CN102924545B - 一种木通皂苷d的富集和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木通皂苷D的富集和纯化方法，富集方法为：将处理后的HP20大孔树脂，依次用水、30%乙醇和35%乙醇除杂，然后用50%乙醇洗脱，得到木通皂苷D富集液。取木通皂苷D富集液，加入不同的有机溶剂制成纯化前溶液，向纯化前溶液中加入1倍体积量的石油醚，充分振摇，密闭，冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于不超过70℃的温度下减压干燥，即为木通皂苷D纯化物。本发明的方法富集和纯化木通皂苷D过程中耗时更短，富集和纯化工艺更简单，操作方便，所制备的木通皂苷D纯度最高可达99%，转移率更高。<!--1-->
Description
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种木通皂苷D的富集和纯化方法。
背景技术
木通皂苷D是中药续断中的主要有效成分之一，其含量达2%以上。木通皂苷D能够从天然的中药续断中提取得到的，不同纯度的木通皂苷D有抗老年痴呆活性。对木通皂苷D的制备过程为：制备续断药材浓缩提取液；然后将浓缩提取液用大孔吸附树脂富集，得到富集液；最后将富集液用大孔吸附树脂精制得木通皂苷D。该方法富集和纯化过程耗时较长，所得产品的纯度低于93%。为提高效率需要提供一种耗时更短，产品纯度更高的木通皂苷D的富集和纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种木通皂苷D的富集方法。
本发明的另一目的在于提供一种木通皂苷D的纯化方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种用HP-20大孔树脂富集续断药材提取液中木通皂苷D的方法，包括以下步骤：将用95%的乙醇浸泡后的HP20大孔树脂，用95%乙醇洗脱，再用水洗脱至无醇味后备用；所用柱子的径高比为1：6，上样液浓度为0.1g药材/ml，上样量为药材：湿树脂重量比=1:1.5~2.5，依次用水、30%乙醇和35%乙醇除杂，然后用50%乙醇洗脱，得到木通皂苷D富集液。
所述的用水除杂为中性的纯化水、或用pH=3-4的酸性纯化水、或用pH=7-8的碱性纯化水、或用pH=8-9的碱性纯化水、或用pH=9-10的碱性纯化水单独使用除杂，或者pH=3-4的酸性纯化水与pH=8-9的碱性纯化水联合使用除杂；所述的用30%乙醇除杂为中性的30%乙醇、或用pH=3-4的酸性30%乙醇、或用pH=7-8的碱性30%乙醇、或用pH=8-9的碱性30%乙醇、或用pH=9-10的碱性30%乙醇单独使用除杂，或用pH=3-4的酸性30%乙醇与pH=8-9的碱性30%乙醇联合使用除杂；所述的35%乙醇为中性的35%乙醇；所述的50%乙醇为中性的50%乙醇。
所述的中性的纯化水，即为未调节pH值的一般纯化水，所述的中性的30%乙醇、中性的35%乙醇和中性的50%乙醇为用一般纯化水直接配制的30%乙醇、35%乙醇和50%乙醇溶液。所用酸性乙醇溶液或碱性乙醇溶液为用盐酸溶液或氨水将用一般纯化水直接配制的30%乙醇的调至所需的pH值范围。所述的酸性或碱性的纯化水为用盐酸溶液或氨水将用一般纯化水调至所需的pH值范围。
除杂时所述水的用量为6倍量柱体积，所述30%乙醇的用量为6倍量柱体积，所述35%乙醇的用量为2倍量柱体积，洗脱时所述50%乙醇的用量为6倍量柱体积。
所述除杂和所述洗脱的过程优选为：用6倍量柱体积的pH=8-9的碱性纯化水洗脱除杂，流速为2BV/h；然后用6倍量柱体积的pH=8-9的碱性30%乙醇洗脱除杂，流速为2BV/h；再用2倍量柱体积的中性的35%乙醇除杂，流速为2BV/h；最后用6倍量柱体积的中性的50%乙醇洗脱，流速为2BV/h，得到木通皂苷D富集液。
一种木通皂苷D富集液的纯化方法，其在于向木通皂苷D富集液中加入有机溶剂制成纯化前溶液，向纯化前溶液中加入1倍体积量的石油醚，充分振摇，密闭，冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于不超过70℃的温度下减压干燥，即得木通皂苷D纯化物。
上述的木通皂苷D富集液的纯化方法，其在于所述的纯化前溶液中有机溶剂的体积百分含量为5%~40%，优选为10%~30%，更进一步优选为20%。
上述的有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯或正丁醇；优选为乙醇或丙酮，更进一步优选为丙酮。
所述的纯化前溶液中药材与纯化前溶液的质量体积比g：ml为1:0.5~3；优选为：1:1。
所述的木通皂苷D富集液为采用上述的用HP-20大孔树脂富集续断药材提取液中木通皂苷D的方法制备的木通皂苷D富集液，或者现有技术中其他富集方法制备的木通皂苷D富集液，例如采用24种大孔树脂D101、HPD-100、HPD-100A、HPD-200A、AB-8、SepliteD101、SepliteLX-68、SepliteXDA-8、SepliteLX-11、SepliteLX-17、SepliteLX-28、HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、HPD-450A、HPD-500、HPD-600、HPD-700、HPD-710、HPD-722或HPD-721富集方法制备的木通皂苷D富集液。
本发明所用乙醇溶液的百分含量均为体积百分含量。
本发明的有益效果：
本发明的方法富集和纯化木通皂苷D过程中耗时更短，富集和纯化工艺更简单，操作方便，所制备的木通皂苷D纯度最高可达99%，转移率更高。
具体实施方式
1、实验仪器
高效液相色谱仪(美国Agilent1200)，紫外检测器，BS-124S型万分之一电子天平(sartorius，北京赛多利斯仪器系统有限公司)，KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，RE-5203型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，101-2型干燥箱(上海市实验仪器总厂)。
2、实验材料
川续断药材（购自于四川凉山），HP20大孔吸附树脂(日本三菱)，乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇等（购自于南京化学试剂厂）。
3、实验试剂
甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)，乙腈(色谱纯，B&J)，纯化水(纯净水，乐百氏食品饮料有限公司)。
实施例1川续断药材中木通皂苷D的提取方法
取续断原药材，粉碎成大米粒大小的药材颗粒；取打碎至米粒大小的药材颗粒适量；用90%的乙醇溶液10倍量（1Kg药材加10L90%的乙醇溶液），浸泡2h；回流提取2h，滤过，得滤液；药渣再用90%的乙醇溶液分别提取两次，每次10倍量，每次回流提取2h，滤过，得滤液；合并3次滤液；减压（-0.08Mpa）回收乙醇，至无醇味，浓缩液的浓度约为1g药材/mL。
实施例2续断药材提取液中木通皂苷D的HP-20大孔树脂富集方法
1、HP20树脂预处理
