CN103145729A - 银杏内酯b化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种银杏内酯B化合物，所述银杏内酯B化合物从银杏叶中提取获得，所述银杏内酯B化合物中含有微量的银杏内酯A’，所述银杏内酯B的含量大于99%，所述银杏内酯A’的含量低于0.4%。本发明还涉及该银杏内酯B化合物的制备方法，包括：在搅拌条件下加入硅藻土、银杏叶提取物，于73-80℃加热回流1.5-2.5h，过滤，浓缩；再加入蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为60～70%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇和乙酸乙酯重结晶，得成品银杏内酯B化合物。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种银杏内酯B化合物及其制备方法。
背景技术
银杏内酯B，英文名Ginkgolide B；分子式：C20H24O10；分子量：424.40。
银杏内酯B是一种活性强的血小板活化因子（PAF）拮抗剂，能竞争性地与PAF受体结合，抑制PAF的作用；因此，凡涉及与PAF相关的病症，如：血栓形成、脑组织损伤、器官移植排斥、急性炎症、心脏过敏、细胞内毒素及IgG导致的休克等，银杏内酯B均有一定疗效。
但迄今为止，国内外均未有银杏内酯B单一成分为原料的制剂上市。根据我国《药品注册管理办法》中化学药品注册分类该药品属于化学药品中“未在国内外上市销售的药品”下的“天然物质中提取或者通过发酵提取的新的有效单体及其制剂”，属于化学药品1.2类。
CN101182325A涉及一种静脉给药银杏内酯B及提取方法，其中银杏内酯B含量≥97%,银杏酸≤2PPM,白果内酯未检出,可以直接作为静脉注射或静脉滴注原料药;提取采用叶干重8～25倍量、浓度为5%-30%乙醇水溶液回流提取若干次,过滤分离;将滤液浓缩至原体积的0.05～0.2倍量,加入吸附剂在搅拌状态下充分吸附,过滤,滤饼用3～10倍量乙醇回流提取若干次,合并提取液,浓缩至原体积的0.01～0.2倍量,静置析晶,过滤得银杏内酯;银杏内酯用10～50倍量的甲醇进行重结晶若干次,析晶温度-10℃～-25℃,过滤结晶、干燥,得银杏内酯B。
CN101412725A公开一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法,其步骤如下:1)取银杏叶,用由高到低不同浓度的乙醇进行提取,合并提取液,回收乙醇,得到浓缩后的提取液;2)向浓缩后的提取液中加入乙酸乙酯萃取,回收有机相后浓缩至浸膏;3)将步骤2)所得浸膏稀释后上选择性极性无孔吸附树脂柱,用乙醇洗脱,所得洗脱液回收乙醇后,再用乙醇结晶得到银杏内酯类组合物;4)将银杏内酯类组合物结晶上硅胶柱,用正己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱,收集洗脱液,得到富集银杏内酯B的洗脱液;5)回收步骤4)中收集的洗脱液中的溶剂,再用乙醇结晶,得到银杏内酯B单体。
CN1680392A涉及采用高速逆流色谱法(HSCCC)从银杏叶中分离一种高纯度银杏内酯的制备方法。用三个溶剂体系,分别经过两次HSCCC分离后,可得到银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯,纯度均达到99%以上。
目前，药用的银杏内酯B主要从银杏叶中提取，但由于银杏内酯B在银杏叶中的含量极低，且银杏内酯B与银杏内酯A’以及银杏酸、白果内酯共同存在，各单体结构又极为相似，极性差异很小，从银杏叶中提取高纯度的银杏内酯B单体较为困难，特别是将银杏内酯B与银杏内酯A’的分离较为困难。上述专利以及现有技术中提取的银杏内酯B的纯的不够高，且银杏内酯B溶解性差，因此只能作为口服用药原料而不能作为注射剂的原料药，而口服给药的生物利用度较低，不能充分发挥银杏内酯B的药效，采用注射剂可极大提高其生物利用度，且临床适用人群——缺血性脑病病人，包括急性缺血性中风脑梗塞的病人治疗时间窗窄，且需快速起效，一般口服制剂相对于注射剂起效慢，而制成注射剂后给药起效迅速，另外，缺血性脑病病人可能会存在口服药物吞咽困难，制成注射剂则不存在吞咽困难的问题。但注射剂对银杏内酯B的纯度要求非常高，因此，提供一种高纯度的银杏内酯B组合物具有非常重要的意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于克服现有技术的不足，提供一种银杏内酯B化合物，所述银杏内酯B化合物中银杏内酯B的含量较高。
