CN112305105B - 一种李子中化学成分含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种李子中化学成分含量的测定方法，包括以下步骤：步骤1、标准溶液制备；步骤2、样品处理；步骤3、色谱条件；步骤4、数据统计分析及作图。本发明采用高效液相‑示差检测法同时测定不同地区下李子的苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖的含量，建立了一种李子样品处理简单、准确可靠，简便快捷、安全无污染的方法，为进一步筛选出优良品系、保持李子的独特性奠定基础。该方法具有线性关系良好，精密度、稳定性和重复性高，加样回收率较好的特点，适合推广应用。

Description

一种李子中化学成分含量的测定方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及一种李子中化学成分含量的测定方法。

背景技术

李子属蔷薇科李属植物，其果实圆润饱满，肉质剔透，甜酸适中，老少皆宜，经过20年来悉心栽培，初具规模。7～8月间成熟，色彩艳丽，李子味到偏酸，能促进胃消化酶和胃酸的分泌，并能促进胃肠蠕动，因而有改善食欲，促进消化的作用，尤其对胃酸缺乏、腹胀、便秘者有效。新鲜李肉中的丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷酰胺等氨基酸及多种营养成分，对于消肿利尿，对肝硬化有辅助治疗效果。“西藏李子”，由于地处高原，紫外线强烈，色泽偏紫红，深受当地消费者喜爱，为当地经济带来发展。是西藏自治区 具有代表性的水果之一。但是西藏自治区 的李子栽培种植混杂，需要加强对李子资源的发展和保护，并从中发现优秀种质，以利于李子的生产发展和优良品种的选育。目前对于李子的研究很多，比如李子酒酿造工艺，李子果汁的澄清实验，李子酸奶工艺研究，李子多酚及其抗氧化性研究，李子的保鲜和贮藏研究，但是利用高效液相法同时测定李子中苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖的方法鲜有报道。

现有技术中急需一种李子中化学成分含量的测定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种李子中化学成分含量的测定方法，采用高效液相-示差检测法同时测定不同地区下李子的苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖的含量，建立了一种李子样品处理简单、准确可靠，简便快捷、安全无污染的方法，为进一步筛选出优良品系、保持李子的独特性奠定基础。

其具体技术方案为：

一种李子中化学成分含量的测定方法，包括以下步骤：

步骤1、标准溶液制备

准确称取苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖各0.25g，用超纯水充分溶解定容于25mL容量瓶中，备用。

步骤2、样品处理

(1)原料：挑选成熟、无腐烂无虫蛀的李子。

(2)去核、破碎：把挑选的四种李子去核，使之破碎并且分别放到烧杯中，各精确称取20.00g分别置于干净的烧杯中，加入少量水到烧杯中，最后定容到25mL容量瓶中。

(3)离心：将样品溶液的置于离心管中、放到超高速离心机5804R进行离心，转速为12000/min，15min后取上清液。

(4)过滤、用0.22μm CMC水相滤头对收集好的上清液过滤到2ml自动进样瓶，备用。

步骤3、色谱条件

流动相中V(乙腈)∶V(水)＝77∶23，pH＝2.5，流速为0.3mL/min，柱温为22℃，检测器温度为30℃，一个样品周期60min。

步骤4、数据统计分析及作图

数据统计分析采用SPSS V17.0进行描述性统计分析、方差分析、降维-主成分分析；8 种混合标准品的色谱图和样品色谱图通过安捷伦工作站A 01 04C导出数据，截除0-8min，由GrapHpad 7.0作色谱图。

进一步，步骤2中所述样品为芝嘎村李子、百益超市布朗李、林芝农贸市场脱骨李、嘎玛农场李子。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明采用高效液相-示差检测法同时测定不同地区下李子的苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖的含量，建立了一种李子样品处理简单、准确可靠，简便快捷、安全无污染的方法，为进一步筛选出优良品系、保持李子的独特性奠定基础。该方法具有线性关系良好，精密度、稳定性和重复性高，加样回收率较好的特点，适合推广应用。

附图说明

图1标准品与样品的HPLC图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1.材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样品

“芝嘎村李子”、”百益超市布朗李”、“林芝农贸市场脱骨李”“嘎玛农场李子”样品于2020 年采集于林芝市巴宜区。

1.1.2仪器与耗材

1260高效液相色谱仪(G1362A示差检测器，工作站A 01 04C)美国安捷伦科技有限公司；EXPLORER电子天平；奥豪斯仪器(上海)有限公司；KC-100A超声波清洗机东菀市洁康超声波设备有限公司；超高速离心机5804R德国艾本德；SHZ-D(III)循环水真空泵杭州明远仪器有限公司；SPX-260智能生化培养箱浙江托普仪器有限公司；DPH＝9162 电热恒温培养箱上海一恒科学仪器有限公司；2ml自动进样瓶(9-425)、0.22μm CMC 水相滤头、022μm CMC水相滤膜浙江欧尔赛斯科技有限公司、pH计上海仪电科学仪器股份有限公司

