CN102180937A - 大孔吸附树脂富集精制木通皂苷d的制备方法 - Google Patents
大孔吸附树脂富集精制木通皂苷d的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，取续断药材粗颗粒置于容器中，加入10倍量的质量浓度90%的乙醇，浸泡2小时，水浴回流提取2小时，滤过；药渣再用10倍量的质量浓度90%的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过；合并3次滤液，减压浓缩，得浓缩液；取浓缩液用已经处理过的大孔吸附树脂富集，由乙醇水溶液洗脱，得富集液；取富集液用已经处理过的大孔吸附树脂精制，由甲醇或乙醇水溶液洗脱，回收溶剂至近干，经减压干燥，得到木通皂苷D。本发明的制备方法在药材提取、浓缩后，浓缩液经大孔吸附树脂富集，再经大孔吸附树脂精制，工艺简单易行，路线短，工业化生产效率高。
Description
技术领域
本发明涉及木通皂苷D的制备方法，具体涉及一种大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法。
背景技术
木通皂苷D是从天然的中药续断中提取得到的，不同纯度的木通皂苷D有抗老年痴呆活性。传统的木通皂苷D提取方法是：药材粉碎成米粒大小用95%的乙醇水浴回流提取3次，提取液过滤合并，减压浓缩回收乙醇至小体积，浓缩液用石油醚萃取脱脂，至石油醚无色，脱脂后的浓缩液调pH3-4，用氯仿分次萃取，合并萃取液，中和氯仿萃取液至Ph7，减压回收氯仿近干，得到木通皂苷D粗品，木通皂苷D粗品经硅胶柱用不同比例的氯仿甲醇系统洗脱纯化，再经ODS柱用甲醇水系统洗脱，最终得到纯度为90%的木通皂苷D。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，该制备方法采用大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D，制备工艺简单易行，方便工业化实施。
本发明的技术解决方案是该制备方法包括以下步骤：
（1）药材提取浓缩：取续断药材粗颗粒置于容器中，加入10倍量的质量浓度90%的乙醇，浸泡2小时，水浴回流提取2小时，滤过；药渣再用10倍量的质量浓度90%的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过；合并3次滤液，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得浓度为0.1g生药/ml的浓缩液；
（2）大孔吸附树脂富集：取浓度为0.1g生药/ml的浓缩液，用已经处理过的大孔吸附树脂富集，由乙醇水溶液洗脱，得0.1g生药/ml的富集液；
（3）大孔吸附树脂精制：取浓度0.1g生药/ml的富集液，用已经处理过的大孔吸附树脂精制，由甲醇或乙醇水溶液洗脱，回收溶剂至近干，经减压干燥，得到木通皂苷D。
其中，采用D101、HPD-100、Seplite LX-68、HPD-200A、HPD-722、HPD-721大孔吸附树脂富集制备木通皂苷D的富集液，乙醇水溶液的质量浓度为20%-95%，洗脱液的体积为4-8倍量的柱体积，50%的乙醇水溶液为最佳洗脱液。
其中，富集用大孔吸附树脂的预处理：先用4倍量柱体积蒸馏水漂洗，再用质量浓度95％的乙醇浸泡12小时，然后用2倍柱体积质量浓度95％的乙醇淋洗以脱除致孔剂或低聚物，终点以流出的乙醇加水不显混浊为标准，流速为1BV/h，最后用4倍量柱体积蒸馏水洗至无醇味，流速为2BV/h。
其中，采用ODS-AA（50μm）、ODS-AQ（50μm）、ODS-AA（75μm）、ODS-AQ（75μm）、ODS-BP（40-60μm）大孔吸附树脂精制木通皂苷D的富集液，甲醇水溶液的质量浓度为10%-90%，洗脱液的体积为6-8倍量的柱体积，50%-70%的甲醇水溶液为最佳洗脱液。
其中，采用ADS-7大孔吸附树脂精制木通皂苷D的富集液，由乙醇水溶液洗脱，乙醇水溶液的质量浓度为20%-70%，洗脱液的体积为4-8倍量的柱体积，50%-70%的乙醇水溶液为最佳洗脱液。
其中，ADS-7大孔吸附树脂的预处理：用2-4倍树脂体积的质量浓度5%的盐酸处理，流速1 BV/h；6倍柱体积水洗至中性，流速2BV/h；再用2-4倍柱体积的含质量3%氢氧化钠的50%乙醇水溶液洗脱，流速1 BV/h；6倍柱体积水洗至pH试纸检测为中性，流速2BV/h；再用3倍柱体积质量浓度4%氢氧化钠水溶液洗脱，流速为1BV/h；6倍柱体积水洗至pH试纸检测为中性，流速为2BV/h。
