CN111175409B - 一种测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，该检测方法能同时对苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、琥珀酸、α‑酮戊二酸5种有机酸和谷氨酸1种酸性氨基酸进行定性、定量，所需样品量较少，仅需要0.1g甚至更少样品即可进行精确检测；同时检测步骤少，简单快捷，重现性较好，降低了实验误差并提高了数据的准确性。

Description

一种测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱 方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，尤其涉及一种测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法。

背景技术

番茄属管状花目茄科(Solanaceae)番茄属(lycopersicon)一年或多年生植物，是一种营养价值很高的蔬菜类经济作物，在我国南北方均广泛种植。由于其果实口味酸甜，营养丰富，深受消费者喜爱。

番茄的口味由许多因素决定，其中有机酸是重要的决定因素之一，不同的有机酸具有不同的风味。其中柠檬酸和苹果酸是番茄中主要的有机酸，会使番茄具有酸味，而琥珀酸、奎尼酸和α-酮戊二酸则使番茄具有苦味及涩味，对番茄的风味有负面影响，酸性氨基酸谷氨酸则会令番茄具有鲜味。随着番茄果实的成熟，番茄中的有机酸含量逐渐降低；有机酸的含量变化会影响番茄的风味。

有机酸分析方法常见的有酸碱滴定法、薄层色谱法、气相色谱法、离子色谱法、液相色谱法等。高效液相色谱法前处理比较简单，适合高沸点的非挥发性有机酸的测定，且具有操作简单、准确度高、重现性好等特点。

目前，使用高效液相色谱法对部分有机酸(如含量较多的柠檬酸和苹果酸)进行单一检测的检测方法较多，对于多种有机酸的混合物的检测耗费时间长，操作复杂；对于多种有机酸和氨基酸的混合物无法同时检测分析，进而影响了检测效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，旨在解决现有技术中的高效液相色谱方法无法同时测定有机酸和酸性氨基酸混合物的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，包括如下步骤：

配制苹果酸标准品、柠檬酸标准品、奎尼酸标准品、谷氨酸标准品、琥珀酸标准品、α-酮戊二酸标准品的混合标准溶液，将所述混合标准溶液进行高效液相色谱检测得到标准图谱，并制作标准曲线，获取各标准品的回归方程；

配制番茄待测品；将所述番茄待测品在与所述混合标准溶液相同的检测条件下进行高效液相色谱检测，获得所述番茄待测品的色谱图，根据所述番茄待测品的色谱图的保留时间确定苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的种类，并根据各种类的色谱峰面积计算得到所述番茄待测品中苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的含量。

本发明提供了一种利用高效液相色谱同时检测番茄中苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、琥珀酸、α-酮戊二酸5种有机酸和谷氨酸1种酸性氨基酸的混合物的方法，该方法首先以至少5种不同浓度的苹果酸标准品、柠檬酸标准品、奎尼酸标准品、谷氨酸标准品、琥珀酸标准品、α-酮戊二酸标准品的混合标准溶液进行高效液相色谱检测以得到标准图谱，并分别获取各标准品的标准曲线；再对番茄待测品进行预处理，以少量的样品进行预处理得到的溶液进行高效液相色谱检测，根据所述番茄待测品的色谱图的保留时间即可确定各有机酸和酸性氨基酸的种类，并根据色谱峰面积及标准曲线即可分析得到各有机酸和酸性氨基酸的含量。该检测方法所需样品量较少，仅需要0.1g甚至更少样品即可进行精确检测；同时检测步骤少，简单快捷，重现性较好，降低了实验误差并提高了数据的准确性，可同时对苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、琥珀酸、α-酮戊二酸5种有机酸和谷氨酸1种酸性氨基酸进行定性、定量，为番茄中有机酸和酸性氨基酸的混合物准确判定、快速检测提供了科学依据。

附图说明

图1是本发明实施例提供的柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、奎尼酸、α-酮戊二酸、谷氨酸的标准溶液的色谱图。

图2是本发明实施例提供的谷氨酸标准品的标准曲线图。

图3是本发明实施例提供的奎尼酸标准品的标准曲线图。

图4是本发明实施例提供的苹果酸标准品的标准曲线图。

图5是本发明实施例提供的柠檬酸标准品的标准曲线图。

图6是本发明实施例提供的α-酮戊二酸标准品的标准曲线图。

图7是本发明实施例提供的琥珀酸标准品的标准曲线图。

图8是本发明实施例提供的番茄待测液液的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本发明的描述中，所涉及的各种仪器与试剂的说明如下：

各仪器型号：高效液相色谱仪为岛津LC-16；电子天平为sartorius；恒温水浴锅为江苏金怡；真空冻干机为宁波新芝；离心机为eppendorf；组合式溶剂过滤器为上海生工。

