碰撞气（Collision Gas）；62.05 k Pa（9psi）；雾化气（GS1）:379.22 k Pa（55psi）；离子源温度（Temperature）：550℃。
在一种实施方式中，所述14种有机酸为酒石酸、苹果酸，柠檬酸、丙二酸、己二酸、奎宁酸、水杨酸、a-酮戊二酸，莽草酸、丙酮酸、苯甲酸、富马酸、乳酸和琥珀酸。
在一种实施方式中，所述果酒包括杨梅酒，蓝莓酒，荔枝酒，猕猴桃酒，葡萄酒中的一种或多种的发酵酒或者配制酒。
在一种实施方式中，步骤（1）所述活化好的Waters Osis MAX固相萃取柱为依次采用水和甲醇活化的Waters Osis MAX固相萃取柱。
在一种实施方式中，步骤（1）所述甲酸甲醇水溶液为10%的甲酸甲醇水溶液；10%的甲酸甲醇水溶液配制过程：移取10mL甲酸，溶于40mL水中，转移到100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度配制而成。
在一种实施方式中，步骤（1）所述复溶是指采用体积分数为0.4%甲酸水进行复溶。
在一种实施方式中，步骤（1）所述过膜是指过0.22μm微孔滤膜。
本发明的有益效果：
（1）本发明首次利用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法对果酒中14种有机酸含量进行检测，将固相萃取柱净化与三重四极杆质谱的高选择性、高灵敏度监测能力及能够提供相对分子质量的优点结合起来，通过验证适用于果酒中14种有机酸（酒石酸、苹果酸，柠檬酸、丙二酸、己二酸、奎宁酸、水杨酸、a-酮戊二酸，莽草酸、丙酮酸、苯甲酸、富马酸、乳酸、琥珀酸）的分离和检测，不仅可以实现有机酸的分离，还可以进行定性确证，提高检测的灵敏度和准确性。
（2）本发明通过氨水调节待测样的pH值至9~10，固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法手段相结合，有效的解决了有机酸紫外吸收不明显，光谱图难以确证的问题，除去了果酒中干扰物质色素，糖类等物质，增加了检测灵敏度，实现了14种有机酸的分离及定性定量检测，大大缩短了有机酸的分析检测时间，提高了检测的效率和准确度；
（3）本发明提供的检测方法线性良好，且方法的灵敏度、稳定性及重复性好，适用于果酒种14种有机酸的准确测定，为果酒生产加工和风味控制提供必要的技术支持，该方法是首次在果酒中测出丙酮酸、a-酮戊二酸、丙二酸、水杨酸等物质。
附图说明
图1为本发明14种有机酸的提取离子色谱图；
图2为对比例1中三种不同色谱柱对14种有机酸的分离效果提取离子色谱图；
图3为对比例2中流速为0.4mL/min的提取离子色谱图；
图4为对比例3中不同类型固相萃取柱对14种有机酸的回收率影响数据图；
图5为对比例4中不同样液pH值对14种有机酸的回收率影响数据图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明实施例中涉及的标准品来源和配制：
苹果酸（99.0%），柠檬酸（98.0%），丙二酸（97.2%），己二酸（99.0%），奎宁酸（98.0%），
水杨酸（99.8%），a-酮戊二酸（95.7%）购自阿尔塔科技有限公司；莽草酸（98.8%），丙酮酸（98.5%），苯甲酸（99.9%）购自北京坛墨质检科技有限公司；富马酸（99.6%），乳酸（90.2%），琥珀酸（99.0%）购自曼哈格（上海）生物科技有限公司；酒石酸（98.0%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。分别称取己二酸，富马酸，水杨酸，苯甲酸标准品各100mg，甲醇定容至10mL，配制得10.0mg/mL的标准储备液；
分别称取酒石酸、苹果酸，柠檬酸、丙二酸、奎宁酸、a-酮戊二酸，莽草酸、丙酮酸、乳酸、琥珀酸标准品各100mg，水定容至10mL，配制得10.0mg/mL的标准储备液；
分别移取苯甲酸标准储备液2.0mL，a-酮戊二酸标准储备液3.0mL，水杨酸标准储备液0.1mL，苹果酸准储备液1.0mL、酒石酸标准储备液1.0mL，柠檬酸标准储备液1.0mL，丙二酸标准储备液1.0mL，奎宁酸标准储备液1.0mL，莽草酸标准储备液1.0mL、丙酮酸标准储备液1.0mL、乳酸标准储备液1.0mL、琥珀酸标准储备液1.0mL、己二酸标准储备液1.0mL、富马酸标准储备液1.0mL于20mL容量瓶中，水稀释并定容至刻度，配制得14种有机酸混合标准中间溶液（500μg/mL）；
