CN103983594B - 一种测定奶制品中三聚氰胺和/或二聚氰胺含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用紫外吸收光谱‑化学计量学技术快速、简便、灵敏、准确检测奶粉和液态奶中三聚氰胺和/或二聚氰胺的方法。针对现有检测奶粉和液态奶中三聚氰胺、二聚氰胺的方法存在的耗时长、操作繁琐、成本昂贵等问题，本发明采用硅胶在酸性水溶液中除去样品基质的前处理方法，结合紫外吸收光谱和化学计量学的方法，最终得到三聚氰胺、双氰胺的含量。该方法样品前处理简便快速，测量过程仅用到紫外分光光度计，通过偏最小二乘法、或支持向量机法、或最小二乘―支持向量机算法的回归运算，可以得到相关模型，进而可以用所得的模型预测未知样品中的三聚氰胺、二聚氰胺含量。本方法检测限低、精密度好、回收率高，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测领域，具体涉及到一种测定奶制品中三聚氰胺和/或二聚氰胺含量的方法。
背景技术
三聚氰胺(含氮量66％)与蛋白质(平均含氮量16％)相比含有更高比例的氮原子，因此被一些造假者利用，添加在奶制品中以造成产品中蛋白质含量较高的假象。然而，三聚氰胺能导致肾脏中的不溶性三聚氰胺—三聚氰酸结合晶体的形成，从而导致肾功能衰竭。2008年9月，中国发生了骇人听闻的含三聚氰胺的婴幼儿问题奶粉事件，被三聚氰胺污染的奶粉导致上万的婴幼儿患肾结石病住院，甚至有数名死亡。为了确保食品供应三聚氰胺不受掺假，一些国家和组织已采取积极措施，例如增加进口乳源配料和成品的取样和测试。2008年11月，美国FDA将婴幼儿配方奶粉中的三聚氰胺的限量值设定在1mg/kg。2008年12月，世卫组织专家会议规定了婴儿配方奶粉中的三聚氰胺含量为1.0mg/kg。与此同时，中国发布了测定原料乳与乳制品中三聚氰胺的三项国家标准方法：高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱/质谱法，检出限分别为2mg/kg、0.01mg/kg和0.05mg/kg[0.005mg/kg]，及一项原料奶和液态奶中三聚氰胺的快速测定的国家标准方法,检出限为0.05mg/kg。2011年，我国公布三聚氰胺在食品中的限量值规定：婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，其他普通食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg(卫生部公告2011年第10号)。2012年7月，食品法典委员会第35届会议审查制定了婴儿配方奶粉中的三聚氰胺限量为0.15mg/kg。
2013年1月，享誉全球的新西兰牛奶及奶制品被检测出含有有毒物质二聚氰胺，乳制品的安全再次引发了消费者的担忧。本次新西兰奶粉二聚氰胺事件，据悉为由于少数牧场使用了含二聚氰胺的化肥，促进牧草的生长，同时牛、羊吃这种草可以减少二氧化氮的排放，减少硝酸盐从土壤中渗入河水和溪流，起到保护环境的效果。由于牧草含有二聚氰胺，导致牛奶中二聚氰胺的残留。目前，与二聚氰胺相关的现行标准有两条：HG/T 3264-1999《工业双氰胺》和CNS 14682-2002《肥料检验法(双氰胺态氮之测定)》。但是还没有对食品或者奶制品中的双氰胺的检测的相关标准，仅有一些关于奶制品中的双氰胺的测定方法，如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)的研究报道。
以上提到的用于三聚氰胺和二聚氰胺检测的方法均使用了色谱技术或色谱-质谱联用技术，需要昂贵的、特殊的仪器，不能适用于一般实验室及现场的快速、简便、廉价检测的需求。此外，由于奶制品中存在复杂的基质，上述方法通常耗时或需要用有机溶剂对样品进行预处理，如萃取。
紫外-可见吸收光谱法是一种简便、快速、准确并广泛应用于实验室和工厂的定性和定量分析方法。紫外可见吸收光谱测定的是溶液样品，而不是粉末样品。因此，可以获得更准确和重复性更高的结果。但是，如果将紫外-可见吸收光谱法直接用于测定像奶制品这样的复杂样品，它会受到来自基质的严重干扰。因此，以往常需要费时、繁重的化学分离。化学计量学可以使光谱技术在样品不经过复杂的化学分离的条件下进行分析，它已被广泛地用于很多领域。但到目前为止，利用紫外-可见吸收光谱结合化学计量学同时测定三聚氰胺和二聚氰胺的含量还未见报道。