各试剂产家：标品-柠檬酸、标品-琥珀酸、标品-苹果酸、标品-α-酮戊二酸二钠盐、标品-奎尼酸购自sigma-Aldrich公司；标品-D,L-谷氨酸购自国家标准品网；甲醇购自sigma公司，纯度为色谱纯；纯水为娃哈哈纯净水。

本发明实例提供一种测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，包括如下步骤：

S01.配制苹果酸标准品、柠檬酸标准品、奎尼酸标准品、谷氨酸标准品、琥珀酸标准品、α-酮戊二酸标准品的混合标准溶液，将所述混合标准溶液进行高效液相色谱检测得到标准图谱，并制作标准曲线，获取各标准品的回归方程；

S02.配制番茄待测品；将所述番茄待测品在与所述混合标准溶液相同的检测条件下进行高效液相色谱检测，获得所述番茄待测品的色谱图，根据所述番茄待测品的色谱图的保留时间确定苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的种类，并根据各种类的色谱峰面积计算得到所述番茄待测品中苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的含量。

本发明提供了一种利用高效液相色谱同时检测番茄中苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、琥珀酸、α-酮戊二酸5种有机酸和谷氨酸1种酸性氨基酸的混合物的方法，该检测方法所需样品量较少，仅需要0.1g甚至更少样品即可进行精确检测；同时检测步骤少，简单快捷，重现性较好，降低了实验误差并提高了数据的准确性，可同时对苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、琥珀酸、α-酮戊二酸5种有机酸和谷氨酸1种酸性氨基酸进行定性、定量，为番茄中有机酸和酸性氨基酸的混合物准确判定、快速检测提供了科学依据。

具体的，在上述步骤S01中，配制苹果酸标准品、柠檬酸标准品、奎尼酸标准品、谷氨酸标准品、琥珀酸标准品、α-酮戊二酸标准品的混合标准溶液，其中，苹果酸标准品、柠檬酸标准品、奎尼酸标准品、琥珀酸标准品、α-酮戊二酸标准品购自sigma-Aldrich公司；谷氨酸标准品购自国家标准品网。提供标准品混合标准溶液，将所述标准品混合标准溶液进行高效液相色谱检测，分析得到标准图谱，进而确定不同种类的标准品的保留时间以及确定标准曲线。

优选的，所述混合标准溶液中，苹果酸标准品的浓度为20mg/mL；柠檬酸标准品的浓度为20mg/mL；奎尼酸标准品的浓度为20mg/mL；谷氨酸标准品的浓度为20mg/mL；琥珀酸标准品的浓度为20mg/mL；α-酮戊二酸标准品的浓度为20mg/mL。在本发明优选实施例中，所述混合标准溶液的配制方法如下：分别精密称取适量苹果酸标准品、柠檬酸标准品、奎尼酸标准品、谷氨酸标准品、琥珀酸标准品、α-酮戊二酸标准品，用超纯水溶解所述标准品制备得到所述混合标准溶液。

具体的，将所述混合标准溶液进行逐级稀释，配制至少5种不同浓度的混合标准稀释液，将所述不同浓度的混合标准稀释液进行高效液相色谱检测并得到标准图谱。提供至少5种不同浓度的混合标准稀释液，有一定数量不同浓度的样品进行检测，确保能够绘制得到标准曲线进行后续的实验分析。

优选的，将所述混合标准溶液进行逐级稀释，配制至少5种不同浓度的混合标准稀释液的步骤中，配制8种不同浓度的混合标准稀释液。进一步优选的，所述8种不同浓度的混合标准稀释液包括5mg/mL的混合标准稀释液、4mg/mL的混合标准稀释液、2mg/mL的混合标准稀释液、1mg/mL的混合标准稀释液、0.5mg/mL的混合标准稀释液、0.25mg/mL的混合标准稀释液、0.125mg/mL的混合标准稀释液、0.0625mg/mL的混合标准稀释液。

进一步优选的，对配制得到的8种不同浓度的混合标准稀释液进行过滤处理，除去所述混合标准稀释液中的杂质，保证所述混合标准稀释液中纯度较高。在本发明优选实施例中，进行过滤处理的步骤中，用0.45μm滤膜进行过滤，保证具有较好的除杂效果。

进一步优选的，对过滤处理得到的8种不同浓度的混合标准稀释液进行脱气处理，保证溶液中没有多余的空气，确保不会影响检测结果，同时对色谱柱进行保护。在本发明优选实施例中，所述脱气处理选自但不限于超声脱气的方法。

