JP6379286B2 - 原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸とその調製方法及び質量検出方法 - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
- C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
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- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
- C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
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Description
1.母液調製
杜仲葉抽出物(クロロゲン酸=20%)を10kg用意し、50Lになるまで水を加え、10℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を40mg/mlの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でpH値を1.0に調整した。
酢酸エチルを用いて8回抽出した。1回当たりの酢酸エチルの使用量は500Lとし、毎回の抽出前の母液pH値を1.0に調整し、抽出温度は5℃とした。
合わせた抽出液に活性炭5kgを加え、50℃の条件下で2.0h攪拌し脱色した。
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、50℃、真空度−0.08MPaの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約20mg/ml(濃縮液の体積は約90Lとした)となるよう制御した。
濃縮液を0℃の条件下で24h静置し、液温度を0℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
沈降後の濾液を70℃まで加熱し、3.0h攪拌し結晶させ、冷却水で10℃まで冷却し、ろ過して3.3kgの残渣を収集した。
結晶しろ過された結晶体を用意し、酢酸エチル30Lを加えて乳化機内で結晶体粒度が400〜500μmになるまで乳化させ、ろ過して2.8kgの残渣を収集した。
粉砕した残渣を用意し、0℃の氷水2.8Lで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
洗浄した残渣を、80℃、真空度−0.09MPaの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を120メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
(1)生成物重量:1.407kg
(2)含有量:99.56%(乾燥品で計算)
(3)関連物質:3−クマロイルキナ酸0.231%、カフェ酸0.038%
(4)クロロゲン酸移行率:70.04%
1.母液調製
杜仲葉抽出物(クロロゲン酸=60%)を10kg用意し、12.5Lになるまで水を加え、60℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を480mg/mlの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でpH値を3.0に調整した。
酢酸エチルを用いて8回抽出した。1回当たりの酢酸エチルの使用量は125Lとし、毎回の抽出前の母液pH値を3.0に調整し、抽出温度は60℃とした。
合わせた抽出液に活性炭5kgを加え、70℃の条件下で0.5h攪拌し脱色した。
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、70℃、真空度−0.06MPaの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約50mg/ml(濃縮液の体積は約110Lとした)となるよう制御した。
濃縮液を25℃の条件下で12h静置し、液温度を25℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
沈降後の濾液を70℃まで加熱し、0.5h攪拌し結晶させ、冷却水で40℃まで冷却し、ろ過して9.3kgの残渣を収集した。
