CN111999411B - 果蔬中矢车菊素及3种花色苷的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

果蔬中矢车菊素及3种花色苷的高效液相色谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种果蔬中矢车菊素及3种花色苷的高效液相色谱检测方法。本发明利用盐酸‑甲醇混合溶液提取试样中的花色苷(花色素)，涡旋混匀后，避光浸提10‑15h，用配有可见光检测器的高效液相色谱仪在波长520nm处测定，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。本发明可以准确快速同时分析矢车菊素、天竺葵素‑3,5‑双葡萄糖苷、矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷和芍药素‑3‑O‑葡萄糖苷，前处理方法简单，只需提取即可上机分析，所采用的仪器高效液相色谱目前在各个实验室中应用广泛，易于推广，有较强的适用性。

Description

果蔬中矢车菊素及3种花色苷的高效液相色谱检测方法
技术领域
本发明涉及果蔬中矢车菊素及3种花色苷(天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷)的高效液相色谱检测方法，属于分析检测技术领域。
背景技术
矢车菊素属于花色素，而天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷属于花色苷类化合物，是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，花色素和花色苷在很多果蔬产品中广泛存在，如桑葚、草莓、蓝莓、葡萄、紫甘蓝、红心萝卜、茄子、紫洋葱等，具有重要的营养保健功能，如抗氧化、抗突变及肿瘤等，在预防心血管疾病和促进人体健康方面具有举足轻重的作用。
花色苷和花色素的粗提物成分复杂，目前分析方法主要有分光光度法、色谱法等。分光光度法具有设备需要少、价格低廉、操作简单等特点，但只能分析花色苷总量，无法准确分析检测花色苷单体的含量。而目前报道的高效液相色谱法仅适用于检测单种果蔬中某种特定的花色苷，如CN101776659A、CN109507353A、CN103760289A分别用于检测萝卜中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、黑小麦麸皮中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、红肉桃果实中矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷，然而目前尚未建立果蔬中矢车菊素、天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷(其结构式如下式所示)的通用检测方法。
Figure GDA0002717176100000011
Figure GDA0002717176100000021
因此，亟需制定出一套基于HPLC技术的检测果蔬中花色苷(花色素)类化合物含量的通用检测方法，对于提升果蔬产品的营养品质和保健功能具有重要意义，同时为果蔬产品育种和相关基因克隆提供理论依据。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种利用高效液相色谱测定果蔬中矢车菊素、天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷的检测方法，本发明利用盐酸-甲醇混合溶液提取试样中的花色苷(花色素)，涡旋混匀后，避光浸提10-15h，用配有可见光检测器的高效液相色谱仪在波长520nm处测定，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。本发明可以准确快速同时分析矢车菊素及以上3种花色苷。本发明前处理方法简单，只需提取即可上机分析，所采用的仪器高效液相色谱目前在各个实验室中应用广泛，易于推广，有较强的适用性。具有前处理方便快捷、准确性好、灵敏度高、适用性强等优势。
本发明的技术方案是：一种果蔬中矢车菊素及3种花色苷的高效液相色谱检测方法，其特征是，所述3种花色苷分别为天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷，其检测方法具体包括以下步骤：
1)试样前处理
称取果蔬匀浆试样加入0.5％(体积比)盐酸-甲醇溶液，振荡、涡旋，于4℃冰箱中放置10-15h；试样离心，取上清液过滤膜，得到试样提取液；
2)高效液相色谱的色谱条件
色谱柱：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A：0.1％甲酸-水溶液；流动相B：0.1％甲酸-乙腈溶液；检测波长：520nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；梯度洗脱条件见表1；
3)标准曲线制作
配制矢车菊素、天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷的标准工作溶液；
分别将标准工作溶液注入高效液相色谱仪中，以测得的峰面积为纵坐标，以标准工作溶液中花色苷(花色素)的浓度为横坐标，制作标准曲线；
4)试样测定
将步骤1)的试样提取液注入高效液相色谱仪中得到峰面积，从标准曲线中获得试样中矢车菊素、天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷的浓度。
进一步的，所述步骤1)为：称取果蔬样品匀浆试样2-5g，置于离心管中，加入25-35mL0.5％盐酸-甲醇溶液，放置于涡旋振荡器上，振荡、涡旋1min，于4℃冰箱中放置12h，试样6000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，得到试样提取液。
进一步的，对于颜色较深的果蔬样品(如桑葚、紫甘蓝)，称取匀浆试样2g；对于颜色较浅的果蔬样品(如苹果、紫洋葱、茄子)，称取匀浆试样5g；置于离心管中，加入30mL0.5％盐酸-甲醇溶液，放置于涡旋振荡器上，振荡、涡旋1min，于4℃冰箱中放置12h。试样6000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，得到试样提取液。
本发明的有益效果是：
1、前处理简单
本发明利用盐酸-甲醇混合溶液提取试样中的花色苷(花色素)，涡旋混匀后，避光浸提10-15h，用配有可见光检测器的高效液相色谱仪在波长520nm处测定，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量，可以准确快速同时分析果蔬中矢车菊素及以上3种花色苷。其前处理方式非常简单，只需提取即可上机分析，适合推广使用。
2、准确性好，灵敏度高
本方法的检出限为0.20mg/kg，添加浓度的回收率为70％～110％，可以准确快速同时分析矢车菊素、天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷。