进一步的，对所述8中不同浓度的混合标准稀释液分别进行高效液相色谱检测，可得到标准图谱。

优选的，所述高效液相色谱检测采用岛津LC-16液相色谱仪检测器，所述岛津LC-16液相色谱仪检测器具有SPD-16紫外可见双波长检测器，该检测器是高灵敏度和宽线性范围的紫外可见双波长检测器，能够保证检测灵敏度较高，提高检测结果的准确性。优选的，所述检测波长为210nm。根据所检测的5种有机酸和1种酸性氨基酸的特征波长，进而确定所述检测波长为210nm，保证待测组分均能够被检测到。

优选的，所述高效液相色谱检测的条件如下：色谱柱为C18色谱柱，选用C18色谱柱进行高效液相色谱检测，能够保证色谱柱的柱效，提高检测效果。进一步优选的，所述C18色谱柱的规格为5μm，4.6×250mm，选择上述柱规格的C18色谱柱，保证色谱柱的具有较好的分析速度、分离能力和检测能力。

优选的，所述进样量为10-30μL；保持上述条件的进样量，能够较好地对苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、琥珀酸、α-酮戊二酸5种有机酸和谷氨酸1种酸性氨基酸进行准确地分离，保证实验的精确度，提高检测结果的准确性。若进样量过大，则各物质的峰面积过大，则有可能导致两个样品峰无法分离，影响后续分析；若进样量过小，则各物质的峰面积过小，过小的峰面积则无法准确进行定量分析，影响实验的精确度。在本发明优选实施例中，所述进样量为20μL；保持上述条件的进样量，能够对所述5种有机酸和1种酸性氨基酸进行准确地分离，保证实验的精确度，提高检测结果的准确性。

优选的，所述流动相溶液为pH 2.53的含0.5％甲醇的0.01M KH₂PO₄溶液；KH₂PO₄溶液作为流动相溶液，一方面可较好地对所述5种有机酸和1种酸性氨基酸进行准确地分离，另一方面可以作为缓冲液，保证有机酸分子在检测过程中不会发生解离反应，提高实验的精确度。

进一步优选的，所述KH₂PO₄溶液浓度为0.01mol/L，以较低浓度的KH₂PO₄溶液作为流动相，可以分离有机酸混合物同时不会对检测过程造成影响；若KH₂PO₄溶液浓度过高，则溶液中K离子、P离子浓度过高，会影响色谱柱的稳定性，影响样品的出峰时间及出峰大小，进而影响检测结果的准确性；若KH₂PO₄溶液浓度过低，则无法保证有机酸分子在检测过程中不会发生解离反应，影响实验的精确度。

进一步优选的，所述KH₂PO₄溶液的pH为2.53，较低pH可以抑制有机酸在检测过程中发生解离，保证样品检测的峰型较好。若pH过高，则法保证有机酸分子在检测过程中不会发生解离反应，影响实验的精确度；若pH过低，溶液酸性过强，会影响色谱柱的稳定性，影响样品的出峰时间及出峰大小，进而影响检测结果的准确性。

进一步优选的，所述KH₂PO₄溶液含有0.5％甲醇，加入甲醇目的是提供少量疏水性环境，缩短疏水性强的有机酸的洗脱时间，以保证能够同时对所述5种有机酸和1种酸性氨基酸进行准确地分离，保证实验的精确度，提高检测结果的准确性。

优选的，所述流动相溶液的配制方法如下：将KH₂PO₄溶解于超纯水中，加入甲醇混合得到第一混合液；调节所述第一混合液的pH为2.53后，进行定容得到所述流动相溶液。在本发明优选实施例中，所述流动相溶液的配制方法如下：将1.3609g KH₂PO₄溶于超纯水中，加入5mL色谱级甲醇混合得到第一混合液；用85％磷酸调所述第一混合液的pH至2.53，添加纯净水定容至1L，用组合式溶剂过滤器采用0.45μm微孔的滤膜进行过滤，再进行超声脱气处理，得到所述流动相溶液。

优选的，所述洗脱时间为15～20min；采用上述洗脱时间进行洗脱处理，能够保证各个成分能够进行检测，保证时间的准确性。若洗脱时间过短，洗脱过程中会造成同时检测两个样品，进而影响实验的精确度。在本发明优选实施例中，所述洗脱时间为16min；在上述时间进行洗脱处理，能够保证洗脱效果较佳，检测结果可信。