結晶しろ過された結晶体を用意し、水10Lを加えて乳化機内で結晶体粒度が100〜150μmになるまで乳化させ、ろ過して6.4kgの残渣を収集した。
粉砕した残渣を用意し、0℃の氷水20Lで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
洗浄した残渣を、80℃、真空度−0.09MPaの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を120メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
(1)生成物重量:4.327kg
(2)含有量:99.69%(乾燥品で計算)
(3)関連物質:3−クマロイルキナ酸0.128%、カフェ酸0.040%、クリプトクロロゲン酸0.016%
(4)クロロゲン酸移行率:71.89%
1.母液調製
杜仲葉抽出物(クロロゲン酸=40%)を10kg用意し、15Lになるまで水を加え、25℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を267mg/mlの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でpH値を1.0に調整した。
酢酸エチルを用いて3回抽出した。1回当たりの酢酸エチルの使用量は150Lとし、毎回の抽出前の母液pH値を1.0に調整し、抽出温度は25℃とした。
合わせた抽出液に活性炭1kgを加え、50℃の条件下で2.0h攪拌し脱色した。
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、50℃、真空度−0.08MPaの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約40mg/ml(濃縮液の体積は約90Lとした)となるよう制御した。
濃縮液を25℃の条件下で12h静置し、液温度を25℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
沈降後の濾液を50℃まで加熱し、3.0h攪拌し結晶させ、25℃まで冷却し、ろ過して6.8kgの残渣を収集した。
結晶しろ過された結晶体を用意し、酢酸エチル20Lを加えて乳化機内で結晶体粒度が300〜400μmになるまで乳化させ、ろ過して5.2kgの残渣を収集した。
粉砕した残渣を用意し、25℃の酢酸エチル52Lで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
洗浄した残渣を、70℃、常圧の条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を20メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
(1)生成物重量:2.990kg
(2)含有量:99.47%(乾燥品で計算)
(3)関連物質:3−クマロイルキナ酸0.215%、ネオクロロゲン酸0.009%、カフェ酸0.043%、クリプトクロロゲン酸0.022%
(4)クロロゲン酸移行率:74.35%
1.母液調製
杜仲葉抽出物(クロロゲン酸=40%)を10kg用意し、20Lになるまで水を加え、40℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を200mg/mlの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でpH値を3.0に調整した。
酢酸エチルを用いて8回抽出した。1回当たりの酢酸エチルの使用量は100Lとし、毎回の抽出前の母液pH値を3.0に調整し、抽出温度は40℃とした。
合わせた抽出液に活性炭3kgを加え、60℃の条件下で1.0h攪拌し脱色した。
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、60℃、真空度−0.06MPaの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約50mg/ml(濃縮液の体積は約70Lとした)となるよう制御した。
濃縮液を25℃の条件下で12h静置し、液温度を25℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
沈降後の濾液を60℃まで加熱し、0.5h攪拌し結晶させ、25℃まで冷却し、ろ過して6.3kgの残渣を収集した。
結晶しろ過された結晶体を用意し、研磨機内で結晶体粒度が500μmになるまで研磨した。