其中，ODS大孔吸附树脂的预处理：以质量浓度95%的乙醇浸泡和洗涤，再用水洗至无醇味。
本发明的制备方法在药材提取、浓缩后，浓缩液经大孔吸附树脂富集，再经大孔吸附树脂精制，得到纯度90%以上的木通皂苷D，制备工艺简单易行，工艺路线短，工业化生产效率高。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术解决方案的限制。
实施例1：木通皂苷D的富集液的制备
1.富集木通皂苷D富集液的树脂：D101、HPD-100、Seplite LX-68、HPD-200A、HPD-722、HPD-721；
2.层析柱径高比：径高比为1:4-1:9；
3.吸附材料的吸附量：药材重 g：树脂湿重g=1：1～5；
4.温度：10-35℃；
5.富集用大孔吸附树脂的预处理：先用4倍量柱体积蒸馏水漂洗，再用质量浓度95％的乙醇浸泡12小时，然后用2倍柱体积质量浓度95％的乙醇淋洗以脱除致孔剂或低聚物，终点以流出的乙醇加水不显混浊为标准，流速为1BV/h，最后用4倍量柱体积蒸馏水洗至无醇味，流速为2BV/h；
6. 药材提取浓缩：分别取续断药材粗颗粒6份，每份为200g，分别置于3000ml的圆底烧瓶中，分别加入10倍量的质量浓度90%的乙醇，浸泡2小时，分别水浴回流提取2小时，分别滤过；药渣再分别用10倍量的质量浓度90%的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过；分别合并3次滤液，分别减压回收乙醇至无醇味，分别配制成生药：药液为1：1的水溶液（1g/ml）；
7.上样液：取药材提取浓缩液配浓度为0.1g生药/ml的上样液，上样液的流速为每小时1个柱体积；
8.洗脱液：分别依次用水、20%、30%、35%、50%、95%的乙醇水溶液洗脱，洗脱液的体积分别为4-8倍量的柱体积，洗脱液流速为每小时2个柱体积；
9.几种型号树脂富集木通皂苷D的结果：分别取浓度为0.1g生药/ml的上样液各2000ml，相当于200g生药，分别上已经处理过的D101、HPD-100、Seplite LX-68、HPD-200A、HPD-722、HPD-721，树脂体积为960ml，分别依次用水、20%、30%、35%、50%、95%的乙醇水溶液洗脱，洗脱液的体积为4-8倍量的柱体积；分别合并50%的乙醇洗脱液，分别回收溶剂至小体积，分别以水定容为2000ml，分别称为富集液1、富集液2、富集液3、富集液4、富集液5、富集液6；6种不同树脂得到的木通皂苷D富集液分别经HPLC测定其浓度，并经浓度和总体积计算当中木通皂苷D的含量及其转移率。
实施例2：木通皂苷D富集液中木通皂苷D的含量测定
1.色谱条件：Agilent-1260型高效液相色谱仪，色谱柱为Boston analytics，Green ODS-AQ 4.6×150mm 5um，波长为212nm，进样量为20ul，流速为1.0ml/min，柱温为25℃，流动相为乙腈-水(30:70)；
2.对照品木通皂苷D溶液：精密称定木通皂苷D对照品粉末 4.97 mg，移至 5 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，过 0.45 μm 微孔滤膜，得 0.9940 mg/mL 的 MD 对照液；含量测定时，用移液管精密量取 MD 对照液 0.2 mL，流动相（乙腈-水 = 30:70）溶解并稀释至 1 mL，过 0.45 μm 微孔滤膜，浓度为 0.9940/5 = 0.1988mg/ml；
3.木通皂苷D样品液：分别称取实施例1的富集液1-6号样品液各1ml，分别以流动相（乙腈-水 = 30:70）定容至10ml；
4.富集液1-6号样品液中木通皂苷D含量测定：
分别精取上述富集液1-6号样品待测液，过 0.45 μm 微孔滤膜，分别精取上述各样品液和对照品溶液20ul，注入色谱柱，按上述色谱条件测定；
5.测定的结果：对照品中木通皂苷D峰面积：S对照品=694.2；测得各样品中木通皂苷D峰面积：S样品1 =287.5，S样品2 =281.1，S样品3 =285.7，S样品4 =284.0，S样品5 =279.4，S样品6 =291.2；
计算得到的各木通皂苷D样品中木通皂苷D的浓度：
C样品1= C对照品×S样品1/S对照品=0.1988×694.2/287.5=0.480mg/ml