新购HP20树脂预处理：HP20树脂用95%的乙醇浸泡过夜，然后将树脂进行上柱，先用3BV95%乙醇洗脱（流速1BV/h），再用3BV水洗脱（流速1BV/h），此洗脱步聚共操作3次，最终以水洗脱至无醇味后，待用。
HP20旧树脂的处理：先用95%乙醇2BV洗脱树脂柱，流速1BV/h；再用纯化水4BV洗脱，流速2BV/h，备用。
2、装柱：按径高比为1：6装柱。按上述“HP20树脂预处理”方法处理。
3、上样液的制备：取木通皂苷D浓缩液（浓度1g药材/ml）100ml，加水稀释至1000ml（浓度0.1g药材/ml），稀释液抽滤，即得“HP20柱的上样液”。
4、上样：按上样量为药材：湿树脂重量比=1:2的量将“HP20柱的上样液”加入到已处理好的HP20树脂柱中，流速1BV/h。上样结束后，静置1h。
5、“富集液-HP-中”的制备方法
①水洗脱除杂：用中性的纯化水6BV洗脱，流速2BV/h，洗脱完后，检查流出液是否为无色，若无色澄清，可以进入下一步，若还有颜色，需继续用中性的纯化水冲洗至无色。
②30%乙醇除杂：用中性的30%乙醇6BV洗脱，流速2BV/h。
③35%乙醇除杂：用中性的35%乙醇2BV洗脱，流速2BV/h。
④50%乙醇洗脱：用中性的50%乙醇6BV洗脱，流速2BV/h。收集50%乙醇洗脱液，即为纯化液。
⑤用旋转蒸发仪在70℃以下减压回收纯化液中的乙醇，回收乙醇至无醇味，浓缩液加水稀释至90ml，放置室温冷却后得到木通皂苷D富集液（浓度1g药材/ml），命名为“富集液-HP-中”。
⑥“富集液-HP-中”（浓度1g药材/ml）固形物称定：将部分“富集液-HP-中”置于蒸发皿中，水浴挥干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密称定，称量固形物，并按“富集液-HP-中”的总量，计算富集物的重量，结果，90g药材，最后可以得到8.4978g富集物。
⑦剩余的“富集液-HP-中”用于重结晶实验。
6、“富集液-HP-H+”的制备方法
“富集液-HP-H+”的制备方法基本同“富集液-HP-中”的制备方法，区别仅在于①水洗脱除杂和②30%乙醇除杂时所用的纯化水和30%乙醇用盐酸调至pH=3.5。得到的木通皂苷D富集液（浓度1g药材/ml），命名为“富集液-HP-H+”。
“富集液-HP-H+”（浓度1g药材/ml）固形物称定：将部分“富集液-HP-H+”置于蒸发皿中，水浴挥干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密称定，称量固形物，并按“富集液-HP-H+”的总量，计算富集物的重量，结果，90g药材，最后可以得到8.4011g富集物。
剩余的“富集液-HP-H+”，用于重结晶实验。
7、“富集液-HP-OH-Ⅰ”的制备方法
“富集液-HP-OH-Ⅰ”的制备方法基本同“富集液-HP-中”的制备方法，区别仅在于①水洗脱除杂和②30%乙醇除杂时所用的纯化水和30%乙醇用氨水调至pH=7.5。得到的木通皂苷D富集液（浓度1g药材/ml），命名为“富集液-HP-OH-Ⅰ”。
“富集液-HP-OH-Ⅰ（浓度1g药材/ml）固形物称定：将部分“富集液-HP-OH-Ⅰ”中的部分置于蒸发皿中，水浴挥干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密称定，称量固形物，并按“富集液-HP-OH-Ⅰ”的总量，计算富集物的重量，结果，90g药材，最后可以得到8.3232g富集物。
剩余的“富集液-HP-OH-Ⅰ，用于重结晶实验。
8、“富集液-HP-OH-Ⅱ”的制备方法
“富集液-HP-OH-Ⅱ”的制备方法基本同“富集液-HP-中”的制备方法，区别仅在于①水洗脱除杂和②30%乙醇除杂时所用的纯化水和30%乙醇用氨水调至为pH=8.5。得到的木通皂苷D富集液（浓度1g药材/ml），命名为“富集液-HP-OH-Ⅱ”。
“富集液-HP-OH-Ⅱ”（浓度1g药材/ml）固形物称定：将部分“富集液-HP-OH-Ⅱ”置于蒸发皿中，水浴挥干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密称定，称量固形物，并按“富集液-HP-OH-Ⅱ”的总量，计算富集物的重量，结果，90g药材，最后可以得到8.2431g富集物。
剩余的“富集液-HP-OH-Ⅱ，用于重结晶实验。
9、“富集液-HP-OH-Ⅲ”的制备方法
“富集液-HP-OH-Ⅲ”的制备方法基本同“富集液-HP-中”的制备方法，区别仅在于①水洗脱除杂和②30%乙醇除杂时所用的纯化水和30%乙醇用氨水调至为pH=9.5。得到的木通皂苷D富集液（浓度1g药材/ml），命名为“富集液-HP-OH-Ⅲ”。
“富集液-HP-OH-Ⅲ”（浓度1g药材/ml）固形物称定：将部分“富集液-HP-OH-Ⅲ”置于蒸发皿中，水浴挥干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密称定，称量固形物，并按“富集液-HP-OH-Ⅲ”的总量，计算富集物的重量，结果，90g药材，最后可以得到8.1819g富集物。
剩余的“富集液-HP-OH-Ⅲ，准备用于重结晶实验。
10、“富集液-HP-H+-OH-”的制备方法
“富集液-HP-H+-OH-”的制备方法基本同“富集液-HP-中”的制备方法，区别仅在于除杂时，先依次分别用pH=3.5的酸性纯化水、pH=3.5的酸性30%乙醇除杂，再依次分别用pH=8.5的碱性纯化水、pH=8.5的碱性30%乙醇除杂。得到的木通皂苷D富集液（浓度1g药材/ml），命名为“富集液-HP-H+-OH-”。
“富集液-HP-H+-OH-”（浓度1g药材/ml）固形物称定：将部分“富集液-HP-H+-OH-”置于蒸发皿中，水浴挥干，再置真空干燥箱中干燥至恒重，精密称定，称量固形物，并按“富集液-HP-H+-OH-”的总量，计算富集物的重量，结果，90g药材，最后可以得到8.2611g富集物。
剩余的“富集液-HP-H+-OH”，用于重结晶实验。
11、由木通皂苷D富集液干燥后得到的富集物中木通皂苷D的含量测定
11.1色谱条件
色谱柱为AgilentC18柱(100mm×4.6mm，3.5μm)；流动相乙腈-水（30:70，流动相超声脱气30min）；检测波长为212nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量20μl。
11.2对照品溶液的制备
取木通皂苷D对照品适量，精密称定(木通皂苷D为10.05mg)，置50ml量瓶中，加流动相溶解，稀释，定容，摇匀，制成浓度为0.2mg/mL的溶液，用0.45um微孔滤膜过滤，即得。
11.3各种富集物供试品溶液的制备
富集物含量测定：精密量取富集物10.19mg，置于25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
11.4各种富集物中木通皂苷D的含量测定结果
(1).“富集液-HP-中”的富集物中木通皂苷D的含量为72.2%。药材中木通皂苷D的转移率为93.4%。
(2).“富集液-HP-H+”的富集物中木通皂苷D的含量为75.6%。药材中木通皂苷D的转移率为90.7%。
(3).“富集液-HP-OH-Ⅰ”富集物中木通皂苷D的含量为76.0%。药材中木通皂苷D的转移率为96.3%。
(4).“富集液-HP-OH-Ⅱ”富集物中木通皂苷D的含量为77.9%。药材中木通皂苷D的转移率为96.8%。