研磨粉砕した材料を用意し、70℃の酢酸エチル63Lで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
洗浄した残渣を、30℃、真空度−0.09MPaの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を60メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
(1)生成物重量:2.861kg
(2)含有量:98.93%(乾燥品で計算)
(3)関連物質:3−クマロイルキナ酸0.395%、ネオクロロゲン酸0.020%、カフェ酸脱炭酸物0.040%、カフェ酸0.028%、クリプトクロロゲン酸0.017%、クロロゲン酸メチド0.029%
(4)クロロゲン酸移行率:70.69%
1.母液調製
杜仲葉抽出物(クロロゲン酸=30%)を10kg用意し、30Lになるまで水を加え、25℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を100mg/mlの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でpH値を1.0に調整した。
酢酸エチルを用いて6回抽出した。1回当たりの酢酸エチルの使用量は150Lとし、毎回の抽出前の母液pH値を1.0に調整し、抽出温度は25℃とした。
合わせた抽出液に活性炭3kgを加え、70℃の条件下で1.0h攪拌し脱色した。
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、70℃、真空度−0.08MPaの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約30mg/ml(濃縮液の体積は約90Lとした)となるよう制御した。
濃縮液を25℃の条件下で24h静置し、液温度を25℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
沈降後の濾液を70℃まで加熱し、1.5h攪拌し結晶させ、25℃まで自然冷却し、ろ過して5.8kgの残渣を収集した。
結晶しろ過された結晶体を用意し、酢酸エチル混合液(酢酸エチル:水=99:1)10Lを加えて、乳化機内で結晶体粒度が200〜300μmになるまで乳化させ、ろ過して4.8kgの残渣を収集した。
粉砕した材料を用意し、25℃の酢酸エチル混合液(酢酸エチル:水=99:1)48Lで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
洗浄した残渣を、60℃、真空度−0.09MPaの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を60メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
(1)生成物重量:2.206kg
(2)含有量:99.34%(乾燥品で計算)
(3)関連物質:3−クマロイルキナ酸0.217%、ネオクロロゲン酸0.030%、カフェ酸脱炭酸物0.058%、カフェ酸0.074%
(4)クロロゲン酸移行率:73.05%
1.母液調製
杜仲葉抽出物(クロロゲン酸=50%)を10kg用意し、25Lになるまで水を加え、25℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を200mg/mlの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でpH値を2.0に調整した。
酢酸エチルを用いて4回抽出する。1回当たりの酢酸エチルの使用量は150Lとし、毎回の抽出前の母液pH値を2.0に調整し、抽出温度は25℃とした。
合わせた抽出液に活性炭2kgを加え、60℃の条件下で1.0h攪拌し脱色した。
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、60℃、真空度−0.06MPaの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約50mg/ml(濃縮液の体積は約90Lとした)となるよう制御した。
濃縮液を15℃の条件下で24h静置し、液温度を15℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
沈降後の濾液を60℃まで加熱し、2.0h攪拌し結晶させ、水で10℃まで冷却し、ろ過して9.8kgの残渣を収集した。
