CN101161251A - 续断总皂苷及其提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种续断总皂苷,其重量百分数占续断药材提取物总量的60%~95%,并且续断总皂苷中3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷占续断药材提取物的30%~90%。本发明还公开了续断总皂苷的提取方法及其在制备防治颈椎病、关节炎、骨质增生或骨质疏松的药物方面的应用。通过对续断总皂苷的药理作用展开研究,发现本发明所得续断总皂苷有明显消炎、止痛,增加颈动脉流量和降低血粘度、对雌激素缺乏型骨质疏松有明显治疗作用等,对实验性颈椎病、关节炎、骨质增生和骨质疏有明显的防治作用。

Description

续断总皂苷及其提取方法和应用
技术领域
本发明涉及续断药材提取物-续断总皂苷,同时本发明还涉及续断总皂苷的提取方法及其应用。
背景技术
续断为川续断科植物川续断Dipsacus asperoides.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根。始载于《神农本草经》,列为上品,记载其“味苦,微温,主伤寒,补不足,金疮,痈疡,折跌,续筋骨,妇人乳难,久服益气力。一名龙豆,一名属折。”《名医别录》载“一名接骨。”李时珍谓“续断、属折、接骨,皆以功命名也。”从其命名可见续断自古就为骨伤科要药。中国药典2005版中记载:本品苦、辛,微温。归肝、肾经。补肝肾,强筋骨,续折伤,止崩漏。用于腰膝酸软,风湿痹痛,崩漏,胎漏,跌扑损伤。酒续断多用于风湿痹痛,跌扑损伤。
近代研究表明续断中主要化学成分有:皂苷类、环烯醚萜类、生物碱、挥发油、蔗糖、甾醇、钙、铁、镁、锰、锌、铜等微量元素及少量苷元。目前已从续断中分离出20多种皂苷,其中三萜皂苷中以3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(Asperosaponin VI)含量最高,而目前国内外对其各类或各个化成分的药理作用研究较少。
随着人类寿命的延长及老年型社会的出现,颈椎病、骨质增生和骨质疏松症的发病率在世界各国均呈明显增长趋势,已成为中、老年人的常见病、多发病之一。骨质疏松在亚洲一些国家骨质疏松被认定为大众性健康问题,称之为“不断增长的多发病”,WHO将之列为三大老年病之一,将6月24日定为“世界骨质疏松日”。临床事实是常于已发生骨质疏松的基础上骨质增生又继发而来。因为人活着离不开坐、立、行,在长时间固定于某种姿势或动作时,由于附着于骨骼之肌肉的反复牵拉,可致局部骨质的刺样或唇样突出,甚或变形及伴发骨面牵拽痛。骨质机械性地刺激周围软组织,又进一步损伤、出血与肿胀,从而形成恶性循环(陈树棠.骨质疏松与骨质增生的关系.家庭医学,1996,24:11)。
颈椎病和颈椎骨质增生都属于颈部疾患,二者有着密切的联系。当颈椎骨质增生刺激或压迫神经、脊髓、动脉而引起一系列症状时,即为颈椎病。桑进通过对100例颈椎端病人的X光线片分析结果表明颈椎骨质增生是颈椎病重要的也是最常见的表现,与颈椎病关系密切,特别是增生的部位意义更大(桑进.颈椎骨质增生与颈椎病.现代康复,1999,3(5):606)。
骨质疏松症、骨质增生和颈椎病是老年人多发的退行性疾病,可单发,也可能同时发病,只是临床症状表现不一而以。采用传统中医对三种病可同时治疗,时有良好效果,赵东林等人通过临床观察结果显示根痛宁胶囊对顶椎病、腰椎骨质增生症、骨质疏松症都有显著疗效,总有效率分别为89.3%,92.3%,92.5%,研究者认为根痛宁胶囊配伍合理,疗效确切(赵东林,任文杰,卢运超.根痛宁胶囊治疗颈椎病、腰椎骨质增生症及骨质疏松症的疗效观察.中国医院药学杂志,2007,27(1):77-78)。
本发明通过总结分析续断的传统用药情况,结合中医学、病理学、分子药理学和天然药物化学等学科知识,对续断总皂苷的药理作用展开研究,研究发现本发明所得续断总皂苷有明显消炎、止痛、活血通脉、补肝肾等作用,对实验性颈椎病、关节炎、骨质增生和骨质疏松有明显的防治作用,将续断总皂苷制备成制剂应用临床,服务于患者。
发明内容
本发明的目的是提供一种成分明确、质量可控、安全性好、纯度较高的续断药材提取物-续断总皂苷。
本发明的另一目的是提供一种工艺简单、提取率高的续断总皂苷的提取方法。
本发明的还有一个目的是提供续断总皂苷在制备防治颈椎病、关节炎、骨质增生或骨质疏松的药物方面的应用。