优选的，所述柱温为30-50℃，保持上述条件的柱温，能够较好地对苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、琥珀酸、α-酮戊二酸5种有机酸和谷氨酸1种酸性氨基酸同时进行定性和定量，提高检测结果的准确性。在检测过程中，柱温的变化会影响样品的出峰时间及峰型，若柱温过高，出峰越快，保留时间变小，进而造成保留时间的重现性不好，从而影响样品组分的定性结果，同时柱温过高，会导致半峰宽变窄，峰高变高，进而影响样品组分的定量；若柱温过低，出峰越慢，保留时间变长，进而造成保留时间的重现性不好，从而影响样品组分的定性结果，同时柱温过低，会导致半峰宽变宽，峰高变低，进而影响样品组分的定量。在本发明优选实施例中，所述柱温为40℃，在40℃的柱温条件下，能够保证所述5种有机酸和1种酸性氨基酸的出峰时间稳定、峰面积大小适中，保证了实验的精确度。

优选的，所述洗脱流速为0.5～0.7mL/min；洗脱流速的快慢会影响样品的保留时间，进而影响实验的准确性。若洗脱流速过快，则保留时间缩短；若洗脱流速过慢，则保留时间增加，均会造成实验结果不准确。在本发明优选实施例中，所述洗脱流速为0.6mL/min，按照上述流速进行洗脱处理，能够保证保留时间准确，检测结果可信。

采用所述色谱条件进行高效液相色谱检测，能够同时对苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、琥珀酸、α-酮戊二酸5种有机酸和谷氨酸1种酸性氨基酸进行定性、定量，提高了检测效率，检测步骤少，简单快捷，重现性较好，降低了实验误差并提高了数据的准确性。

优选的，通过所述标准图谱中的保留时间确定各标准品的种类，以各标准品的峰面积与对应的各标准品的浓度制作标准曲线，获取各标准品的回归方程。

优选的，对所述8中不同浓度的混合标准稀释液分别进行高效液相色谱检测，可得到标准图谱，通过所述标准图谱中的保留时间确定各标准品的种类，以各标准品的峰面积与对应的各标准品的浓度制作标准曲线，获取各标准品的回归方程；优选的，以各标准品的峰面积为纵坐标(Y)，以对应的各标准品的浓度为横坐标(X,mg/mL)，绘制标准曲线。

具体的，在上述步骤S02中，配置番茄待测品；将所述番茄待测品在与所述混合标准溶液相同的检测条件下进行高效液相色谱检测，获得所述番茄待测品的色谱图，根据所述番茄待测品的色谱图的保留时间确定苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的种类，并根据各种类的色谱峰面积计算得到所述番茄待测品中苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的含量。

优选的，配制番茄待测品的步骤中，包括如下方法：

S021.提供番茄样品，收集所述番茄样品的果肉；

S022.将所述果肉加入超纯水进行混合得到第一混合物，将所述第一混合物进行加热处理后进行离心处理，收集第一混合物上清液；

S023.将所述第一混合物上清液进行冻干处理，得到第一提取物；

S024.将所述第一提取物加入超纯水进行混合、过滤得到所述番茄待测品。

在上述步骤S021中，提供番茄样品，所述番茄样品选择任意一种番茄品种的样品均可。在本发明优选实施例中，所述番茄样品为实验室种植Micro-Tom品种番茄。

优选的，收集所述番茄样品的果肉的步骤中，将番茄样品进行处理，分离果皮及果肉，并去除果肉内种子，收集所述番茄样品的果肉于液氮中磨成粉末。

在上述步骤S022中，将所述果肉加入超纯水进行混合得到第一混合物，将所述第一混合物进行加热处理后进行离心处理，收集第一混合物上清液。

优选的，将所述果肉加入超纯水进行混合得到第一混合物的步骤中，所述第一混合物的浓度为5～10mg/mL。

优选的，将所述第一混合物进行加热处理的步骤中，所述加热处理的温度为70～80℃，加热处理的时间为30～40分钟。在本发明优选实施例中，将所述第一混合物进行加热处理的步骤中，所述加热处理的温度为80℃，加热处理的时间为30分钟。

优选的，将所述第一混合物进行加热处理后进行离心处理的步骤中，所述离心处理的条件为：离心处理的转速为10000rcf～12000rcf；离心处理的时间为20～25分钟。在本发明优选实施例中，将所述第一混合物进行加热处理后进行离心处理的步骤中，所述离心处理的条件为：离心处理的转速为12000rcf；离心处理的时间为20分钟。

在上述步骤S023中，将所述第一混合物上清液进行冻干处理，得到第一提取物；在本发明优选实施例中，将所述第一混合物上清液进行真空冷冻干燥处理，至所有溶剂蒸发完全，底部剩余不可挥发物质即为提取的有机酸。