結晶しろ過された結晶体を用意し、酢酸エチル混合液(酢酸エチル:水=1:99)10Lを加えて、乳化機内で結晶体粒度が100〜150μmになるまで乳化させ、ろ過して8.2kgの残渣を収集した。
粉砕した材料を用意し、60℃の酢酸エチル混合液(酢酸エチル:水=1:99)48Lで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
洗浄した残渣を、60℃、真空度−0.09MPaの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を60メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
(1)生成物重量:3.563kg
(2)含有量:99.63%(乾燥品で計算)
(3)関連物質:3−クマロイルキナ酸0.096%、ネオクロロゲン酸0.043%、カフェ酸脱炭酸物0.062%、カフェ酸0.049%
(4)クロロゲン酸移行率:71.00%
1.母液調製
杜仲葉抽出物(クロロゲン酸=40%)を10kg用意し、20Lになるまで水を加え、25℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を200mg/mlの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でpH値を2.0に調整した。
酢酸エチルを用いて5回抽出した。1回当たりの酢酸エチルの使用量は100Lとし、毎回の抽出前の母液pH値を2.0に調整し、抽出温度は25℃とした。
合わせた抽出液に活性炭3kgを加え、50℃の条件下で2.0h攪拌し脱色した。
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、50℃、真空度−0.08MPaの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約40mg/ml(濃縮液の体積は約90Lとした)となるよう制御した。
濃縮液を25℃の条件下で12h静置し、液温度を25℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
沈降後の濾液を70℃まで加熱し、1.0h攪拌し結晶させ、水で25℃まで冷却し、ろ過して7.2kgの残渣を収集した。
結晶しろ過された結晶体を用意し、水10Lを加えて、乳化機内で結晶体粒度が100〜150μmになるまで乳化させ、ろ過して5.4kgの残渣を収集した。
粉砕した材料を用意し、5℃の酢酸エチル55Lで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
洗浄した残渣を、60℃、真空度−0.08MPaの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を60メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
(1)生成物重量:2.811kg
(2)含有量:99.52%(乾燥品で計算)
(3)関連物質:3−クマロイルキナ酸0.239%、カフェ酸0.040%
(4)クロロゲン酸移行率:69.94%
1.母液調製
杜仲葉抽出物(クロロゲン酸=40%)を10kg用意し、16.7Lになるまで水を加え、25℃の条件下で攪拌し溶解させ、クロロゲン酸を240mg/mlの割合で含有する水溶液を調合し、塩酸でpH値を1.0に調整した。
酢酸エチルを用いて5回抽出した。1回当たりの酢酸エチルの使用量は134Lとし、毎回の抽出前の母液pH値を1.0に調整し、抽出温度は25℃とした。
合併した抽出液に活性炭2kgを加え、60℃の条件下で1.0h攪拌し脱色した。
脱色後の抽出液から炭素を除去した後、60℃、真空度−0.08MPaの条件下で濃縮を行い、濃縮液中のクロロゲン酸含有量が約40mg/ml(濃縮液の体積は約90Lとした)となるよう制御する。
濃縮液を25℃の条件下で12h静置し、液温度を25℃にして、ろ過し、濾液を収集した。
沈降後の濾液を70℃まで加熱し、1.0h攪拌し結晶させ、水で25℃まで冷却し、ろ過して6.9kgの残渣を収集した。
結晶しろ過された結晶体を用意し、酢酸エチル10Lを加えて、乳化機内で結晶体粒度が200〜300μmになるまで乳化させ、ろ過して5.8kgの残渣を収集した。
粉砕した材料を用意し、5℃の水17.4Lで攪拌して材料を十分に分散させた後、ろ過して残渣を収集した。
洗浄した残渣を、60℃、真空度−0.08MPaの条件下で乾燥させ、ほぼ乾燥した材料を60メッシュのふるいにかけ、同じ条件下で、完全に乾燥するまでさらに乾燥を行った。