本发明的第二目的在于提供一种上述银杏内酯B化合物的制备方法。
为了实现本发明的目的，特采用如下技术方案：
一种银杏内酯B化合物，所述银杏内酯B化合物从银杏叶中提取获得，所述银杏内酯B化合物中含有微量的银杏内酯A’，所述银杏内酯B的含量大于99%，所述银杏内酯A’的含量低于0.4%，所述的银杏内酯B化合物的结构式为：
所述的银杏内酯A'为1,10-二羟基银杏内酯。
银杏内酯A’与银杏内酯B的结构极为相似，二者极性差异很小，从银杏叶中提取的银杏内酯B化合物中银杏内酯A'的含量较高，要获得高含量的银杏内酯B较为困难。本发明提供的银杏内酯B化合物是从天然药物银杏叶中提取、分离、精制而成，其中银杏内酯B的纯度大于99%，与现有技术相比，纯度非常高，并且银杏内酯A'的含量非常低，可作为注射制剂的原料药，极大地提高了银杏内酯B的生物利用度，并且，银杏内酯B化合物中杂质的种类和含量对银杏内酯B的稳定性也有较大影响，本发明提供的银杏内酯B化合物中的杂质种类少、含量低，相对于现有技术具有更好的稳定性，且本品的质量研究和稳定性试验结果表明本品质量可控、稳定，可作为注射制剂的原料药，为本品临床应用提供良好的有效性和安全性和质量可控性的基础，极大地提高了患者的用药安全。
优选的，所述银杏内酯B的含量大于99.6%，所述银杏内酯A’的含量低于0.3%。
优选的，所述银杏内酯B化合物中不含白果内酯。本发明提供的银杏内酯B化合物中，杂质的种类少、含量低，质量可控，是一种性能优良的注射制剂的原料药，且杂质对银杏内酯B的稳定性的影响较小。
优选的，所述银杏内酯B化合物中总银杏酸的含量小于0.12ppm。
本发明参考《中国药典》2010年版一部银杏叶提取物项下总银杏酸限度测定方法，对原料测定的结果表明，本品含总银杏酸的量小于0.12ppm，远低于银杏叶提取物总银杏酸不得过百万分之十的限度规定，本发明提供的银杏内酯B是安全而有效的。
本发明中，所述银杏内酯B化合物的甲醇溶液在20℃时的比旋度为-57°～-61°。
银杏内酯B在无水乙醇下的溶解度较甲醇低，配制成10mg/ml的浓度较困难，而5mg/ml的旋光度数值较低，误差增大，因而选用甲醇为溶剂，配制成10mg/ml的溶液，在20℃时测定的比旋度为-57°～-61°。本发明的银杏内酯B化合物的比旋度比《中国药典》中规定的银杏内酯B化合物的比旋度为-48°至-63°的范围窄了很多，说明本发明提供的银杏内酯B具有非常高的纯度。
本发明还提供了一种所述的银杏内酯B化合物的制备方法，包括：
（1）在搅拌条件下向乙酸乙酯中先加入硅藻土，再加入银杏叶提取物，加热回流1.5-2.5小时，过滤，浓缩；加入硅藻土的量为银杏叶提取物重量的0.8-1.2倍，乙酸乙酯与银杏叶提取物的液固比为15-20ml/g；
（2）再加入蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液；
（3）洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为60～70%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；
（4）粗结晶依次用乙醇和乙酸乙酯重结晶，得成品银杏内酯B化合物。
本发明采用乙酸乙酯从银杏叶提取物中提取银杏内酯B，将银杏叶提取物加至乙酸乙酯中，会形成大量粘度大的物质，不利用后续工艺及清场的工艺，因此加入硅藻土有助于银杏叶提取物在乙酸乙酯中的分散；当进行大量提取时，直接将硅藻土与银杏叶提取物进行混合，不利于银杏叶提取物的分散与混匀，因此在提取罐中加入乙酸乙酯后，在搅拌条件下先加入硅藻土，再加入银杏叶提取物，银杏叶提取物能较快地在乙酸乙酯中分散均匀，有利于银杏内酯B在乙酸乙酯中的溶出，提高粗品中银杏内酯B的含量。
上述制备方法的步骤（1）中，所述的银杏叶提取物为从银杏叶中提取获得，提取方法可参考现有技术中的任何一种方法，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动。
步骤（1）获得的浓缩液有析出物，析出物影响柱层析，因此步骤（2）中在进行柱层析之前先于浓缩液中加水萃取，可使析出物溶于水，分去水层，有利于去除浓缩液中的大量杂质，以及在去掉析出物的同时降低浓缩液的粘度，更有利于后续的柱层析工艺。