标准工作溶液：用0.4%甲酸水将14种有机酸混合标准中间溶液逐级稀释成不同的浓度。
TRIPLE QUARD5500超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS），美国AB SCIEX公司；PH计，梅特勒托利多；氮吹仪，美国Organomation公司；Milli-Q超纯水机，密理博公司。
实施例1
一种同时检测果酒中14种有机酸的方法，包括如下步骤：
（1）样品前处理
准确移取蓝莓酒1.0mL，加水稀释至20mL，加氨水调pH至9~10，加水定容至50ml，得样液；
依次用5mL水，5mL甲醇活化Waters Osis MAX固相萃取柱；准确吸取3mL样液上样，5mL水，5mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去流出液，6mL 10%甲酸甲醇水溶液（移取10mL甲酸，溶于40mL水中，转移到100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度配制而成）洗脱，收集洗脱液于40℃水浴中氮气吹至近干，体积分数为0.4%甲酸水复溶并定容至3.0mL，过0.22μm微孔滤膜，滤液即为待测样；
（2）定量关系模型构建
将14种有机酸系列标准工作溶液，配置成一系列浓度的混合标准液（见表3），采用UPLC-MS/MS进行测定，以14种有机酸的质量浓度作为横坐标（x），以相对应的峰面积为纵坐标（y），构建定量关系模型，见表4；
结果表明，14种有机酸在考察的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.99；分别以3倍和10倍信噪比（S/N）确定方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），见表4；
（3）待测样中14种有机酸含量的测定
将步骤（1）获得的待测样采用UPLC-MS/MS进行测定，并依据步骤（2）构建的定量关系模型，计算得到待测样中14种有机酸含量；
其中，UPLC-MS/MS的液相色谱的参数为：Eclipse Plus C18 RRHD 色谱柱（3.0*150mm，1.8μm）；柱温35℃；流速为0.5 mL/min；流动相A：乙腈，流动相B：0.4%甲酸水，梯度洗脱程序见表1；
表1. 梯度洗脱程序
质谱条件：ESI离子源，负离子扫描，结合动态多反应监测模式，离子化电压（IonSpray Voltage）:-4500V；气帘气（Curtain Gas）：40 psi；碰撞气（Collision Gas）；9psi；离子源温度（Temperature）550℃；14种有机酸的保留时间、母离子、子离子及质谱参数见表2；
表2. 14种有机酸的保留时间及质谱参数
表3. 14种有机酸系列标准工作液浓度（ng/mL）
表4. 14种有机酸的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限
实施例2 回收率及精密度
参照实施例1的方法，在蓝莓酒中加入低、中、高3个添加水平的适量混合标准溶液，每个水平进行6次平行试验，进行回收率测定，结果见表5。
表5. 加标回收率检测结果
由表5可知，14种有机酸低、中、高3个添加水平的回收率为83.0%~115.7%，相对标准偏差为0.8%~7.9%。结果表明该方法的准确度和精密度良好，适用于果酒中14种有机酸的测定。
实施例3
参照实施例1的方法，对实际样品中蓝莓酒、猕猴桃酒、荔枝酒、杨梅酒、葡萄酒中14种有机酸的含量进行测定，结果见表6；
表6. 果酒中有机酸测定结果
注：“ND”表示未检测出。
对比例1
参照实施例1的方法，探究了不同色谱柱Agilent Eclipse Plus RRHD C18(3.0*150 mm，1.8μm)，Waters BEH C18(2.1*100 mm，1.7μm)和Waters Torus™ DEA (2.1*100mm,1.7μm)对含量为1000ng/mL的待测样品中14种有机酸的分离效果。
结果如图2所示，结果表明Waters Torus™ DEA出峰时间太早，所有物质均在1min左右出峰，Waters BEH C18出峰时间较快，丙酮酸、a-酮戊二酸、丙二酸、苹果酸、乳酸未能实现很好分离，且峰形不对称略有拖尾，Agilent Eclipse Plus C18能够有效的将14种有机酸进行有效分离，且各个物质在11分钟内均可出峰；因此选择色谱柱Agilent EclipsePlus RRHD C18(3.0*150mm，1.8μm)进行分离测定。