在上述步骤S024中，将所述第一提取物加入超纯水进行混合、过滤得到所述番茄待测品。优选的，所述过滤处理采用0.45μm滤膜进行过滤，得到所述番茄待测品。

具体的，将所述番茄待测品溶液进行高效液相色谱检测，优选的，所述高效液相色谱检测的实验条件如下：检测器为岛津LC-16液相色谱仪检测器；色谱柱选用5μm，4.6×250mm的C18色谱柱；柱温为30-50℃；进样量为10-30μL；流动相溶液为pH 2.53的含0.5％甲醇的0.01M KH₂PO₄溶液；洗脱时间为15～20min；洗脱流速为0.5～0.7mL/min；检测波长为210nm。在本发明优选实施例中，所述高效液相色谱检测的实验条件如下：检测器为岛津LC-16液相色谱仪检测器；色谱柱选用5μm，4.6×250mm的C18色谱柱；柱温为40℃；进样量为20μL；流动相溶液为pH 2.53的含0.5％甲醇的0.01M KH₂PO₄溶液；洗脱时间为16min；洗脱流速为0.6mL/min；检测波长为210nm。在上述条件下对所述番茄待测品溶液进行高效液相色谱检测，能够保证能够对苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸进行分离及准确检测。

具体的，进行高效液相色谱检测之后，获得所述番茄待测品的色谱图，根据所述番茄待测品的色谱图的保留时间确定苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的种类，并根据各种类的色谱峰面积，结合制备得到的各种类型物质的标准曲线和回归方程，计算得到所述番茄待测品中苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的浓度。

进一步的，根据所述浓度，代入以下公式，则可知供试样品每克鲜重所含各有机酸含量。

式中：X—样品中有机酸成分的含量，单位为mg/g；

C—由标准曲线得出的样液中蔗糖的质量浓度，单位为mg/mL；

V—提取番茄样品中有机酸所用纯净水体积，单位为mL；

V1—样液最后定容体积，单位为mL；

V2—用于浓缩的提取液体积，单位为mL；

M—样品质量，单位为g。

优选的，所述的测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，包括如下步骤：

配制苹果酸标准品、柠檬酸标准品、奎尼酸标准品、谷氨酸标准品、琥珀酸标准品、α-酮戊二酸标准品的混合标准溶液，将所述混合标准溶液进行逐级稀释，配制5mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL8种不同浓度的混合标准稀释液，将所述不同浓度的混合标准稀释液进行高效液相色谱检测并得到标准图谱，并制作标准曲线，获取各标准品的回归方程；其中，所述色谱条件如下：检测器为岛津LC-16液相色谱仪检测器；色谱柱选用C18色谱柱；柱温为30～50℃；进样量为10～30μL；流动相溶液为pH 2.53的含0.5％甲醇的0.01M KH₂PO₄溶液；洗脱时间为15～20min；洗脱流速为0.5～0.7mL/min；

提供番茄样品，收集所述番茄样品的果肉；将所述果肉加入超纯水进行萃取得到第一混合物，将所述第一混合物进行加热处理后进行离心处理，收集第一混合物上清液；将所述第一混合物上清液进行浓缩处理，得到第一提取物；将所述第一提取物加入超纯水进行混合、过滤得到所述番茄待测品；

将所述番茄待测品在与所述混合标准溶液相同的检测条件下进行高效液相色谱检测，获得所述番茄待测品的色谱图，根据所述番茄待测品的色谱图的保留时间确定苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的种类，并根据各种类的色谱峰面积计算得到所述番茄待测品中苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的含量。

本发明提供了一种利用高效液相色谱同时检测番茄中苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、琥珀酸、α-酮戊二酸5种有机酸和谷氨酸1种酸性氨基酸的混合物的方法，该方法首先以至少5种不同浓度的苹果酸标准品、柠檬酸标准品、奎尼酸标准品、谷氨酸标准品、琥珀酸标准品、α-酮戊二酸标准品的混合标准溶液进行高效液相色谱检测以得到标准图谱，并分别获取各标准品的标准曲线；再对番茄待测品进行预处理，以少量的样品进行预处理得到的溶液进行高效液相色谱检测，根据所述番茄待测品的色谱图的保留时间即可确定各有机酸和酸性氨基酸的种类，并根据色谱峰面积及标准曲线即可分析得到各有机酸和酸性氨基酸的含量。该检测方法所需样品量较少，仅需要0.1g甚至更少样品即可进行精确检测；同时检测步骤少，简单快捷，重现性较好，降低了实验误差并提高了数据的准确性，可同时对苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、琥珀酸、α-酮戊二酸5种有机酸和谷氨酸1种酸性氨基酸进行定性、定量，为番茄中有机酸和酸性氨基酸的混合物准确判定、快速检测提供了科学依据。