从银杏叶中提取制备银杏内酯B，制备方法不同，得到的化合物中银杏内酯B的含量以及其中杂质的种类和含量差异巨大，本发明通过大量的实验，对银杏内酯B的提取制备方法不断进行改进和优化，特别包括对溶剂与色谱柱的选用、以及对整个提取路线的设计，最终得到了一个制备高含量银杏内酯B的化合物的制备方法，且得到的银杏内酯B化合物中杂质的种类少，含量低，经HPLC-ELSD测定，银杏内酯B化合物单体的纯度达到99%以上，银杏内酯A'的含量低于0.4%，可以作为注射制剂的原料药，极大地提高了患者的用药安全。另外，该方法简单易操作、制备周期短，极大地降低了从银杏叶中制备银杏内酯B化合物的成本，进一步降低了含有该银杏内酯B化合物制剂的成本。
上述制备方法的步骤（4）中，粗结晶依次用乙醇重结晶3次以上、乙酸乙酯重结晶1次以上，得到的成品中银杏内酯B的含量大于99.6%，所述银杏内酯A'的含量低于0.3%。
所述步骤（1）中，优选的，加入硅藻土的量为银杏叶提取物重量的0.9-1.1倍；乙酸乙酯与银杏叶提取物的液固比为16-18ml/g。
所述步骤（1）中，优选的，于73-80℃加热回流1.5-2小时。
所述步骤（1）中，优选的，滤液浓缩至液固比为3-5ml/g。
所述步骤（2）中，优选的，酸性氧化铝柱的径高比为1：4～1：10，酸性氧化铝为200～300目，上样量与氧化铝的重量比为1：7～10，洗脱速度为1/4～1/2BV/h；更优选的，所述酸性氧化铝柱的径高比为1：4～1：7，上样量与氧化铝的重量比为1：8。
通过上述优选的技术方案，本发明获得银杏内酯B成品中不含白果内酯，总银杏酸的含量小于0.12ppm。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的银杏内酯B化合物中，银杏内酯B的含量非常高，杂质的种类少、含量低，特别是银杏内酯A’的含量非常低，可作为注射剂的原料药，提高了原料药的生物利用度以及患者的用药安全。
另外，本发明提供的银杏内酯B化合物的制备方法简单易操作，特别是硅藻土的采用，有利于后续的柱层析工艺的进行，提高了制备的效率，降低了制备的成本。
具体实施方式
银杏内酯及白果内酯的色谱测定方法采用HPLC-ELSD色谱方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇/四氢呋喃(2:1)：水=32：68为流动相，蒸发光散射检测器检测（参考条件：Alltech3300：漂移管温度60℃，空气流速1.5L/min，增益为8；Agilent380-LC：雾化温度30℃，漂移管温度50℃，载气流量1.5SLM，PMT增益为8)。积分方法：面积外标法。
总银杏酸的含量测定参考《中国药典》2010年版一部银杏叶提取物项下总银杏酸限度测定方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-四氢呋喃-水（22：10：68）为流动相；用蒸发光散射检测器检测（参考条件：Alltech3300：漂移管温度60℃，空气流速1.5L/min，增益为8；Agilent380-LC：雾化温度30℃，漂移管温度50℃，载气流量1.5SLM，PMT增益为8)。积分方法：面积外标法。
比旋度的测定方法参考《中国药典》2010年版附录VI E，参考条件：WZZ-3自动旋光仪溶剂：甲醇溶液，浓度：10mg/ml，温度：20℃。
实施例1
银杏内酯B化合物的制备：
在搅拌条件下向750ml乙酸乙酯中先加入硅藻土40g，再加入银杏叶提取物50g，于80℃加热回流2.5小时，过滤，浓缩，滤液浓缩至液固比为5ml：1g；；往浓缩液中加入约1/10体积的蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，酸性氧化铝柱的径高比为1：4，氧化铝为200目，上样量与氧化铝的重量比为1：7，用水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为1/4BV/h，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为60%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇和乙酸乙酯重结晶，得成品银杏内酯B化合物。样品检测银杏内酯B含量为99.0%，银杏内酯A’的含量为0.4%。成品的比旋度为-61°。
实施例2
银杏内酯B化合物的制备：
在搅拌条件下向1000ml乙酸乙酯中先加入硅藻土40g，再加入银杏叶提取物50g，于73℃加热回流1.5小时，过滤，浓缩，滤液浓缩至液固比为4ml：1g；往浓缩液中加入约1/9体积的蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，酸性氧化铝柱的径高比为1：4，氧化铝为200目，上样量与氧化铝的重量比为1：7，用水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为1/4BV/h，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为60%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇重结晶3次和乙酸乙酯重结晶1次，得成品银杏内酯B化合物。样品检测银杏内酯B含量为99.6%，银杏内酯A’的含量为0.3%。成品的比旋度为-59.3°。