C样品2= C对照品×S样品2/S对照品=0.1988×694.2/281.1=0.491mg/ml
C样品3= C对照品×S样品3/S对照品=0.1988×694.2/285.7=0.483mg/ml
C样品4= C对照品×S样品4/S对照品=0.1988×694.2/284.0=0.486mg/ml
C样品5= C对照品×S样品5/S对照品=0.1988×694.2/279.4=0.494mg/ml
C样品6= C对照品×S样品6/S对照品=0.1988×694.2/291.2=0.474mg/ml
计算得到富集液1-6样品中木通皂苷D的含量：
富集样品液1中木通皂苷D的含量=C样品1×V样品1=0.480mg/ml×2000ml=9.60g
富集样品液2中木通皂苷D的含量=C样品2×V样品2=0.491mg/ml×2000ml =9.82g
富集样品液3中木通皂苷D的含量=C样品3×V样品3=0.483mg/ml×2000ml =9.66g
富集样品液4中木通皂苷D的含量=C样品4×V样品4=0.486mg/ml×2000ml =9.72g
富集样品液5中木通皂苷D的含量=C样品5×V样品5=0.494mg/ml×2000ml =9.88g
富集样品液6中木通皂苷D的含量=C样品6×V样品6=0.474mg/ml×2000ml =9.48g
计算得到富集液1-6样品中木通皂苷D的转移率：已知原药材当中木通皂苷D的百分含量为5.15%，提取的转移率为98%，提取后的药液中木通皂苷D的含量为5.05%；本实验所用药材的量均为200g，200g药材提取液中木通皂苷D的含量应该为10.1g；
富集之后不同吸附材料得到的富集液中木通皂苷D的转移率分别如下：
富集样品液1中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷D的含量=9.60g /10.1g=95.0%
富集样品液2中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷D的含量=9.82g /10.1g=97.2%
富集样品液3中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷D的含量=9.66g /10.1g=95.6%
富集样品液4中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷D的含量=9.72g /10.1g=96.2%
富集样品液5中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷D的含量=9.88g /10.1g=98.0%
富集样品液6中木通皂苷D的转移率=富集样品液1中木通皂苷D的含量/药液中木通皂苷D的含量=9.48g /10.1g=93.9%
结论：上述1-6份吸附材料得到的富集液中木通皂苷D的转移率在93.9%-98.0%之间，可以认为上述各种吸附材料，均适用于富集续断提取液中的木通皂苷D。
实施例3：木通皂苷D的精制
1.精制木通皂苷D富集液的大孔吸附树脂：ADS-7、ODS-AA（50μm）、ODS-AQ（50μm）、ODS-AA（75μm）、ODS-AQ（75μm）、ODS-BP（40-60μm）；
2.层析柱径高比：径高比为1:4-1:9；
3.大孔吸附树脂的吸附量：续断药材g：吸附材料g=1：1～5；
4.温度：10-35℃；
5.精制大孔吸附树脂的预处理：
其中，ADS-7大孔吸附树脂的处理：用2-4倍树脂体积的质量浓度5％的盐酸处理，流速1 BV/h；6倍柱体积水洗至中性，流速2BV/h；再用2-4倍柱体积的含质量3%氢氧化钠的50%乙醇水溶液洗脱，流速1 BV/h；6倍柱体积水洗至pH试纸检测为中性，流速2BV/h；再用3倍柱体积质量浓度4%氢氧化钠水溶液洗脱，流速为1BV/h；6倍柱体积水洗至pH试纸检测为中性，流速为2BV/h，备用；
其中，ODS大孔吸附树脂的预处理：以质量浓度95%的乙醇浸泡和洗涤，再用水洗至无醇味；
6.上样液：分别采用实施例1中的第1号富集液水溶液共6份，待进行精制；上样液的浓度为0.1g生药/ml富集液水溶液，上样液的流速为每小时2个柱体积；
7.洗脱液：洗脱液分别为甲醇水溶液和乙醇水溶液，甲醇水溶液的比例为1：9—9：1进行梯度洗脱，洗脱液的体积分别为4-8倍量的柱体积；洗脱流速为每小时2个柱体积；
8.几种吸附树脂精制木通皂苷D的结果：