1.1.3试剂

柠檬酸纯度99.7％、葡萄糖纯度99.4％均为德国奥格斯堡Dr.EhrenstorferGmbH；苹果酸纯度99.9％上海将来实业有限公司；蔗糖纯度99.8％、果糖纯度99.8％均为成都市联合化工试剂研究所；抗坏血酸(分析纯)纯度99％天津市致远化学试剂有限公司；纯净水杭州娃哈哈集团有限公司；硫酸(分析纯)纯度98.9％济南坤丰化工有限公司。乙腈色谱纯美国RiMedCO公司。

1.2方法

1.2.1标准溶液制备

准确称取苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖各0.25g，用超纯水充分溶解定容于25mL容量瓶中，备用。

1.2.2样品处理

1.2.2.1样品的处理

(1)原料：挑选成熟、无腐烂无虫蛀的李子。

(2)去核、破碎：把挑选的四种李子去核，使之破碎并且分别放到烧杯中，各精确称取20.00g分别置于干净的烧杯中，加入少量水到烧杯中，最后定容到25mL容量瓶中。

(3)离心：将样品溶液的置于离心管中、放到超高速离心机5804R进行离心，转速为12000/min，15min后取上清液。

(4)过滤、用0.22μm CMC水相滤头对收集好的上清液过滤到2ml自动进样瓶，备用。

1.2.3色谱条件

1.2.3.1流动性比例选择

根据色谱柱Platisi NH2，(5μm，250×4.6mm)说明书，比较不同体积比的流动相(V(乙腈)∶V(水)＝70∶30、75∶25、77∶23、80∶20)来测定混标和样品中苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖的分离情况。结果表明，水相比例越大，会造成部分色谱峰的重叠，还是出现拖尾现象；但是随着乙腈比例的增加苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖的分离度提高，相应的分析时间会延长。综合分析选择流动相中V(乙腈)∶V(水)＝77∶23。

1.2.3.2流动相pH的选择

当流动相的pH＝7、8、9、10时，苹果酸、维生素C不出峰，在酸性条件下出峰，并且酸性越强峰型越好，根据色谱柱Platisi NH2，(5μm，250×4.6mm)说明书，pH的适用范围在2～11内，参考文献(题目为高效液相法对青稞酒中有机酸、醇及糖含量的测定)为pH 2.5，在不损伤色谱柱的情况下确定pH2.5。

1.2.3.3流速的选择

用流速在0.1、0.3、0.5、1.0mL/min条件下苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖的分离情况，发现流速越大部分峰有重叠现象，但是流速在0.3mL/min以下能看到五种物质分离，但是分离也会延长，所以综合分析选择流速为0.3mL/min

1.2.3.4.色谱柱温度的选择

在22、25、28、30、35、℃条件下测定混标和样品中苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖的分析，发现随着温度的升高，五种物质分离度降低，兼顾分离度和保留时间，本实验采用色谱柱柱温为22℃。

最终色谱条件：流动相中V(乙腈)∶V(水)＝77∶23，pH＝2.5，流速为0.3mL/min，柱温为22℃，检测器温度为30℃，一个样品周期60min。

1.2.4数据统计分析及作图

数据统计分析采用SPSS V17.0进行描述性统计分析、方差分析、降维-主成分分析；8 种混合标准品的色谱图和样品色谱图通过安捷伦工作站A 01 04C导出数据，截除0-8min，由GrapHpad 7.0作色谱图。

2.方法学考察

2.1线性关系考察

取混合标准品溶液0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL、1.2mL，定容至10mL，既混合标准溶液的浓度为4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL不同质量浓度的标准品溶液。取不同质量浓度的标准溶液2μL进样，以酸糖的标准溶液质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，得到标准曲线，按信噪比3∶1确定检测限(参考高效液相色谱法对青稞酒中糖醇酸含量测定)，酸醇糖标准曲线结果和检出限如表1，由表1可知苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖的R＞0.999，表明5种测定物质的线性良好，线性范围较宽。

表1酸糖标准曲线

2.2混合标准品及样品色谱图

取苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖混合标样液及样品进样5μL，色谱条件按1.2.3最终确定方法：最终色谱条件：流动相中V(乙腈)∶V(水)＝77∶23，pH＝2.5，流速为0.3mL/min，柱温为22℃，检测器温度为30℃，一个样品周期60min。如图1。从图1 可知，5种标准品及样品的色谱图基本达到分离，峰形良好；李子的样品溶液中含有苹果酸、果糖、葡萄糖、蔗糖等4种物质，峰形良好且分离度好。