发明内容
本发明一种测定奶制品中三聚氰胺和/或二聚氰胺含量的方法，首先利用紫外可见分光光度计采集校正集奶样品溶液的原始光谱图，使用一些常见的光谱预处理方法对原始光谱进行预处理，再通过一些化学计量学方法进行模型回归，最后通过模型预测未知奶样品中的三聚氰胺和二聚氰胺含量。在此基础上，针对现有对三聚氰胺和二聚氰胺的检测方法存在的耗时长、操作繁琐、成本昂贵等问题，结合在盐酸中使用硅胶沉淀离心除去样品基质的简单前处理，建立了一种简单、快速、灵敏、准确检测奶制品中三聚氰胺和二聚氰胺的方法。
在没有其他特别说明的情况下，对本申请相关文件中出现的名词做出如下约定：
化学计量学方法：化学计量学是一门应用数学、统计学和计算机技术的原理和方法来处理化学数据的学问，它是分析化学的三级学科，化学计量学可以优化化学量测过程，并从化学量测数据中最大限度地提取有用的化学信息，与其他以理论计算的化学分支如量子化学不同的是，化学计量学是以化学实验数据为基础的学科，其一切理论和方法都是建立在试验数据的基础上的。具体到本申请中，涉及到偏最小二乘法、支持向量机法和最小二乘支持向量机法。
校正集：化学计量学中用于模型建立的数据集。
预测集：化学计量学中用于模型预测的数据集。
化学参考值：真实含量的参考值。
加标量：即为待测组分的标准添加量。
测定三聚氰胺和双氰胺含量的常规方法：GB/T 22388–2008中的HPLC法用于样品中三聚氰胺的测定，H点标准添加法用于样品中双氰胺的测定。
本发明的方法由下列技术方案组成：待测样品经过在酸性条件下，优选氢离子浓度1.5mol/L的酸性环境，采用薄层色谱硅胶沉淀，离心除去蛋白质等基质沉淀物，得到上清液,在一定的酸度下用紫外分光光度计采集样品的原始光谱,使用常见的光谱预处理方法(Savitzky-Golay三片段零多项式平滑(Smoothing-SG)、面积常态化法(Nor)、标准正态变换(SNV)、多元散射校正(MSC)、一阶导数Savitzky-Golay变化(1d+SG)和二阶导数Gap-Segment变化(2d+GS))对原始光谱进行适当的预处理，再通过化学计量学方法(偏最小二乘法、支持向量机法和最小二乘支持向量机法等)对校正集样品建立紫外吸收光谱与化学参考值相关关系的预测模型，最后通过模型预测未知样品中的三聚氰胺和二聚氰胺含量。
该方法的具体实施步骤如下：0.72g奶粉和28mL蒸馏水加入到50mL的离心管中，在超声波水浴中超声处理5min，使其充分溶解(或用22mL蒸馏水稀释6mL的液态奶)，然后加入12mL盐酸(5mol/L)，涡流混合5min，最后再加入2.4g硅胶。将该混合物涡流混合5min，然后在4000rpm下离心3min，得奶样上清液。取所得上清液适量，加入不同比例的三聚氰胺和二聚氰胺的标准溶液，并用蒸馏水将该混合物稀释至5ml。以水为参比，1cm光程的比色皿在紫外-可见分光光度计扫描记录样品的紫外吸收光谱(200～290nm)。使用一些常见的光谱预处理方法(Savitzky-Golay三片段零多项式平滑(Smoothing-SG)、面积常态化法(Nor)、标准正态变换(SNV)、多元散射校正(MSC)、一阶导数Savitzky-Golay变化(1d+SG)和二阶导数Gap-Segment变化(2d+GS))对原始光谱进行预处理，再通过一些化学计量学方法(偏最小二乘法、支持向量机法和最小二乘支持向量机法)进行模型回归，最后通过模型预测样品中的三聚氰胺和二聚氰胺含量。
本发明一种测定奶制品中三聚氰胺和/或二聚氰胺含量的方法的有益效果是：该测定方法简便、快速、准确，便于推广应用。本方法在具体使用过程中避免了使用有机试剂，有利于环境保护。
附图说明
图1奶粉1#(a)和液态奶4#(b)的288个样品的原始光谱图
具体实施例子
1、奶粉样品
①样品处理
0.72g奶粉和28mL蒸馏水加入到50mL的离心管中，在超声波水浴中超声处理5min，使其充分溶解，然后加入12mL盐酸(5mol/L)，涡流混合5min，最后再加入2.4g硅胶。将该混合物涡流混合5min，然后在4000rpm下离心3min，得奶样上清液。取所得到的上清液适量，加入不同比例的三聚氰胺(0.1～10μg/ml)和二聚氰胺(10～0.1μg/ml)的标准溶液，并用蒸馏水将该混合物稀释至5ml，对每种奶粉总计配制288个样品溶液(24个浓度，每个浓度平行12份)。
②光谱采集
以水为参比，1cm光程的比色皿，在200～290nm波长范围内，用紫外-可见分光光度计测量样品的紫外吸收光谱。