五种ODS吸附树脂制备木通皂苷D：分别取5份浓度为0.1g生药/ml的富集液水溶液2000ml，分别上已经处理过的ODS-AA（50μm）、ODS-AQ（50μm）、ODS-AA（75μm）、ODS-AQ（75μm）、ODS-BP（40-60μm）吸附树脂柱；分别依次用甲醇水溶液洗脱，洗脱液的比例为1：9—9：1，洗脱液的体积分别为6-8倍量的柱体积；合并洗脱液比例为5：5—7：3的洗脱液，回收溶剂至近干，经65℃减压干燥，分别得到木通皂苷D，得到的木通皂苷D分别为5.2g、5.3g、5.2g、5.2g、5.1g，分别称为样品(1)、样品(2)、样品(3)、样品(4)、样品(5)；
ADS-7大孔树脂柱制备木通皂苷D：取浓度为0.1g生药/ml的富集液水溶液2000ml，上已经处理过的ADS-7大孔树脂柱，依次用水-20%乙醇-30%乙醇-35%乙醇-50%乙醇-70%乙醇水溶液洗脱，洗脱液的体积分别为4-8倍量的柱体积，合并50%和70%乙醇水溶液洗脱液，回收溶剂至近干，经65℃减压干燥，得到木通皂苷D，得到的木通皂苷D为5.3g，称为样品(6)。
实施例4：木通皂苷D精制液中木通皂苷D的含量测定
1.色谱条件：同实施例2；
2.对照品木通皂苷D溶液：精密称定木通皂苷D对照品粉末 4.97 mg，移至 5 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，过 0.45 μm 微孔滤膜，得 0.9940 mg/mL 的 MD 对照液；含量测定时，用移液管精密量取 MD 对照液 0.2 mL，流动相（乙腈-水 = 30:70）溶解并稀释至 1 mL，过 0.45 μm 微孔滤膜，浓度为 0.9940/5 = 0.1988mg/ml；
3.木通皂苷D样品供试液： 分别称取实施例3的ODS-AA（50μm）、ODS-AQ（50μm）、ODS-AA（75μm）、ODS-AQ（75μm）、ODS-BP（40-60μm）、ADS-7精制得到的木通皂苷D样品各1ml，分别用乙腈-水-甲醇 = 30:70:25定容为25ml，分别标注为样品(1)、样品(2)、样品(3)、样品(4)、样品(5)、样品(6)；
4.木通皂苷D样品的含量测定：分别精取上述木通皂苷D样品液和对照品溶液各20ul，注入色谱柱，按上述色谱条件测定；
5. 各样品木通皂苷D称量结果：W样品（1）=15.2mg；W样品（2）=14.0mg；W样品（3）=14.9mg；W样品（4）=15.1mg；W样品（5）=15.3mg；W样品（6）=15.2mg；
6测定的结果：对照品中木通皂苷D峰面积：S对照品=702.2；测得各样品供试液中木通皂苷D的峰面积：S样品（1） =1966.3；S样品（2） =1812.7；S样品（3） =1931.4；S样品（4） =1950.1；S样品（5） =2005.2；S样品（6） =1957.9；
计算得到的各样品中木通皂苷D的浓度：
C样品(1)= C对照品×S样品(1)/S对照品=0.1988×1966.3/702.2=0.5567 mg/ml
C样品(2)= C对照品×S样品(2)/S对照品=0.1988×1812.7/702.2=0.5132 mg/ml
C样品(3)= C对照品×S样品(3)/S对照品=0.1988×1931.4/702.2=0.5468 mg/ml
C样品(4)= C对照品×S样品(4)/S对照品=0.1988×1950.1/702.2=0.5521 mg/ml
C样品(5)= C对照品×S样品(5)/S对照品=0.1988×2005.2/702.2=0.5677 mg/ml
C样品(6)= C对照品×S样品(6)/S对照品=0.1988×1957.9/702.2=0.5543 mg/ml
计算得到各样品中木通皂苷D的百分含量：
C样品（1）×V样品（1）/W样品（1）=0.5567mg/ml×25ml/15.2mg=91.6%。
C样品（2）×V样品（2）/W样品（2）=0.5132mg/ml×25ml/14.0mg=91.6%。
C样品（3）×V样品（3）/W样品（3）=0.5468mg/ml×25ml/14.9mg=91.7%。
C样品（4）×V样品（4）/W样品（4）=0.5521mg/ml×25ml/15.1mg=91.4%。
C样品（5）×V样品（5）/W样品（5）=0.5677mg/ml×25ml/15.3mg=92.8%。
C样品（6）×V样品（6）/W样品（6）=0.5543mg/ml×25ml/15.2mg=91.2%。