(5).“富集液-HP-OH-Ⅲ”富集物中木通皂苷D的含量为77.7%。药材中木通皂苷D的转移率为96.7%。
(6).“富集液-HP-H+-OH-”富集物中木通皂苷D的含量为77.1%。药材中木通皂苷D的转移率为96.9%。
实施例3富集液的纯化方法
1、富集液的纯化方法-1
（1）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至20mL，每个烧杯中加入5mL无水乙醇得到“纯化前溶液”（溶液中乙醇的体积百分含量为20%，药材与纯化前溶液的体积质量比g:mL为1:1），再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即25ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-中-1:1”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-H+-1:1”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:1”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:1”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:1”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:1”）。
注解：木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-中-1:1”）中的“木通皂苷D1法纯化物”为富集液的纯化方法-1得到的木通皂苷D；“富集液-HP-中”为在制备富集液过程中，采用中性溶液系统进行除杂；“1:1”表示在纯化过程中，“纯化前溶液”的浓度，1:1即为1g药材溶在1mL的纯化前溶液中。
（2）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至10mL，每个烧杯中加入2.5mL无水乙醇得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即12.5ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-中-1:0.5”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-H+-1:0.5”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:0.5”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:0.5”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:0.5”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:0.5”）。
（3）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至15mL，每个烧杯中加入3.75mL无水乙醇得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即18.75ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-中-1:0.75”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-H+-1:0.75”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:0.75”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:0.75”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:0.75”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:0.75”）。
（4）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中加水稀释至60mL，每个烧杯中加入15mL无水乙醇得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即75ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-中-1:3”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-H+-1:3”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:3”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:3”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:3”）、木通皂苷D1法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:3”）。
纯化前溶液中药材与纯化前溶液的质量体积比（g:ml）分别为1:0.5、1:0.75、1:1、1:3。例如，纯化前溶液中药材与纯化前溶液的质量体积比（g:ml）为1:0.5，即1g药材溶在0.5ml的纯化前溶液之中。
2、富集液的纯化方法-2
（1）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至20mL，每个烧杯中加入5mL丙酮得到“纯化前溶液”（溶液中丙酮的体积百分含量为20%，药材与纯化前溶液的体积质量比g:mL为1:1），再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即25ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-中-1:1”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-H+-1:1”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:1”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:1”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:1”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:1”）。
注解：木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-中-1:1”）中的“木通皂苷D2法纯化物”为富集液的纯化方法-2得到的结晶；“富集液-HP-中”为在制备富集液过程中，采用中性溶液系统进行除杂；“1:1”表示在纯化过程中，“纯化前溶液”的浓度，1:1即为1g药材溶在1mL的纯化前溶液中。