(1)生成物重量:3.204kg
(2)含有量:99.78%(乾燥品で計算)
(3)関連物質:3−クマロイルキナ酸0.165%
(4)クロロゲン酸移行率:79.92%
HPLC法とLC−MS法を用いて、原薬クロロゲン酸中に存在する関連物質について分離及び同定を行い、キナ酸、カフェ酸、ネオクロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、3−クマロイルキナ酸、カフェ酸脱炭酸物及びクロロゲン酸メチド等、計7つの主要な関連物質を分離し同定した。
実施例10 本発明の原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸中のクロロゲン酸の検出方法の試験
1)検出波長の選択
移動相溶液(アセトニトリル−0.1%ギ酸 8:92)及び水溶液におけるクロロゲン酸の紫外線スペクトルの特徴はほぼ一致しており、215nm及び323nmの波長付近でいずれも最大吸收が見られた。また、原薬クロロゲン酸の高温破壊サンプルのLC−DAD三次元検出図では、クロロゲン酸及び検出された関連物質は波長215nmと323nm付近でいずれも最大吸收が見られた。そのうち、323nmの波長ではクロロゲン酸及びその類似体の検出感度が高かったが、215nmの波長ではクロロゲン酸及びその類似体を検出できたうえ、さらに末端基のみが紫外線を吸収する不純物の検出に有利であった。323nmの波長では、移動相の関連物質検出に対する目立った干渉は見られず、215nmの波長では、溶剤のピークが比較的明らかでありながら、溶剤のピーク付近の関連物質検出に対して目立った干渉が見られなかった。従って、原薬クロロゲン酸の品質コントロールにおいて、215nmの波長をクロロゲン酸関連物質検査の検出波長とした。スペクトル図及びクロマトグラムは図1〜4を参照。
(ア)移動相の選択 異なる有機相(アセトニトリル、メタノール)、異なる酸により組成された移動相がクロロゲン酸及びその関連物質を分離するクロマトグラフィ動作について、それぞれ考察し、成分中の分離困難なペア(クロロゲン酸とカフェ酸)の分離度と分析時間を評価指標として、異なる移動相の分離効果について評価を行った。
1クロマトグラフィ条件の選択とシステム適合性試験
クロロゲン酸関連物質の研究において決定した検出波長、移動相、カラムは、本品と関連物質を完全に分離することができ、且つ理論段数はクロロゲン酸のピークに基づいた計算で3000を上回り、クロロゲン酸含有量の測定要求を満たす。よって215nmを検出波長とし、オクタデシル基結合シリカを填充剤とし、0.1%ギ酸−アセトニトリル(92:8)を移動相とすることとして、含有量の測定と研究を進めた。
試験液の調製:原薬クロロゲン酸を適量用意し、精密に秤量し、移動相を加えて溶解させ、希釈して1ml当たり約10μg含有する溶液を作り、試験液とした。
クロロゲン酸標準品を約12mg用意し、精密に秤量し、移動相を加え、溶解させて希釈し、125、75、50、25、12.5、2.50、0.25μg/mlの一連の溶液を作った。一連の溶液を10μlずつ精密に秤取し、それぞれ液体クロマトグラフ装置に注入して、クロマトグラムを記録した。クロロゲン酸ピーク面積を縦軸に、対応する濃度を横軸とし、線形回帰を行って、線形方程式を得た。結果は表7を参照。
直線性の研究における低濃度溶液(0.25μg/ml)を用意し、徐々に希釈して投入した。信号雑音比法によって、S/N≧3で測定されたクロロゲン酸検出量は0.625ngであり、S/N≧10で測定されたクロロゲン酸検出量は2.5ngであった。よって、クロロゲン酸の検出限界は0.625ng、定量限界は2.5ngと確認した。クロマトグラムは図6、7を参照。
本品を適量用意し、移動相を加えて溶解させ、希釈して、1ml当たり約78.00μgのクロロゲン酸を含有するストック溶液を作った。9つの10mlメスフラスコにストック溶液を1.0mlずつ取って、低、中、高の3グループに分け、それぞれに濃度が50μg/ml、62.5μg/ml、75μg/mlのクロロゲン酸標準液を1.0ml投入し、移動相を加え、目盛まで希釈して試験液とした。この試験液を10μlずつ精密に秤取し、それぞれ液体クロマトグラフ装置に注入して、クロマトグラムを記録し、以下の式でサンプル投入回収率を計算した。結果は表8を参照。
本品を適量用意し、精密に秤量して移動相を加え、低、中、高(約10、12、15μg/ml)の3種類の濃度の試験液をそれぞれ3つずつ作った。試験液と標準液(12.5μg/ml)をそれぞれ10μlずつ精密に秤取して液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録して、各グループの含有量の相対標準偏差(RSD%)を計算した。結果は表9を参照。