本发明提供的续断总皂苷由续断药材提取制备而得,续断总皂苷的重量百分数占续断药材提取物总量的60%~95%,并且续断总皂苷中3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷(下文简称XDS-VI)占续断药材提取物总量的30%~90%。
本发明提供了一种从续断药材中提取总皂苷的有效方法,提取所得样品中续断总皂苷重量百分比可达60~95%,其中XDS-VI达40%~90%。赵丽等人研究报道采用D101树脂纯化续断总皂苷的方法(赵丽,张长弓,钟巧妮等.大孔吸附树脂分离纯化五鹤续断总皂苷的工艺研究.医药导报2007,2(6):649-652),取续断药材用95%乙醇提取,回收乙醇,用纯化水稀释成每毫升相当于约0.09g生药,上柱用水洗后再用5倍柱体积的50%乙醇洗脱,收集醇洗脱液,回收乙醇,烘干,得总皂苷。重复文献资料试验表明水、树脂、醇用量均较大,所得总皂苷色泽较深,纯度不高。本发明提取纯化工艺研究结果表明:药材利用率高,总皂苷色泽较纯、较浅,3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷含量更高。本发明的提取方法的具体步骤是:
(1)取续断药材,用6-10倍量的40%~90%乙醇或水提取1~3次,每次回流1~3小时,合并提取液,减压浓缩,回收乙醇至无醇味,加水稀释成每毫升含0.2-1.5g药材的溶液,静置12~36小时,取上清液,超滤或微滤纯化,得滤液;
(2)将滤液加入D101、D201、AB-8或其它大孔树脂的层析柱上,循环吸附2-3次,用3~6倍量柱体积的0.5-5.0%的NaHCO3、NaOH或KOH碱液洗脱,再用3~6倍量柱体积水洗脱至中性,弃去两次洗脱液,再用3~8倍量柱体积的50%-95%乙醇洗脱,收集洗脱液,减压回收乙醇,浓缩、干燥,即得总皂苷。上述技术方案较已公开的提取方法创新了两步,首先是提取纯化采用静置除杂后,进一步采用超滤或微滤进行去除树脂、蛋白等大分子成分,在本方法中还起到脱色的作用;再者经反复研究在树脂纯化乙醇洗脱前,采用低浓度的碱进行洗脱除去一些酚酸性成分,如环烯醚萜类。经比较研究本发明提取纯化工艺药材利用率高,总皂苷色泽较纯、较浅,含量更高(见图1-3)。另降低了醇的浓度,提高了生产的安全性和降低生产成本。
本发明将水提液或醇提水沉液采用微滤或超滤技术去除大量无效的大分子成分和一些色素成分,进一步采用大孔树脂分离纯化技术对续断中皂苷进行分纯化。经本发明制得总皂苷纯度可达60-95%,且其中主要成分XDS-VI达30%以上。所得成分明确,便于临床用药样品质量控制和评价。
本发明提出了续断总皂苷在制备防治颈椎病、关节炎、骨质增生或骨质疏松的药物方面的应用,可与药用辅料混合制成缓释制剂、固体制剂或液体制剂。
本发明考虑中药皂苷类成分对胃肠道有不同程度的刺激性和本适应症临床用药时间较长的特点,为提高安全性和患者用药方便,设计成缓释制剂。本发明采用缓释制剂技术,将其制备成缓释片、胶囊或微丸,应用于临床,可提高生物利用度和增加疗效。具体技术方案是:
续断总皂苷同药用骨架性材料、稀释剂等混合制成缓释制剂,其组分及重量百分比含量为:
续断总皂苷  25%~80%
骨架性材料  10%~55%
稀释剂      1%~10%
各组分的重量百分比含量总和为100%。
上述骨架性材料为乙基纤维素、羟丙甲基纤维素等纤维素类或脂肪酸及其酯等;稀释剂为乳糖、微晶纤维素、甘露醇、淀粉、糊精或硫酸钙等。缓释制剂还可含2%~5%的润滑剂和/或1%~3%的助流剂。
续断总皂苷还可同药用辅料混合制成普通片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、贴剂或注射用冻干粉等固体制剂或制成口服液、软胶囊、膏剂或注射液等液体制剂。
本发明进一步研究了续断总皂苷药理作用,根据药理学研究原则,设计了相关实验动物模型,依据中医理论,进行了相关活血通脉、消炎止痛、补肝肾等试验。试验结果证实:
(1)续断总皂苷(XDS)可增加家兔颈总动脉血流量,与阴性对照组比较,中、大剂量组给药后60min、90min、120min均有显著性差异(P<0.05或P<0.01),提示XDS可增加家兔颈总动脉血流量。
(2)XDS可降低寒凝血瘀证大鼠全血粘度、血浆粘度和全血还原粘度,与模型对照组比较,中、大剂量组有显著性差异(P<0.05或P<0.01);降低血小板粘附率,与模型对照组比较,大剂量组有显著性差异(P<0.05);对血液纤维蛋白原含量、红细胞压积和血沉无明显影响。提示XDS可改善大鼠血液流变性,具有活血化瘀作用。