实施例3
银杏内酯B化合物的制备：
在搅拌条件下向850ml乙酸乙酯中先加入硅藻土60g，再加入银杏叶提取物50g，于75℃加热回流2小时，过滤，浓缩，滤液浓缩至液固比为3ml：1g；往浓缩液中加入约1/11体积的蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，酸性氧化铝柱的径高比为1：10，氧化铝为300目，上样量与氧化铝的重量比为1：10，用水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为1/2BV/h，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为70%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇重结晶3次和乙酸乙酯重结晶1次，得成品银杏内酯B化合物。样品检测银杏内酯B含量为99.7%，银杏内酯A’的含量为0.3%。白果内酯未检出，总银杏酸的含量为0.12ppm，银杏内酯A’的含量为0.3%。成品的比旋度为-57.8°。
实施例4
银杏内酯B化合物的制备：
在搅拌条件下向900ml乙酸乙酯中先加入硅藻土45g，再加入银杏叶提取物50g，于78℃加热回流1.5小时，过滤，浓缩，滤液浓缩至液固比为3.5ml：1g；往浓缩液中加入约1/10体积的蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，酸性氧化铝柱的径高比为1：7，氧化铝为300目，上样量与氧化铝的重量比为1：8，用水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为1/2BV/h，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为70%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇重结晶3次和乙酸乙酯重结晶1次，得成品银杏内酯B化合物。样品检测银杏内酯B含量为99.8%，银杏内酯A’的含量为0.2%。白果内酯未检出，总银杏酸的含量为0.12ppm。成品的比旋度为-58.4°。
实施例5
银杏内酯B化合物的制备：
在搅拌条件下向900ml乙酸乙酯中先加入硅藻土55g，再加入银杏叶提取物50g，于73℃加热回流1.5小时，过滤，浓缩，滤液浓缩至液固比为3.5ml：1g；往浓缩液中加入约1/10体积的蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，酸性氧化铝柱的径高比为1：4，氧化铝为300目，上样量与氧化铝的重量比为1：8，用水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为1/2BV/h，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为65%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇重结晶3次和乙酸乙酯重结晶1次，得成品银杏内酯B化合物。样品检测银杏内酯B含量为99.7%，白果内酯未检出，银杏内酯A’的含量为0.2%，总银杏酸的含量为0.10ppm。成品的比旋度为-57°～-61°。成品的比旋度为-57°。
实验例1
本实验例参照以下对比文件的方法制备了银杏内酯B，并采用本发明中的测试方法，测定了银杏内酯B成品中银杏内酯B、白果内酯、银杏内酯A’、总银杏酸的含量，结果见表1。
样品1为参照专利申请CN101182325A的实施例1的方法制备的银杏内酯B成品；
样品2为参照专利申请CN101412725A的实施例1的方法制备的银杏内酯B成品；
样品3为参照专利申请CN1680392A的实施例1的方法制备的银杏内酯B成品；
样品4为参照专利申请CN101302222A的实施例1的方法制备的银杏内酯B成品；
样品5为参照专利申请CN102627656A的实施例1的方法制备的银杏内酯B成品；
表1