2.3精密度试验

取混合标准品溶液(2.2中的标液浓度)，按1.2.3节色谱条件连续进样10次(参考GB/T27417-2017合格评定化学分析方法确认和验证指南，其连续进样10次符合相应国标的进样量)，以5种物质的峰面积分别计算其平均值及相对标准偏差(relative standarddeviation， RSD)精密度实验结果如表2所示。从表2知这五种物质的RSD在0.25％～1.29％。

表2精密度实验结果

2.4稳定性试验

取相同地区李子样品，按1.2.2的样品溶液制备方法分别提取6份，放置0、2、4、8、12h后，分别进样5μL，以5种物质的峰面积分别计算其平均值及相对标准偏差(relativestandard deviation，RSD)，稳定性实验结果如表4，由表4可知苹果酸、果糖、葡萄糖、蔗糖的RSD在0.37％～1.1％之间，其RSD＜5％，表明供试青稞酒样溶液在室温条件下放置12 h稳定性较好。

表3稳定性实验结果

注：-表示未险出。

2.5重复性试验

取相同地区李子样品，按1.2.2的样品溶液制备方法分别提取6份，按1.2.3色谱条件分别进样5μL，以5种物质的峰面积分别计算其平均值及相对标准偏差(relativestandard deviation，RSD)，重复性实验结果如表4所示。由表4可知苹果酸、果糖、葡萄糖、蔗糖的RSD在0.37％～0.77％，其RSD＜5％，该方法重复性良好。

表4重复性实验结果

注：-表示未险出。

2.6加样回收率

取已知含量的李子样品溶液5份，按1∶1加入混合标准溶液按1.2.2项下的方法制备供试品溶液，按1.2.3项下的色谱条件进行测定，记录相应成分的色谱峰面积，计算回收率。在加样回收率实验中，苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖的平均回收率分别为103.65％、114.56％、101.87％、107.56％、95.63％，RSD％在0.86％～1.98％，其RSD％＜5％. 从表2可以看出，该法回收率较好。

表5回收率实验结果

2.7样品含量

据1.2.2李子处理方法和1.2.3色谱条件，分别对不同地区的李子样品的苹果酸、维生素 C、果糖、葡萄糖、蔗糖含量进行HPLC测定，每个样品重复测定3次，李子样品不同成分含量测定结果如表6，由表6可知，李子均未检出维生素C，若以苹果酸含量为考察指标，则不同地区李子含量由高到低依次为林芝农贸市场脱骨李＞芝嘎村李子＞百益超市布朗李＞嘎玛农场李子；若以总糖含量为考察指标，则林芝农贸市场脱骨李＞嘎玛农场李子＞芝嘎村李子＞百益超市布朗李。

表6样品含量

注：-表示未检出，a表示差异不显著。

3.结论与分析

不同地区李子的4种成分含量及总含量各不同，以李子苹果酸和以总糖含量为考察指标时，四种地区李子苹果酸含量和总糖含量排名进行比较，发现不同地区李子排名存在部分差异，表明地区李子质量存在优劣。四种地区的李子均未检出维生素C。该种方法可以检测不同地区李子的4种有效成分，为选育优质种打好基础。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种李子中化学成分含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、标准溶液制备

准确称取苹果酸、维生素C、果糖、葡萄糖、蔗糖各0.25g，用超纯水充分溶解定容于25mL容量瓶中，备用；

步骤2、样品处理

(1)样品：挑选成熟、无腐烂无虫蛀的李子；

(2)去核、破碎得到样品溶液：把挑选的四种李子去核，使之破碎并且分别放到烧杯中，各精确称取20.00g分别置于干净的烧杯中，加入水到烧杯中，最后定容到25mL容量瓶中；

(3)离心：将样品溶液置于离心管中、放到5804R超高速离心机进行离心，转速为12000rpm,15min后取上清液；

(4)过滤、用0.22μm CMC水相滤头对收集好的上清液过滤到2ml自动进样瓶，备用；

步骤3、色谱条件

色谱柱Platisil NH2，5μm，250×4.6mm，流动相中V乙腈：V水＝77：23，pH＝2.5，流速为0.3mL/min，柱温为22℃，示差检测器温度为30℃，一个样品周期60min；

步骤4、数据统计分析及作图

数据统计分析采用SPSS V17.0进行描述性统计分析、方差分析、降维-主成分分析；混合标准品的色谱图和样品色谱图通过安捷伦工作站A.01.04C导出数据，截除0-8min，由GrapHpad 7.0作色谱图。

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