以具体实施例的内容进一步进行说明。

实施例1

制备标准品的标准曲线

配制苹果酸标准品、柠檬酸标准品、奎尼酸标准品、谷氨酸标准品、琥珀酸标准品、α-酮戊二酸标准品的混合标准溶液：分别精密称取柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、奎尼酸、α-酮戊二酸、谷氨酸标品适量，用娃哈哈纯净水制成每1mL含20mg柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、奎尼酸、α-酮戊二酸、谷氨酸的混合标准溶液，采用0.45μm滤膜对所述混合标准溶液进行过滤处理。

配制混合标准稀释液：将所述混合标准溶液进行逐级稀释，配制8种不同浓度的混合标准稀释液，所述8种不同浓度的混合标准稀释液包括5mg/mL的混合标准稀释液、4mg/mL的混合标准稀释液、2mg/mL的混合标准稀释液、1mg/mL的混合标准稀释液、0.5mg/mL的混合标准稀释液、0.25mg/mL的混合标准稀释液、0.125mg/mL的混合标准稀释液、0.0625mg/mL的混合标准稀释液。

高效液相色谱分析：对所述8种不同浓度的混合标准稀释液进行高效液相色谱检测得到标准图谱，所述色谱条件如下：检测器为岛津LC-16液相色谱仪检测器；色谱柱选用5μm，4.6×250mm的C18色谱柱；柱温为40℃；进样量为20μL；流动相溶液为pH 2.53的含0.5％甲醇的0.01M KH₂PO₄溶液；洗脱时间为16min；洗脱流速为0.6mL/min；检测波长为210nm。通过所述标准图谱中的保留时间确定各标准品的种类，以各标准品的峰面积与对应的各标准品的浓度制作标准曲线，获取各标准品的回归方程。

精密度分析：精密吸取所述8种不同浓度的混合标准稀释液，按照所述色谱条件重复进样3次，测定各物质的峰面积并计算峰面积的RSD数值，分析仪器的精密度。

实施例2

不同发育时期番茄有机酸含量测定

准备番茄样品：取4个不同发育时期的番茄样品，分离果皮及果肉，并去除果肉内种子，将所述去除种子的果肉采用液氮进行研磨成粉末；在15mL离心管中加入0.1g样品，于试管中进行精确称重，记录样品鲜重，加入10mL娃哈哈水，充分涡旋混匀，在80℃水浴保温30min；热处理后经冷却至常温，取2mL溶液常温下在12000rcf转速下离心处理20min；取1.5mL上清液真空冷冻干燥至干，加入200μL娃哈哈纯净水溶解，用0.45μm滤膜过滤处理，并进行超声脱气，制备得到4个不同发育时期的番茄待测品；每个时期取3个不同样品，进行3组平行实验。

高效液相色谱检测：对4个不同发育时期的番茄待测品进行高效液相色谱检测，所述色谱条件如下：检测器为岛津LC-16液相色谱仪检测器；色谱柱选用5μm，4.6×250mm的C18色谱柱；柱温为40℃；进样量为20μL；流动相溶液为pH 2.53的含0.5％甲醇的0.01MKH₂PO₄溶液；洗脱时间为16min；洗脱流速为0.6mL/min；检测波长为210nm。

获得所述番茄待测品的色谱图，根据所述番茄待测品的色谱图的保留时间确定苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的种类，并根据各种类的色谱峰面积计算得到所述番茄待测品中苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的浓度。

进一步的，根据所述浓度，代入以下公式，则可知供试样品每克鲜重所含各有机酸含量。

式中：X—样品中有机酸成分的含量，单位为mg/g；

C—由标准曲线得出的样液中蔗糖的质量浓度，单位为mg/mL；

V—提取番茄样品中有机酸所用纯净水体积，单位为mL；

V1—样液最后定容体积，单位为mL；

V2—用于浓缩的提取液体积，单位为mL；

M—样品质量，单位为g。

结果分析：

实施例1中，对所述混合标准溶液进行高效液相色谱检测得到标准图谱如图1所示，由图1可得，通过上述色谱条件对所述混合标准稀释液进行高效液相色谱分析，可将5种有机酸和1中酸性氨基酸进行分离，其中，谷氨酸的保留时间为3.737min；奎尼酸的保留时间为4.291min；苹果酸的保留时间为4.990min；柠檬酸的保留时间为6.613min；α-酮戊二酸的保留时间为7.890min；琥珀酸的保留时间为9.331min。