③化学计量学建模
采用①中的方法对奶粉样品1#、2#和3#进行原始光谱采集。使用一些常见的光谱预处理方法(Savitzky-Golay三片段零多项式平滑(Smoothing-SG)、面积常态化法(Nor)、标准正态变换(SNV)、多元散射校正(MSC)、一阶导数Savitzky-Golay变化(1d+SG)和二阶导数Gap-Segment变化(2d+GS))对原始光谱进行预处理，根据均一化原理随机的将样品分为校正集和预测集，再通过一些化学计量学方法偏最小二乘法(PLS)、支持向量机法(SVM)和最小二乘支持向量机法(LS-SVM)对校正集的数据进行模型回归，最后通过模型预测校正集和预测集中样品的三聚氰胺和二聚氰胺含量。
④方法检测限
对奶粉样品而言，在最佳的算法LS-SVM下：三聚氰胺的相对标准偏差RSD＝8.53％，检测限LOD＝14.2mg/kg；二聚氰胺的RSD＝5.31％，LOD＝8.84mg/kg。
2、液态奶样品
①样品处理
用22mL蒸馏水和6mL的液态奶加入到50mL的离心管中，在超声波水浴中超声处理5min，使其充分溶解，然后加入12mL盐酸(5mol/L)，涡流混合5min，最后再加入2.4g硅胶。将该混合物涡流混合5min，然后在4000rpm下离心3min，得奶样上清液。取所得到的上清液适量，加入不同比例的三聚氰胺(0.1～10μg/ml)和二聚氰胺(10～0.1μg/ml)的标准溶液，并用蒸馏水将该混合物稀释至5ml，对每种液态奶总计配制288个样品溶液(24个浓度，每个浓度平行12份)。
②光谱采集
以水为参比，1cm光程的比色皿，在200～290nm波长范围内，用紫外-可见分光光度计测量样品的紫外吸收光谱。
③化学计量学建模
采用①中的方法对奶粉样品1#、2#和3#进行原始光谱采集。使用一些常见的光谱预处理方法(Savitzky-Golay三片段零多项式平滑(Smoothing-SG)、面积常态化法(Nor)、标准正态变换(SNV)、多元散射校正(MSC)、一阶导数Savitzky-Golay变化(1d+SG)和二阶导数Gap-Segment变化(2d+GS))对原始光谱进行预处理，根据均一化原理随机的将样品分为校正集和预测集，再通过一些化学计量学方法偏最小二乘法(PLS)、支持向量机法(SVM)和最小二乘支持向量机法(LS-SVM)对校正集的数据进行模型回归，最后通过模型预测校正集和预测集中样品的三聚氰胺和二聚氰胺含量。
④方法检测限
对液态奶样品而言，在最佳算法SVM下：三聚氰胺的相对标准偏差RSD＝4.97％，检测限LOD＝9.94mg/kg；双氰胺的RSD＝3.46％，LOD＝6.91mg/kg。
表1 PLS，SVM和LS-SVM三种方法测定三聚氰胺的结果
表2 PLS，SVM和LS-SVM三种方法测定二聚氰胺的结果
Claims (4)
1.一种同时测定奶制品中三聚氰胺和二聚氰胺含量的方法，其特征在于整个方法不使用有机溶剂、显色剂；包括如下四个步骤：
步骤一，待测样品预处理：使用离心沉降法对待测样品进行预处理；
步骤二，样品的光谱测定：使用紫外或紫外-可见分光光度计测定经步骤一处理后的、并加入三聚氰胺和二聚氰胺标准溶液的样品的紫外吸收光谱；
步骤三，预测模型的建立：使用化学计量学方法对校正集样品的紫外吸收光谱建立三聚氰胺和二聚氰胺的含量预测模型；
步骤四，待测样品中三聚氰胺和二聚氰胺含量的测定：使用步骤三所述的含量预测模型对预处理之后的待测样品进行三聚氰胺和二聚氰胺含量的测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤一中离心沉降法具体为，将待测样品在氢离子浓度1.5mol/L的酸性条件下使用薄层色谱硅胶进行沉淀处理，然后离心除去沉淀物，得到上清液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤二中紫外吸收光谱的测定为，在一定酸度下采集样品在200-290nm范围内的吸收光谱。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤三中预测模型的建立具体为，利用偏最小二乘法、支持向量机法和最小二乘支持向量机法对校正集样品建立紫外吸收光谱与化学参考值相关关系的预测模型。
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