（2）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至10mL，每个烧杯中加入2.5mL丙酮得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即12.5ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-中-1:0.5”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-H+-1:0.5”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:0.5”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:0.5”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:0.5”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:0.5”）。
（3）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至15mL，每个烧杯中加入3.75mL丙酮得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即18.75ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-中-1:0.75”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-H+-1:0.75”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:0.75”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:0.75”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:0.75”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:0.75”）。
（4）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中加水稀释至60mL，每个烧杯中加入15mL丙酮得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即75ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-中-1:3”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-H+-1:3”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:3”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:3”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:3”）、木通皂苷D2法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:3”）。
3、富集液的纯化方法-3
（1）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至20mL，每个烧杯中加入5mL二氯甲烷得到“纯化前溶液”（溶液中二氯甲烷的体积百分含量为20%，药材与纯化前溶液的体积质量比g:mL为1:1），再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即25ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-中-1:1”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-H+-1:1”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:1”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:1”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:1”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:1”）。
注解：木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-中-1:1”）中的“木通皂苷D3法纯化物”为富集液的纯化方法-3得到的结晶；“富集液-HP-中”为在制备富集液过程中，采用中性溶液系统进行除杂；“1:1”表示在纯化过程中，“纯化前溶液”的浓度，1:1即为1g药材溶在1mL的纯化前溶液中。
（2）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至10mL，每个烧杯中加入2.5mL二氯甲烷得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即12.5ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-中-1:0.5”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-H+-1:0.5”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:0.5”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:0.5”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:0.5”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:0.5”）。
（3）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至15mL，每个烧杯中加入3.75mL二氯甲烷得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即18.75ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-中-1:0.75”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-H+-1:0.75”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:0.75”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:0.75”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:0.75”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:0.75”）。