上記再現性の実験結果から、本品の3つの濃度勾配の精度はいずれも良好であり、試験液の濃度が9.6〜14.4μg/mlの間で、所定の方法で測定した場合、検出結果はいずれも良好な精度に達することができる、ということがわかった。
異なる時間、異なる人員、異なる設備の条件のもとで中間精度の実験を行った。本品を適量用意し、精密に秤量して移動相を加え、低、中、高の3種類の濃度の試験液(計18のサンプル)を作った。各試験液を10μlずつ精密に秤取して、液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録した。低、中、高濃度それぞれのグループの含有量の相対標準偏差(RSD%)と総相対標準偏差(RSD%)を計算した。結果は表10を参照。
同一の試験液を用意し、一定の時間を空けてそれぞれサンプル投入し、ピーク面積を記録した。測定結果は表11を参照。RSD=2.30%は、被測定溶液が24時間以内で安定していることを示している。
中国薬典2000年版二部付録XIX A「薬品品質標準分析法の検証」の要求に従って、カラムのメーカーとロット番号、移動相の組成、カラム温度、波長等が変化する条件での、測定方法に対する影響を考察した。
上記試験液について、同一タイプでメーカーが異なるカラムを用いて、それぞれ含有量を測定した。結果は表12を参照。異なるメーカーのC18カラム(150mm×4.6mm、5μm)を用いて測定したところ、保持時間ではわずかに差が見られたが、理論段数はいずれも要求を満たしており、含有量の結果には明らかな差がなかったことを示している。
上記試験液について、比率の異なる移動相でそれぞれ含有量を測定した。結果は表13を参照。比率の異なる移動相という条件において、理論段数はいずれも要求を満たし、含有量の結果に明らかな差はなかったことを示している。よって、移動相の比率の微小な変化が含有量の測定に及ぼす影響は大きくない。
上記試験液について、異なるカラム温度でそれぞれ含有量を測定した。結果は表14を参照。異なるカラム温度という条件において、理論段数はいずれも要求を満たし、含有量の結果に明らかな差はなかったことを示している。従って、カラム温度が含有量の測定に与える影響は大きくない。
上記試験液について、215nmと323nmの波長でそれぞれ含有量を測定した。結果は表15を参照。2つの検出波長という条件下で、理論段数はいずれも要求を満たし、含有量の結果に明らかな差は見られない。
11サンプルの含有量測定結果
上記方法により、実施例の各サンプルについて、それぞれクロロゲン酸の含有量を測定した。結果は表16を参照。
本品の関連物質を詳細に知り、研究するため、上記のクロマトグラフィ条件で原薬クロロゲン酸の関連物質について分離及び同定を行った。
1)機器と試薬
LC−6A高速液体クロマトグラフ装置、SPD−10Avp紫外可視検出器、N2000クロマトグラフィワークステーション。
カフェ酸は、上記で決定した関連物質の分離と検出の条件において、保持時間が適度で、隣接する成分(クロロゲン酸)とは完全に分離されており、カフェ酸の定量測定の要求を満たすことができた。よって上記決定された関連物質の分離及び検出の条件を、カフェ酸検査のクロマトグラフィ条件とした。
カフェ酸標準品を精密に適量秤取し、移動相を加えて1ml当たり2μg含有する溶液になるよう定量に希釈し、標準液とした。
本品を適量用意し、精密に秤量し、移動相を加えて1ml当たり0.5mg含有する溶液を作り、試験液とした。
標準液と試験液をそれぞれ20μlずつ精密に吸い取って、液体クロマトグラフ装置に注入し、ピーク面積を測定して、外部標準法で計算した。
(ア)特異性の考察
上記決定したクロマトグラフィ条件が本品の関連物質を効果的に検出できるか考察し、この検査方法の特異性を検証した。そのため、原薬に対して強制破壊実験を行い、原薬の分解生成物について考察した。
カフェ酸標準品を適量用意し、精密に秤量し、移動相を加えて1ml当たり0.01mg含有するストック溶液を作った。ストック溶液をそれぞれ適量用意して、移動相を用いて希釈し、濃度が4.0、3.0、2.0、1.0、0.5、0.05μg/mlの一連の溶液を作った。上記溶液を20μlずつ精密に秤取して、液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録した。カフェ酸のピーク面積を縦軸に、濃度を横軸とし、回帰を行って線形方程式を得た。結果は表17を参照。