| 银杏内酯B | 白果内酯 | 银杏内酯A’ | 总银杏酸 | |
| 样品1 | 97.8% | 未检出 | 1.0% | 2ppm |
| 样品2 | 98.3% | 0.5% | 0.5% | 8ppm |
| 样品3 | 98.7% | 0.3% | 0.4% | 10ppm |
| 样品4 | 91.5% | 1.7% | 2.3% | 15ppm |
| 样品5 | 98.6% | 0.5% | 0.4% | 7ppm |
表1的测定结果表明，与上述专利申请的现有技术相比，本发明制备的银杏内酯B化合物纯度高、杂质的含量少，特别是白果内酯、银杏内酯A’、总银杏酸的含量非常低，可作为注射剂的原料药，极大地提高了患者的用药安全。
实验例2
本实验例测试了本发明制备的银杏内酯B化合物的稳定性。
样品1为实施例1产品，样品2为实施例2产品；样品3为实施例5产品；
样品4为采用专利CN101182325A实施例1的方法得到的HPLC纯度为97.8%的银杏内酯B；
样品5为采用专利CN1680392A实施例1的方法得到的HPLC纯度为99.0%的银杏内酯B；
样品各取1g，本实验按照中国药典2005版第二部附录XIX C药物稳定性试验指导原则进行，结果如下：
表2、加速试验结果
表3、长期试验结果
银杏内酯B化合物中，作为杂质的银杏内酯A’、白果内酯以及总银杏酸对银杏内酯B的稳定性都有一定的影响，本发明提供的杏内酯B化合物中杂质的种类和含量较少，银杏内酯B的纯度较高，杂质对银杏内酯B的稳定性影响较小，通过加速试验及长期稳定试验考察，结果表明本发明的银杏内酯B相对于现有技术具有更好的稳定性，加速、长期试验纯度含量变化小。
Claims (10)
1.一种银杏内酯B化合物，其特征在于，所述银杏内酯B化合物从银杏叶中提取获得，所述银杏内酯B化合物中含有微量的银杏内酯A’，所述银杏内酯B的含量大于99%，所述银杏内酯A’的含量低于0.4%，所述的银杏内酯B化合物的结构式为：
2.根据权利要求1所述的银杏内酯B化合物，其特征在于，所述银杏内酯B的含量大于99.6%，所述银杏内酯A’的含量低于0.3%。
3.根据权利要求2所述的银杏内酯B化合物，其特征在于，所述银杏内酯B化合物中不含白果内酯。
4.根据权利要求1所述的银杏内酯B化合物，其特征在于，所述银杏内酯B化合物中总银杏酸的含量小于0.12ppm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的银杏内酯B化合物，其特征在于，所述银杏内酯B化合物的甲醇溶液在20℃时的比旋度为-57°～-61°。
6.一种权利要求1-5任一项所述的银杏内酯B化合物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：
（1）在搅拌条件下向乙酸乙酯中先加入硅藻土，再加入银杏叶提取物，于73-80℃加热回流1.5-2.5小时，过滤，浓缩；加入硅藻土的量为银杏叶提取物重量的0.8-1.2倍，乙酸乙酯与银杏叶提取物的液固比为15-20ml/g；
（2）再加入蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液；
（3）洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为60～70%，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；
（4）粗结晶依次用乙醇和乙酸乙酯重结晶，得成品银杏内酯B化合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，加入硅藻土的量为银杏叶提取物重量的0.9-1.1倍；乙酸乙酯与银杏叶提取物的液固比为16-18ml/g。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，滤液浓缩至液固比为3-5ml/g。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，酸性氧化铝柱的径高比为1：4～1：10，氧化铝为200～300目，上样量与氧化铝的重量比为1：7～10，洗脱速度为1/4～1/2BV/h；优选的，所述酸性氧化铝柱的径高比为1：4～1：7，上样量与氧化铝的重量比为1：8。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，粗结晶依次用乙醇重结晶3次以上、乙酸乙酯重结晶1次以上。
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