（4）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中加水稀释至60mL，每个烧杯中加入15mL二氯甲烷得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即75ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-中-1:3”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-H+-1:3”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:3”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:3”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:3”）、木通皂苷D3法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:3”）。
4、富集液的纯化方法-4
（1）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至20mL，每个烧杯中加入5mL乙酸乙酯得到“纯化前溶液”（溶液中乙酸乙酯的体积百分含量为20%，药材与纯化前溶液的体积质量比g:mL为1:1），再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即25ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-中-1:1”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-H+-1:1”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:1”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:1”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:1”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:1”）。
注解：木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-中-1:1”）中的“木通皂苷D4法纯化物”为富集液的纯化方法-4得到的结晶；“富集液-HP-中”为在制备富集液过程中，采用中性溶液系统进行除杂；“1:1”表示在纯化过程中，“纯化前溶液”的浓度，1:1即为1g药材溶在1mL的纯化前溶液中。
（2）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至10mL，每个烧杯中加入2.5mL乙酸乙酯得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即12.5ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-中-1:0.5”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-H+-1:0.5”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:0.5”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:0.5”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:0.5”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:0.5”）。
（3）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至15mL，每个烧杯中加入3.75mL乙酸乙酯得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即18.75ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-中-1:0.75”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-H+-1:0.75”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:0.75”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:0.75”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:0.75”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:0.75”）。
（4）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中加水稀释至60mL，每个烧杯中加入15mL乙酸乙酯得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即75ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-中-1:3”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-H+-1:3”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:3”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:3”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:3”）、木通皂苷D4法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:3”）。
5、富集液的纯化方法-5
（1）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至20mL，每个烧杯中加入5mL正丁醇得到“纯化前溶液”（溶液中正丁醇的体积百分含量为20%，药材与纯化前溶液的体积质量比g:mL为1:1），再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即25ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-中-1:1”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-H+-1:1”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:1”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:1”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:1”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:1”）。