直線性の研究における低濃度溶液(0.05μg/ml)を用意し、徐々に希釈して投入した。信号雑音比法によって、S/N≧3のとき、カフェ酸の検出限界であると確認し、0.3ngであった。S/N≧10のとき、カフェ酸の定量限界であると確認し、1ngであった。クロマトグラムは図10、11を参照。
原薬クロロゲン酸(0.09%のカフェ酸を含む)を適量用意し、精密に秤量し、移動相を加えて1ml当たり約500μgのクロロゲン酸を含有するストック溶液を作った。ストック溶液を1.0ml取って9つの10mlメスフラスコに入れ、2、4、6μg/mlのカフェ酸標準液1.0mlをそれぞれ添加し、移動相を加えて目盛まで希釈し、試験液とした。別途、直線性の研究項におけるカフェ酸標準液(0.5μg/ml)を用意し、標準液とした。標準液と試験液をそれぞれ20μlずつ精密に秤取して液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラムを記録した。標準曲線の方程式により測定量を計算し、さらに回収率を計算した。結果は表18を参照。
原薬クロロゲン酸を約0.35、0.50、0.65g、それぞれ3部ずつ用意し、精密に秤量して、100mlメスフラスコに入れ、移動相を加えて溶解させ、目盛まで希釈し、さらに1mlを精密に秤取して10mlフラスコに入れ、移動相で目盛まで希釈して試験液とした。別途適量のカフェ酸標準品を用意し、精密に秤量し、移動相を加えて1ml当たり0.5μg含有する溶液を作って標準液とした。試験液と標準液をそれぞれ20μlずつ精密に秤取して液体クロマトグラフ装置に注入し、クロマトグラフィのピーク面積を記録して、外部標準法で含有量及び相対標準偏差(RSD%)を計算した。結果は表19を参照。
上記再現性の実験結果から、本品の3つの濃度勾配の精度はいずれも良好であり、試験液中のカフェ酸濃度が0.32〜0.61μg/mlの間で、所定の方法で測定した場合、検出結果はいずれも良好な精度に達することができる、ということがわかる。
再現性の項に従って、低、中、高の試験液を調合した。別途カフェ酸標準品を適量用意し、移動相を加えてカフェ酸を0.5μg/mlの割合で含有する溶液を作り、標準液とした。カフェ酸クロマトグラフィ条件に照らし、異なる人員、異なる時間、異なるクロマトグラフ装置で検出を行い、クロマトグラフィのピーク面積を記録した。1点法によって測定量を計算し、さらに相対標準偏差RSDを計算した。結果は表20を参照。
中国薬典2000年版二部付録XIX A「薬品品質標準分析法の検証」の要求に従って、カラムのメーカーとロット番号、移動相の組成、カラム温度等が変化する条件での、検出方法に対する影響を考察した。
上記検査方法により、試験品についてカフェ酸の検査を行った。結果は表24を参照。
原薬クロロゲン酸中のその他関連物質は、ネオクロロゲン酸、クリプトクロロゲン酸、3−クマロイルキナ酸、クロロゲン酸メチド及びその他同定されていない関連物質を含み、これら関連物質には法定の標準品がないため、いずれもクロロゲン酸主成分自身対照法で研究を行った。
LC−6A高速液体クロマトグラフ装置、SPD−10Avp紫外可視検出器、N2000クロマトグラフィワークステーション。
試剤:アセトニトリルはクロマトグラフィグレード、ギ酸は分析グレードとし、水は自製した再蒸留水とした。
カフェ酸のクロマトグラフィ条件及びシステム適合性試験は、その他関連物質を十分に分離し検出することができるため、その他関連物質の検出条件をカフェ酸と一致させることとした。
原薬クロロゲン酸を適量用意し、精密に秤量し、移動相を加えて1ml当たり0.5mg含有する溶液を作って試験液とした。
試験液を1.0ml精密に秤取して100mlメスフラスコに入れ、移動相を加えて目盛まで希釈し、希釈試験液とした。
希釈試験液を20μl精密に秤取して液体クロマトグラフ装置に注入し、クロロゲン酸主成分のピークがフルスケールの10〜20%となるように検出器の感度を調節した。そして上記試験液と希釈試験液を20μlずつ精密に秤取して液体クロマトグラフ装置に注入し、クロロゲン酸のピーク保持時間の3倍以上までクロマトグラムを記録した。試験液のクロマトグラムにおいてカフェ酸以外のその他不純物のピークが見られた場合は、その他各不純物のピーク面積と希釈試験液の主ピーク面積の比を計算し、その他関連物質の含有量を得て、その他関連物質の合計を計算した。
(ア)特異性の考察 カフェ酸の特異性考察の結果と同じ。