对8种不同浓度的混合标准稀释液进行高效液相色谱检测，并一一分析得到苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸各标准品的标准曲线，以标准品浓度(mg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线。如图2～图7所示，图2为谷氨酸标准品的标准曲线，通过计算可得，谷氨酸的回归方程为y＝1149070x-4900，R²为0.9999，线性范围为0.0625～5(mg/mL)；图3为奎尼酸标准品的标准曲线，通过计算可得，奎尼酸的回归方程为y＝1075400x+185629，R²为0.9996，线性范围为0.0625～5(mg/mL)；图4为苹果酸标准品的标准曲线，通过计算可得，苹果酸的回归方程为y＝1681940x+7045.94，R²为0.9999，线性范围为0.0625～5(mg/mL)；图5为柠檬酸标准品的标准曲线，通过计算可得，柠檬酸的回归方程为y＝1205060x+321654，R²为0.9999，线性范围为0.0625～5(mg/mL)；图6为α-酮戊二酸标准品的标准曲线，通过计算可得，α-酮戊二酸的回归方程为y＝2319710x+26103.5，R²为0.9999，线性范围为0.0625～5(mg/mL)；图7为琥珀酸标准品的标准曲线，通过计算可得，琥珀酸的回归方程为y＝1414770x-106219，R²为0.9986，线性范围为0.0625～5(mg/mL)。结果显示柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、奎尼酸、α-酮戊二酸、谷氨酸标准品线性范围良好。

精密吸取所述8种不同浓度的混合标准稀释液，按照所述色谱条件重复进样3次，测定各物质的峰面积并计算峰面积的RSD数值，分析得到柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、奎尼酸、α-酮戊二酸、谷氨酸峰面积的RSD范围为0.13％～1.35％，表明仪器精密度良好。

实施例2中，对所述番茄待测品进行高效液相色谱检测，其色谱图如图8所示，由图8可得，通过上述色谱条件对所述混合标准溶液进行高效液相色谱分析，可将5种有机酸和1中酸性氨基酸进行分离，其中，谷氨酸的保留时间为3.703min；奎尼酸的保留时间为.3995min；苹果酸的保留时间为4.421min；柠檬酸的保留时间为6.746min；α-酮戊二酸的保留时间为7.979min；琥珀酸的保留时间为10.359min。由于番茄待测品种还有其他杂质物质对高效液相色谱检测有一定的影响，因此各物质的保留时间会造成一定影响。

测定不同时间的番茄样品中各成分的峰面积，代入回归方程计算各有机酸成分的浓度。

进一步的，根据所述浓度，代入以下公式，则可知供试样品每克鲜重所含各有机酸含量。

式中：X—样品中有机酸成分的含量，单位为mg/g；

C—由标准曲线得出的样液中蔗糖的质量浓度，单位为mg/mL；

V—提取番茄样品中有机酸所用纯净水体积，单位为mL；

V1—样液最后定容体积，单位为mL；

V2—用于浓缩的提取液体积，单位为mL；

M—样品质量，单位为g。

每组内3个结果求得平均值，结果见表1所示，在番茄绿熟期(MG)，柠檬酸含量为117.11mg/g，苹果酸含量为63.27mg/g，琥珀酸含量为1.64mg/g，奎尼酸含量为2.72mg/g，α-酮戊二酸含量为1.67mg/g，谷氨酸含量为7.54mg/g，有机酸和酸性氨基酸混合物总含量为193.95mg/g；在番茄破色期(BR)，柠檬酸含量为140.11mg/g，苹果酸含量为19.26mg/g，琥珀酸含量为4.52mg/g，奎尼酸含量为3.39mg/g，α-酮戊二酸含量为1.09mg/g，谷氨酸含量为9.79mg/g，有机酸和酸性氨基酸混合物总含量为178.16mg/g；在番茄破色五天期(BR+5)，柠檬酸含量为126.00mg/g，苹果酸含量为61.09mg/g，琥珀酸含量为3.12mg/g，奎尼酸含量为1.55mg/g，α-酮戊二酸含量为0.80mg/g，谷氨酸含量为10.31mg/g，有机酸和酸性氨基酸混合物总含量为202.87mg/g；在番茄成熟期(RM)，柠檬酸含量为103.95mg/g，苹果酸含量为58.85mg/g，琥珀酸含量为2.27mg/g，奎尼酸含量为1.16mg/g，α-酮戊二酸含量为0.31mg/g，谷氨酸含量为9.24mg/g，有机酸和酸性氨基酸混合物总含量为175.78mg/g。由表1可得，不同时期的番茄果实中，柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、奎尼酸、α-酮戊二酸、谷氨酸的含量均不同。

本发明的番茄果实有机酸和酸性氨基酸的高效液相色谱检测方法，能够准确检测番茄果实中的5种有机酸成分：柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、奎尼酸、α-酮戊二酸；和1种酸性氨基酸谷氨酸。该方法灵敏度高、专属性好、准确、简便，可以有效评价番茄的有机酸含量，为番茄风味的研究奠定了基础。