3、应用广泛，易于推广
本方法所采用的仪器目前在各个实验室中应用广泛，易于推广，具有较强的适用性。本发明对于揭示果蔬活性功能的物质基础和作用机制具有重要意义，为提升果蔬产品的营养品质和保健功能提供理论依据。
附图说明
图1为标准溶液色谱图，其中从左到右依次为天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素；
图2为天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷标准工作曲线；
图3为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准工作曲线；
图4为芍药素-3-O-葡萄糖苷标准工作曲线；
图5为矢车菊素标准工作曲线。
具体实施方式
一、检测方法
1试剂与设备
矢车菊素、天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷标准品，纯度≥95％；甲醇、乙腈、甲酸试剂均为色谱纯；盐酸为优级纯。
Waters高效液相色谱仪E2695，可见光检测器，Inert Sustain C18色谱分析柱(4.6×250mm,5μm)，涡旋振荡器，离心机，超声波清洗器。
2试样前处理
对于颜色较深的果蔬样品(如桑葚、紫甘蓝)，称取匀浆试样2g(精确至0.01g)；对于颜色较浅的果蔬样品(如苹果、紫洋葱、茄子)，称取匀浆试样5g(精确至0.01g)。置于离心管中，加入30mL 0.5％盐酸-甲醇溶液，放置于涡旋振荡器上，振荡、涡旋1min，于4℃冰箱中放置12h。试样6000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，待HPLC分析测定。
3色谱条件
高效液相色谱仪，配备可见光检测器。
色谱柱：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。
流动相A：0.1％甲酸-水溶液；流动相B：0.1％甲酸-乙腈溶液。
检测波长：520nm。
柱温：30℃。
流速：1mL/min。
进样量：10μL。
梯度洗脱条件，见表1。
表1梯度洗脱程序
Figure GDA0002717176100000051
4标准曲线制作
分别称取0.01g(精确至0.00001g)矢车菊素、天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷标准品，用甲醇溶解，转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，得到质量浓度均为1000mg/L的4种标准储备液。将各标准储备液分别用甲醇逐级稀释成100mg/L、50mg/L、20mg/L、5mg/L、2.5mg/L标准工作溶液。
分别将标准工作溶液注入高效液相色谱仪中，以测得的峰面积为纵坐标，以标准工作溶液中花色苷(花色素)的浓度(mg/L)为横坐标，制作标准曲线。
5试样测定
将试样提取液注入高效液相色谱仪中得到峰面积，从标准曲线中获得试样中花色苷(花色素)的浓度C(mg/L)。
6结果计算
试样中的花色苷(花色素)含量按下式计算：
X＝C×V/m
式中：
X──试样中花色苷(花色素)的含量，单位为微克每克(μg/g)。
C──根据标准曲线计算得到的试样中花色苷(花色素)浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)。
V──提取剂体积，单位为毫升(mL)。
m──试样质量，单位为克(g)。
备注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字。
7结果与讨论
7.1色谱条件的确定
7.1.1波长的确定
花色苷(花色素)属于黄酮类成分，已有研究显示，其在280nm和520nm左右的两个波长处有特征吸收峰，尤其在520nm左右，除了花色苷(花色素)，其他成分极少在此有强吸收峰，因此，选定520nm作为该方法的检测波长。
7.1.2色谱柱的确定
选用反相色谱柱C18作为分离色谱柱。实验中分别选用了C18(4.6mm×100mm，5μm)、C18(4.6mm×150mm，3.5μm)和C18(4.6mm×250mm，5μm)3种柱子，结果显示，C18(4.6mm×250mm，5μm)分离度明显优于另外两种柱子。因此，选择C18(4.6mm×250mm，5μm)作为色谱柱。
7.1.3流动相条件的确定
由于甲醇和水比例接近1:1时，混合溶液粘度大，色谱柱柱压高，为降低柱压，延长色谱柱使用寿命，故选择乙腈和水作为流动相，同时加入0.1％(体积比)甲酸以改善峰形。实验探讨了不同梯度洗脱程序对分离度的影响，最终确定梯度洗脱程序如表1时，花色苷(花色素)的分离度最好，混合标准溶液色谱图如图1所示。
二、方法学验证
1线性范围
根据上述浓度为100mg/L、50mg/L、20mg/L、5mg/L、2.5mg/L的4种花色苷(花色素)标准工作溶液，绘制色谱峰面积对花色苷(花色素)浓度的标准曲线，如图2～5所示，在2.5～100mg/L浓度范围内，天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素的标准曲线和相关系数如表2所示，线性关系均良好。
表2花色苷(花色素)标准曲线与相关系数
Figure GDA0002717176100000061
2方法的回收率、精密度和灵敏度
方法的准确度和精密度通过添加回收实验进行考察。在桑葚、苹果、紫甘蓝、紫洋葱、茄子试样中添加高、中、低3种浓度的花色苷(花色素)标准溶液，按上述2试样前处理方式处理，每个浓度5个平行。实验结果见表-7，添加平均回收率在72.3％～109.1％之间，相对标准偏差(RSD)在0.5％～15.4％。以信噪比S/N≥3计算检出限，该方法的检出限为0.20mg/kg。
表3添加回收率实验(桑葚)(n＝5)
Figure GDA0002717176100000071
表4添加回收率实验(苹果)(n＝5)
Figure GDA0002717176100000072
表5添加回收率实验(紫甘蓝)(n＝5)
Figure GDA0002717176100000081
表6添加回收率实验(紫洋葱)(n＝5)
Figure GDA0002717176100000082
表7添加回收率实验(茄子)(n＝5)
Figure GDA0002717176100000091
三、实际样品的检测
紫甘蓝样品称取匀浆试样2g(精确至0.01g)，置于离心管中，加入30mL 0.5％盐酸-甲醇溶液，放置于涡旋振荡器上，振荡、涡旋1min，于4℃冰箱中放置12h。试样6000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜。吸取10μL经0.22μm滤膜过滤的紫甘蓝样品花色苷(花色素)提取液，注入高效液相色谱仪，比较样品和标准品的高效液相色谱图，根据保留时间定性，外标法定量，得到紫甘蓝中含有的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素的平均含量分别为89.09μg/g、44.17μg/g、851.72μg/g。