原薬クロロゲン酸を適量用意し、移動相を加えて1ml当たり1mg含有する溶液を作って試験液とした。試験液を徐々に希釈して投入し、クロマトグラムを記録した。ピーク面積が最小の関連物質を考察対象とし、信号雑音比(S/N)≧3のときにサンプルを注入した濃度を、その他関連物質の検出限界とした。
上記関連物質の検出方法に基づいて、実施例における各生成物について、それぞれ関連物質の検出を行った。結果は表25、図13〜図20を参照。
Claims (2)
- クロロゲン酸の含有量が98重量%以上、不純物の含有量が1.9重量%以下であり、不純物には3−クマロイルキナ酸が含まれ、3−クマロイルキナ酸は、原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の総重量に対して0.1〜0.5%を占める原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調整方法であって、以下のステップa〜iを含むことを特徴とする原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調整方法。
a.母液調製:クロロゲン酸含有量が20重量%〜60重量%の杜仲葉抽出物を用意し、クロロゲン酸の濃度を40mg/ml〜480mg/mlに調合し、調合温度を10℃〜60℃、pH=1.0〜3.0とする、
b.抽出:酢酸エチルを用いて抽出し、抽出回数は3〜8回、抽出1回当たりの酢酸エチルの使用量は母液体積の5〜10倍、毎回の抽出前の母液pHは1.0〜3.0とし、抽出温度は5℃〜60℃とする、
c.脱色:ステップbの抽出物に漂白のために活性炭を加え、活性炭の使用量は粗生成物の質量の0.1〜0.5倍とし、脱色温度は50℃〜70℃、脱色時間は0.5h〜2.0hとする、
d.濃縮:ステップcの脱色後の抽出液から炭素を除去した後、減圧下および低温下で濃縮し、濃縮温度は50℃〜70℃、真空度は−0.06〜−0.08MPaとし、濃縮液のクロロゲン酸含有量を20mg/ml〜50mg/mlに制御する、
e.沈降:ステップdの濃縮液を冷却して沈降させ、沈降温度は0℃〜25℃、沈降時間は12h〜24hとする、
f.結晶:ステップeの沈降後の溶液を加熱し、攪拌して冷却し、結晶させ、結晶温度は50℃〜70℃、結晶時間は0.5h〜3.0hとし、結晶後、10℃〜40℃まで冷却する、
g.粉砕:ステップfの結晶物を乳化又は研磨粉砕し、粉砕後の結晶体の粒度は100μm〜500μmとし、粉砕の過程で溶剤は使用してもしなくてもよく、溶剤の種類は酢酸エチル、水又は体積比1%〜99%の酢酸エチルと水との混合液とする、
h.洗浄:ステップgの粉砕後の結晶物を酢酸エチル、水又は1%〜99%の比率の酢酸エチルと水との混合液で洗浄し、洗浄溶剤の使用量は、材料の質量の数値の1〜10倍の数値の体積とし、温度は0℃〜70℃とし、洗浄を行う、
i.乾燥:ステップhで洗浄した結晶物を乾燥させ、乾燥温度は30℃〜80℃、乾燥真空度は常圧〜−0.09MPaとする。 - 請求項1において、
下記のステップa〜iを含んで調製されることを特徴とする原料クロロゲン酸又は原薬クロロゲン酸の調製方法。
a.母液調製:クロロゲン酸の含有量が40重量%の杜仲葉抽出物を用意し、濃度60重量%の粗生成物水溶液を調合し、クロロゲン酸の濃度は240mg/ml、調合温度は25℃、pH=1.0とする、
b.抽出:酢酸エチルを用いて抽出し、抽出回数は5回、抽出1回当たりの酢酸エチルの使用量は母液体積の8倍、毎回の抽出前の母液pHは1.0とし、抽出温度は25℃とする、
c.脱色:ステップbの抽出物に漂白のために活性炭を加え、活性炭の使用量は粗生成物の質量の0.2倍とし、脱色温度は60℃、脱色時間は1.0hとする、
d.濃縮:ステップcの脱色後の抽出液から炭素を除去した後、減圧下および低温下で濃縮し、濃縮温度は60℃、真空度は−0.08MPaとし、濃縮液のクロロゲン酸含有量を40mg/mlに制御する、
e.沈降:ステップdの濃縮液を冷却して沈降させ、沈降温度は25℃、沈降時間は12hとする、
f.結晶:ステップeの沈降後の溶液を加熱し、攪拌して冷却し、結晶させ、結晶温度は70℃、結晶時間は1.0h、結晶終了温度は25℃とする、
g.粉砕:ステップfの結晶物を乳化又は研磨粉砕し、粉砕後の結晶体の粒度は200μm〜300μmとし、粉砕の過程で酢酸エチル溶剤を使用する、
h.洗浄:ステップgの粉砕後の結晶物を水で洗浄し、水の使用量は材料の質量の数値の3倍の数値の体積とし、水の温度は5℃とする、
i.乾燥:ステップhで洗浄した結晶物を乾燥させ、乾燥温度は60℃、乾燥真空度は−0.08MPaとする。
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