表1

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，其特征在于，包括如下步骤：

配制苹果酸标准品、柠檬酸标准品、奎尼酸标准品、谷氨酸标准品、琥珀酸标准品、α-酮戊二酸标准品的混合标准溶液，将所述混合标准溶液进行高效液相色谱检测得到标准图谱，并制作标准曲线，获取各标准品的回归方程；

配制番茄待测品；将所述番茄待测品在与所述混合标准溶液相同的检测条件下进行高效液相色谱检测，获得所述番茄待测品的色谱图，根据所述番茄待测品的色谱图的保留时间确定苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的种类，并根据各种类的色谱峰面积计算得到所述番茄待测品中苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的含量；

所述高效液相色谱检测的条件如下：

检测器为岛津LC-16液相色谱仪检测器；

色谱柱为C18色谱柱；

柱温为30-50℃；

流动相溶液为pH 2.53的含0.5%甲醇的0.01M KH₂PO₄溶液；

洗脱时间为15~20 min；

检测波长为210 nm；

所述流动相溶液的配制方法如下：

将1.3609gKH₂PO₄溶解于超纯水中，加入5ml色谱级甲醇混合得到第一混合液；

用85%磷酸调节所述第一混合液的pH为2.53后，添加纯净水定容至1L，用组合式溶剂过滤器采用0.45μm微孔的滤膜进行过滤，再进行超声脱气处理，得到所述流动相溶液。

2.根据权利要求1所述的测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件如下：

所述C18色谱柱的规格为5 μm，4.6×250mm；

进样量为10-30 μL；

洗脱流速为0.5~0.7 mL/min。

3.根据权利要求1或2所述的测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，其特征在于，配制番茄待测品的步骤中，包括如下方法：

提供番茄样品，收集所述番茄样品的果肉；

将所述果肉加入超纯水进行混合得到第一混合物，将所述第一混合物进行加热处理后进行离心处理，收集第一混合物上清液；

将所述第一混合物上清液进行冻干处理，得到第一提取物；

将所述第一提取物加入超纯水进行混合、过滤得到所述番茄待测品。

4.根据权利要求3所述的测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，其特征在于，将所述果肉加入超纯水进行混合得到第一混合物的步骤中，所述第一混合物的浓度为5~10 mg/mL。

5.根据权利要求3所述的测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，其特征在于，将所述第一混合物进行加热处理的步骤中，所述加热处理的温度为70~80℃，加热处理的时间为30~40分钟。

6.根据权利要求3所述的测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，其特征在于，将所述第一混合物进行加热处理后进行离心处理的步骤中，所述离心处理的条件为：离心处理的转速为 10000 rcf~12000 rcf；离心处理的时间为20~25分钟。

7.根据权利要求1或2所述的测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，其特征在于，将所述混合标准溶液进行高效液相色谱检测得到标准图谱，并制作标准曲线，获取各标准品的回归方程的步骤中，将所述混合标准溶液进行逐级稀释，配制至少5种不同浓度的混合标准稀释液，将所述不同浓度的混合标准稀释液进行高效液相色谱检测器检测并得到标准图谱，通过所述标准图谱中的保留时间确定各标准品的种类，以各标准品的峰面积与对应的各标准品的浓度制作标准曲线，获取各标准品的回归方程。

8.根据权利要求1所述的测定番茄有机酸和酸性氨基酸混合物的高效液相色谱方法，其特征在于，包括如下步骤：

配制苹果酸标准品、柠檬酸标准品、奎尼酸标准品、谷氨酸标准品、琥珀酸标准品、α-酮戊二酸标准品的混合标准溶液，将所述混合标准溶液进行逐级稀释，配制5 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL8种不同浓度的混合标准稀释液，将所述不同浓度的混合标准稀释液进行高效液相色谱检测并得到标准图谱，并制作标准曲线，获取各标准品的回归方程；其中，所述色谱条件如下：检测器为岛津LC-16液相色谱仪检测器；色谱柱选用C18色谱柱；柱温为30~50℃；进样量为10~30 μL；流动相溶液为pH 2.53的含0.5%甲醇的0.01M KH₂PO₄溶液；洗脱时间为15~20 min；洗脱流速为0.5~0.7 mL/min；

提供番茄样品，收集所述番茄样品的果肉；将所述果肉加入超纯水进行萃取得到第一混合物，将所述第一混合物进行加热处理后进行离心处理，收集第一混合物上清液；将所述第一混合物上清液进行浓缩处理，得到第一提取物；将所述第一提取物加入超纯水进行混合、过滤得到所述番茄待测品；

将所述番茄待测品在与所述混合标准溶液相同的检测条件下进行高效液相色谱检测，获得所述番茄待测品的色谱图，根据所述番茄待测品的色谱图的保留时间确定苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的种类，并根据各种类的色谱峰面积计算得到所述番茄待测品中苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、谷氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸的含量。

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