结论：上述各种用于精制的吸附树脂得到的样品纯度均大于90%，达到中药一类新药的纯度要求，符合精制的需要。
Claims (10)
1. 大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：
（1）药材提取浓缩：取续断药材粗颗粒置于容器中，加入10倍量的质量浓度90%的乙醇，浸泡2小时，水浴回流提取2小时，滤过；药渣再用10倍量的质量浓度90%的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过；合并3次滤液，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得浓度为0.1g生药/ml的浓缩液；
（2）大孔吸附树脂富集：取浓度为0.1g生药/ml的浓缩液，用已经处理过的大孔吸附树脂富集，由乙醇水溶液洗脱，得0.1g生药/ml的富集液；
（3）大孔吸附树脂精制：取浓度0.1g生药/ml的富集液，用已经处理过的大孔吸附树脂精制，由甲醇或乙醇水溶液洗脱，回收溶剂至近干，经减压干燥，得到木通皂苷D。
2. 根据权利要求1所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于：其中，采用D101、HPD-100、Seplite LX-68、HPD-200A、HPD-722、HPD-721大孔吸附树脂富集制备木通皂苷D的富集液，乙醇水溶液的质量浓度为20%-95%，洗脱液的体积为4-8倍量的柱体积。
3. 根据权利要求2所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于：富集木通皂苷D的富集液时，采用质量浓度50%的乙醇水溶液。
4. 根据权利要求2所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于：其中，富集用大孔吸附树脂的预处理：先用4倍量柱体积蒸馏水漂洗，再用质量浓度95％的乙醇浸泡12小时，然后用2倍柱体积质量浓度95％的乙醇淋洗以脱除致孔剂或低聚物，终点以流出的乙醇加水不显混浊为标准，流速为1BV/h，最后用4倍量柱体积蒸馏水洗至无醇味，流速为2BV/h。
5. 根据权利要求1所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于：其中，采用ODS-AA（50μm）、ODS-AQ（50μm）、ODS-AA（75μm）、ODS-AQ（75μm）、ODS-BP（40-60μm）大孔吸附树脂精制木通皂苷D的富集液，甲醇水溶液的质量浓度为10%-90%，洗脱液的体积为6-8倍量的柱体积。
6. 根据权利要求5所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于：精制木通皂苷D的富集液时，采用质量浓度50%-70%的甲醇水溶液脱液。
7. 根据权利要求1所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于：其中，采用ADS-7大孔吸附树脂精制木通皂苷D的富集液，由乙醇水溶液洗脱，乙醇水溶液的质量浓度为20%-70%，洗脱液的体积为4-8倍量的柱体积。
8. 根据权利要求7所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于：精制木通皂苷D的富集液时，采用质量浓度50%-70%的乙醇水溶液洗脱。
9. 根据权利要求7所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于：其中，ADS-7大孔吸附树脂的预处理：用2-4倍树脂体积的质量浓度5%的盐酸处理，流速1 BV/h；6倍柱体积水洗至中性，流速2BV/h；再用2-4倍柱体积的含质量3%氢氧化钠的50%乙醇水溶液洗脱，流速1 BV/h；6倍柱体积水洗至pH试纸检测为中性，流速2BV/h；再用3倍柱体积质量浓度4%氢氧化钠水溶液洗脱，流速为1BV/h；6倍柱体积水洗至pH试纸检测为中性，流速为2BV/h。
10. 根据权利要求5所述的大孔吸附树脂富集精制木通皂苷D的制备方法，其特征在于：其中，ODS大孔吸附树脂的预处理：以质量浓度95%的乙醇浸泡和洗涤，再用水洗至无醇味。
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