注解：木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-中-1:1”）中的“木通皂苷D5法纯化物”为富集液的纯化方法-5得到的结晶；“富集液-HP-中”为在制备富集液过程中，采用中性溶液系统进行除杂；“1:1”表示在纯化过程中，“纯化前溶液”的浓度，1:1即为1g药材溶在1mL的纯化前溶液中。
（2）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至10mL，每个烧杯中加入2.5mL正丁醇得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即12.5ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-中-1:0.5”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-H+-1:0.5”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:0.5”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:0.5”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:0.5”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:0.5”）。
（3）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中浓缩至15mL，每个烧杯中加入3.75mL正丁醇得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即18.75ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-中-1:0.75”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-H+-1:0.75”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:0.75”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:0.75”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:0.75”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:0.75”）。
（4）取实施例1制备的6种富集液(1g药材/ml)25ml，分别置于6个100mL的小烧杯中加水稀释至60mL，每个烧杯中加入15mL正丁醇得到“纯化前溶液”，再向各“纯化前溶液”中加1倍体积量的石油醚（即75ml），充分振摇，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即由6种富集液制备的纯化物，分别命名为：木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-中-1:3”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-H+-1:3”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅰ-1:3”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅱ-1:3”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-OH-Ⅲ-1:3”）、木通皂苷D5法纯化物（“富集液-HP-H+-OH--1:3”）。
实施例3中所述的6种富集液即为：实施例1制备的“富集液-HP-中”、“富集液-HP-H+”、“富集液-HP-OH-Ⅰ”、“富集液-HP-OH-Ⅱ”、“富集液-HP-OH-Ⅲ”、“富集液-HP-H+-OH-”。
6、各种木通皂苷D纯化样品的纯度测定
6.1色谱条件
色谱柱为AgilentC18柱(100mm×4.6mm，3.5μm)；流动相乙腈-水（30:70，流动相超声脱气30min）；检测波长为212nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量20μl。
6.2对照品溶液的制备
取MD对照品适量，精密称定(MD为10.05mg)，置50ml量瓶中，加流动相溶解，稀释，定容，摇匀，制成浓度为0.2mg/mL的溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
6.3供试品溶液的制备
精密称取实施例3纯化方法制备的各种木通皂苷D纯化样品适量（约50mg），置50ml量瓶中，加甲醇溶解，稀释，定容，摇匀，再精密量取1.0ml置5ml量瓶中，加流动相稀释，定容，摇匀，制成浓度为0.2mg/mL的溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
测定各木通皂苷D纯化样品的纯度，检测结果见表1。
表1不同纯化方法结合不同方法制备的富集液、纯化溶解液的浓度变化对
木通皂苷D纯度、转移率的影响实验结果
结论：
木通皂苷D纯化方法2（即有机溶剂采用丙酮）为最佳方法制备的木通皂苷D纯度>93%，最高可达99%，转移率>78%，富集条件为pH8~9的碱性除杂系统最好。其次为木通皂苷D纯化方法1（即有机溶剂采用无水乙醇），该方法制备的木通皂苷D纯化物纯度>93%，转移率>50%。相比较而言，其他纯化方法虽然不如方法2和方法1，但是也能达到纯化不同富集液的目的。相比较而言，富集条件为pH8~9的碱性除杂系统最好，但是本发明其他富集条件也能达到现有的富集目的。
实施例6木通皂苷D纯化方法应用于其他方法制备的富集液的纯化效果
因为上述研究显示：木通皂苷D纯化方法2为最佳方法，故采用该法对24种不同大孔树脂制备的富集液进行纯化研究。
1.采用24种不同的大孔树脂制备“木通皂苷D富集样品液”
1.1.选用的吸附材料：
D101、HPD-100、HPD-100A、HPD-200A、AB-8、SepliteD101、SepliteLX-68、SepliteXDA-8、SepliteLX-11、SepliteLX-17、SepliteLX-28、HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、HPD-450A、HPD-500、HPD-600、HPD-700、HPD-710、HPD-722、HPD-721的24种树脂均被使用。
1.2.层析柱径高比的选择：径高比为1:6-1:8。
1.3.各种吸附材料吸附量的选择：药材重g：树脂湿重g=1：2~3
1.4.温度的选择：15-35℃.