对比例2
参照实施例1的方法，探究了0.4mL/min，0.5mL/min，0.6mL/min三种流速下含量为1000ng/mL的待测样品中14种有机酸的出峰时间、峰形、仪器压力影响情况。
结果如图3所示：当流速为0.4mL/min时丙酮酸、a-酮戊二酸峰较宽，峰形较差，苹果酸略有拖尾，水杨酸出峰时间较晚未能在15min内出峰；当流速为0.6mL/min时仪器压力较高；而在流速为0.5 mL/min时，仪器压力以及出峰时间都比较合适，最终选择流速为0.5mL/min。
对比例3
参照实施例1的方法，探究了Waters Osis MAX固相萃取柱、Cleanert SAX固相萃取柱和CNW有机酸专用固相萃取柱进行前处理，对含量为1000ng/mL的待测样品中14种有机酸的回收率的影响，结果如图4所示：
由图4结果可知：Cleanert SAX 固相萃取柱对莽草酸的回收较差，CNW有机酸专用固相萃取柱对水杨酸和苯甲酸的回收率较差，最终选择Waters Osis MAX 固相萃取柱为本发明的净化柱。
对比例4
参照实施例1的方法，探究了固相萃取柱上柱前待测样品（含量为1000ng/mL）的pH值对14种有机酸回收率的影响，结果如图5所示：
由图5结果可知：在pH 6-10时，pH对各物质的回收率影响不是很大，但在pH为11时，奎宁酸、水杨酸和莽草酸的回收率下降较多，且在pH达到9~10时，固相萃取柱吸附色素的效果较好，故选择pH 9~10为样液的pH值。
以上所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明权利要求书所界定的保护范围之内。
Claims (5)
1. 一种同时检测果酒中14种有机酸的方法，其特征在于，所述14种有机酸为酒石酸、苹果酸，柠檬酸、丙二酸、己二酸、奎宁酸、水杨酸、a-酮戊二酸，莽草酸、丙酮酸、苯甲酸、富马酸、乳酸和琥珀酸；所述方法包括如下步骤：
（1）样品前处理
移取果酒加水稀释定容，并调pH值至9~10，得样液；然后将样液上样到活化好的WatersOsis MAX固相萃取柱，依次用水和甲醇淋洗，弃去流出液，再用甲酸甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液吹至近干，复溶，过膜，即得待测样；
（2）待测样品中14种有机酸含量测定
将步骤（1）获得的待测样采用UPLC-MS/MS进行测定，并依据标准曲线模型，计算得到待测样中14种有机酸含量；
所述UPLC-MS/MS的色谱柱条件为：Eclipse Plus RRHD C18：3.0*150mm，1.8μm；色谱柱温度为35℃；流速为0.5mL/min；进样量为10μL；流动相A为乙腈，流动相B为含有0.4%甲酸水；梯度洗脱：0~4min，100%B；4~10min，100%~40%B；10~12min，40%B；12.1~15.0，100%B；
所述UPLC-MS/MS的质谱条件：ESI离子源，负离子扫描ESI-，结合动态多反应监测模式，离子化电压IonSpray Voltage:-4500V；气帘气Curtain Gas：275.80 k Pa；碰撞气Collision Gas；62.05 k Pa；雾化气GS1:379.22 k Pa；离子源温度Temperature：550℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述果酒包括杨梅酒，蓝莓酒，荔枝酒，猕猴桃酒，葡萄酒中的一种或多种的发酵酒或者配制酒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述甲酸甲醇水溶液为10%甲酸甲醇水溶液；配制过程为：移取10mL甲酸，溶于40mL水中，转移到100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度配制而成。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述复溶是指采用0.4%甲酸水进行复溶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述过膜是指过0.22μm微孔滤膜。
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