Claims (3)

1.一种果蔬中矢车菊素及3种花色苷的高效液相色谱检测方法，其特征是，所述3种花色苷分别为天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷，其检测方法具体包括以下步骤：
1)试样前处理
取果蔬匀浆试样加入0.5％盐酸-甲醇溶液，振荡、涡旋，于4℃冰箱中放置10-15h；试样离心，取上清液过滤膜，得到试样提取液；
2)高效液相色谱的色谱条件
色谱柱：C18色谱柱；流动相A：0.1％甲酸-水溶液；流动相B：0.1％甲酸-乙腈溶液；检测波长：520nm；梯度洗脱程序如下：
Figure FDA0003673956750000011
柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；C18色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm；
3)标准曲线制作
配制矢车菊素、天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷的标准工作溶液；
分别将标准工作溶液注入高效液相色谱仪中，以测得的峰面积为纵坐标，以标准工作溶液中矢车菊素、天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷或者芍药素-3-O-葡萄糖苷的浓度为横坐标，制作标准曲线；
4)试样测定
将步骤1)的试样提取液注入高效液相色谱仪中得到峰面积，从标准曲线中获得试样中矢车菊素、天竺葵素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷的浓度。
2.如权利要求1所述的一种果蔬中矢车菊素及3种花色苷的高效液相色谱检测方法，其特征是，所述步骤1)为：称取果蔬样品匀浆试样2-5g，置于离心管中，加入25-35mL0.5％盐酸-甲醇溶液，放置于涡旋振荡器上，振荡、涡旋1min，于4℃冰箱中放置12h，试样6000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，得到试样提取液。
3.如权利要求2所述的一种果蔬中矢车菊素及3种花色苷的高效液相色谱检测方法，其特征是，所述步骤1)为：对于颜色较深的果蔬样品，称取匀浆试样2g；对于颜色较浅的果蔬样品，称取匀浆试样5g，加入30mL 0.5％盐酸-甲醇溶液，放置于涡旋振荡器上，振荡、涡旋1min，于4℃冰箱中放置12h；试样6000r/min离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，得到试样提取液。
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