1.5.吸附材料的处理方法：
制备木通皂苷D富集液选择的24种树脂的处理方法：先用约4倍量柱体积蒸馏水漂洗，再用95％的乙醇浸泡12小时，然后用2倍柱体积95％的乙醇淋洗以脱除致孔剂或低聚物，终点以流出的乙醇加水不显混浊为标准，流速为1BV/h，用约4柱体积蒸馏水洗至无醇味，流速为2BV/h，备用。
1.6.洗脱液pH值的选择：因为待分离的总皂苷类成分接近于中性，故以提取液的稀释液直接上样，不用调pH值。
1.7.上样液的提取制备工艺：分别取续断药材粗颗粒24份，每份为200g，分别置于3000ml的圆底烧瓶中，分别加入10倍量的60%的乙醇，浸泡2小时，分别水浴回流提取2小时，分别滤过，分别得滤液。药渣再分别用10倍量的60%的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过。分别合并3次滤液，分别减压回收乙醇至无醇味，分别配制成药材：药液（0.1g/ml）为1：10的水溶液。
1.8.上样液浓度流速的选择：上样液的浓度为0.1g生药/ml。上样的流速为每小时2个柱体积。
1.9.洗脱剂系统的确定：分别依次用水、30%、50%的乙醇洗脱。每种洗脱液的体积分别为6-8倍量的柱体积。
1.10.洗脱流速：每小时的流速为2个柱体积。
1.11.各种型号树脂制备木通皂苷D富集液的结果：
24种树脂柱制备的木通皂苷D富集液样品，按1.1.中树脂排列顺序依次标注为样品液1、样品液2、样品液3、样品液4、样品液5、样品液6、样品液7、样品液8、样品液9、样品液10、样品液11、样品液12、样品液13、样品液14、样品液15、样品液16、样品液17、样品液18、样品液19、样品液20、样品液21、样品液22、样品液23、样品液24。
上述样品液，部分取样，得干燥的富集样品，经测定（测定方法同前）1-24号样品液中木通皂苷D的含量在50-53%范围内。
2.24种不同的大孔树脂制备“木通皂苷D富集样品液”的纯化
2.1.“木通皂苷D富集样品液”的纯化方法
纯化方法采用“富集液的纯化方法-3”：取富集液(1g药材/ml)25ml，置于100mL的小烧杯中，在水浴条件下浓缩至20ml，加5ml丙酮充分溶解，得到“纯化前溶液”，在“纯化前溶液”中加石油醚1倍量（即25ml），充分混匀，密闭，于4℃冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于70℃减压干燥，即为木通皂苷D3法纯化物的系列纯化物。
2.2.采用的“木通皂苷D富集样品液”样品为“样品液1-24号”。
2.3.“纯化前溶液”的浓度1:1，即为1g药材溶在1mL的溶液之中。
2.24种不同的大孔树脂制备“木通皂苷D富集样品液”的纯化结果见表2
表224种不同的大孔树脂制备“木通皂苷D富集样品液”的纯化结果
| 24种富集样品液的名称 | 纯化木通皂苷D的纯度% | 转移率% |
| 样品液1 | 93.12 | 65.26 |
| 样品液2 | 93.25 | 65.37 |
| 样品液3 | 93.26 | 67.14 |
| 样品液4 | 93.43 | 64.37 |
| 样品液5 | 93.51 | 66.12 |
| 样品液6 | 92.98 | 67.23 |
| 样品液7 | 93.44 | 64.64 |
| 样品液8 | 93.41 | 63.39 |
| 样品液9 | 93.37 | 65.48 |
| 样品液10 | 93.38 | 66.22 |
| 样品液11 | 93.22 | 65.69 |
| 样品液12 | 93.26 | 64.47 |
| 样品液13 | 93.34 | 63.55 |
| 样品液14 | 93．53 | 66.09 |
| 样品液15 | 93.28 | 64.78 |
| 样品液16 | 92.77 | 65.41 |
| 样品液17 | 93.45 | 64.72 |
| 样品液18 | 93.13 | 66.26 |
| 样品液19 | 92.56 | 65.55 |
| 样品液20 | 93.49 | 64.59 |
| 样品液21 | 93.33 | 65.61 |
| 样品液22 | 93.70 | 63.52 |
| 样品液23 | 93.39 | 64.78 |
| 样品液24 | 92.36 | 66.14 |
结论：本发明的“木通皂苷D富集样品液”的纯化方法，不仅可以用于HP20大孔树脂制备的一系列“木通皂苷D富集样品液”的纯化，也可以用于其它24中大孔树脂制备的“木通皂苷D富集样品液”的纯化。对上述24种大孔树脂制备的“木通皂苷D富集样品液”的纯化结果显示由此制备的24份木通皂苷D纯化物的纯度均大于92%，它们的转移率均大于63%。
Claims (10)
1.一种纯化木通皂苷D富集液制备木通皂苷D纯化物的方法，其特征在于向木通皂苷D富集液中加入有机溶剂制成纯化前溶液，向纯化前溶液中加入1倍体积量的石油醚，充分振摇，密闭，冷藏静置过夜，抽滤，收集沉淀，于不超过70℃的温度下减压干燥，即得木通皂苷D纯化物；所述的有机溶剂为乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯或正丁醇；所述的纯化前溶液中有机溶剂的体积百分含量为5%~40%；所述的木通皂苷D富集液为采用以下方法制备的木通皂苷D富集液：将用95%的乙醇浸泡后的HP20大孔树脂，用95%乙醇洗脱，再用水洗脱至无醇味后备用；所用柱子的径高比为1：6，上样液浓度为0.1g药材/ml，上样量为药材：湿树脂重量比=1:1.5~2.5，依次用水、30%乙醇和35%乙醇除杂，然后用50%乙醇洗脱，得到木通皂苷D富集液。
2.根据权利要求1所述的纯化木通皂苷D富集液制备木通皂苷D纯化物的方法，其特征在于所述有机溶剂的体积百分含量为10%~30%。
3.根据权利要求2所述的纯化木通皂苷D富集液制备木通皂苷D纯化物的方法，其特征在于所述有机溶剂的体积百分含量为20%。
4.根据权利要求1所述的纯化木通皂苷D富集液制备木通皂苷D纯化物的方法，其特征在于所述的有机溶剂为乙醇或丙酮。
5.根据权利要求4所述的纯化木通皂苷D富集液制备木通皂苷D纯化物的方法，其特征在于所述的有机溶剂为丙酮。
6.根据权利要求1所述的纯化木通皂苷D富集液制备木通皂苷D纯化物的方法，其特征在于所述的纯化前溶液中药材与纯化前溶液的质量体积比g：ml为1:0.5~3。
7.根据权利要求6所述的纯化木通皂苷D富集液制备木通皂苷D纯化物的方法，其特征在于所述药材与纯化前溶液的质量体积比为：1:1。
8.根据权利要求1所述的纯化木通皂苷D富集液制备木通皂苷D纯化物的方法，其特征在于所述的用水除杂为中性的纯化水、或用pH=3-4的酸性纯化水、或用pH=7-8的碱性纯化水、或用pH=8-9的碱性纯化水、或用pH=9-10的碱性纯化水单独使用除杂，或者pH=3-4的酸性纯化水与pH=8-9的碱性纯化水联合使用除杂；所述的用30%乙醇除杂为中性的30%乙醇、或用pH=3-4的酸性30%乙醇、或用pH=7-8的碱性30%乙醇、或用pH=8-9的碱性30%乙醇、或用pH=9-10的碱性30%乙醇单独使用除杂，或用pH=3-4的酸性30%乙醇与pH=8-9的碱性30%乙醇联合使用除杂；所述的35%乙醇为中性的35%乙醇；所述的50%乙醇为中性的50%乙醇。
9.根据权利要求1所述的纯化木通皂苷D富集液制备木通皂苷D纯化物的方法，其特征在于除杂时所述水的用量为6倍量柱体积，所述30%乙醇的用量为6倍量柱体积，所述35%乙醇的用量为2倍量柱体积，洗脱时所述50%乙醇的用量为6倍量柱体积。
10.根据权利要求1、8或9中任意一项所述的纯化木通皂苷D富集液制备木通皂苷D纯化物的方法，其特征在于所述除杂和所述洗脱的过程为：用6倍量柱体积的pH=8-9的碱性纯化水洗脱除杂，流速为2BV/h；然后用6倍量柱体积的pH=8-9的碱性30%乙醇洗脱除杂，流速为2BV/h；再用2倍量柱体积的中性的35%乙醇除杂，流速为2BV/h；最后用6倍量柱体积的中性的50%乙醇洗脱，流速为2BV/h，得到木通皂苷D富集液。
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