(3)XDS可明显抑制醋酸刺激的小鼠扭体反应,不同程度提高热刺激引起疼痛小鼠的痛阈;对二甲苯刺激小鼠耳部诱发的急性渗出性炎症和大鼠棉球肉芽肿的慢性炎症反应均有较强的抑制作用,使肿胀度减小,提示XDS有较强的抗炎镇痛作用。
(4)采用大鼠去除卵巢复制雌激素缺乏型骨质疏松模型,经3个月的治疗后XDS可明显改善卵巢摘除大鼠的骨密度和骨硬度,提高反应骨生成水平的血浆中BGP水平和抑制骨吸收。提示对雌激素缺乏型骨质疏松有明显治疗作用。
上述实验结果充分显示本发明药物对颈椎病、关节炎、骨质增生等引起的疼痛、炎症、血瘀等临床症状有明显治疗作用。实验结果还表明本发明药物可明显增加颈动脉流量和降低血粘度,提示本作用可能是颈椎骨质增生引起颈椎病的治疗作用机理之一。大鼠骨质疏松模型试验证明本发明药物对雌激素缺乏型骨质疏松有明显治疗作用。可见本发明可应用于制备颈椎病、关节炎、骨质增生和骨质疏松疾病的治疗药物。
附图说明
图1为XDS-VI对照品HPLC图;
图2为文献资料提取纯化工艺样品含量测定HPLC图;
图3为本发明提取纯化工艺含量测定HPLC图。
具体实施方式
以下列举具体实施例及药效学试验对本发明进行说明。实施例只用于对本发明作进一步说明,不代表本发明的保护范围,其他人根据本发明做出的非本质的修改和调整,仍属于本发明的保护范围。
实施例1
取续断1公斤,用8L 60%乙醇提取2次,每次回流2小时,合并提取液,减压浓缩,回收乙醇至无醇味,加水稀释成每毫升含0.6g药材液体,静置24小时,取上清液,用分子量为10000的中空纤维超滤,得滤液。将滤液加入1.2kgD101大孔树脂的层析柱上,循环吸附3次后,用4L 0.5%NaOH洗脱,再用5.5L水冲洗至近中性,弃去前两次洗脱液,再用6L 60%乙醇冲洗,收集60%乙醇洗脱液,减压回收乙醇,浓缩、干燥,得续断总皂苷102克,总皂苷含量85.7%,其中XDS-VI含量60.8%。
实施例2
取续断1公斤,用6L 80%乙醇提取2次,每次回流2小时,合并提取液,减压浓缩,回收乙醇至无醇味,加水稀释成每毫升含1.0g药材液体,静置36小时,取上清液,用Al2O3陶瓷膜微滤,得滤液。将滤液加入1.0kgAB-8大孔树脂的层析柱上,循环吸附2次后,用3L的0.5%NaOH洗脱,再用5L水冲洗,弃去洗脱液,再用5L 80%乙醇冲洗,收集洗脱液,减压回收乙醇,浓缩、干燥,得续断总皂苷98克,总皂苷含量78.3%,XDS-VI含量53.2%。
实施例3
取续断1公斤,用6L 90%乙醇提取2次,每次回流3小时,合并提取液,减压浓缩,回收乙醇至无醇味,加水稀释成每毫升含1.2g药材液体,静置36小时,取上清液,用0.45μm滤膜过滤,得滤液。将滤液加入1.2kg D201大孔树脂的层析柱上,循环吸附3次后,用4L的3.0%NaHCO3洗脱,再用6L水冲洗,弃去洗脱液,再用4L 95%乙醇冲洗,收集洗脱液,减压回收乙醇,浓缩、干燥,得续断总皂苷95克,总皂苷含量85.8%,XDS-VI含量71.9%。
实施例4
按1000个制剂单位投料计,取续断总皂苷300g,羟丙甲基纤维素100g,微晶纤维素10g,聚乙二醇6000 6g,硬脂酸镁4g,共制成1000片,规格:每片含续断总皂苷300mg,理论重量420mg。
上述原辅料分别事先过100目筛,按处方量称取续断总皂苷、羟丙甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙二醇,混合均匀,用95%药用乙醇制软材,过24目筛制粒,60℃条件下干燥4小时,20目筛整粒,加入硬脂酸镁,压片,得续断总皂苷缓释片927片。
实施例5
按1000个制剂单位投料计,取续断总皂苷100g,葡萄糖50g,甘露醇150g,共制成1000瓶注射用冻干粉,规格:每瓶含续断总皂苷100mg。
称取处方量的续断总皂苷、葡萄糖、甘露醇,加注射用水4500ml溶解;用1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至4.5~6.5;加入0.1%注射用活性碳,搅拌约30分钟;砂芯漏斗过滤;加注射用水至5000ml;以0.22μm滤膜过滤;测定中间体含量、灌装;冷冻干燥;盖胶塞、轧盖,得注射用续断总皂苷冻干粉965瓶,每瓶含总皂苷98.6mg。
实施例6
按1000个制剂单位投料计,取续断总皂苷200g,微晶纤维素40g,淀粉60g,羧甲基淀粉钠15g,滑石粉5g,共制成1000粒胶囊,规格:每粒含续断总皂苷200mg,理论重量320mg。
上述原辅料分别事先过80目筛,按处方量称取续断总皂苷、微晶纤维素淀粉60g,羧甲基淀粉钠15g,混合均匀,用80%药用乙醇制软材,过24目筛制粒,60℃条件下干燥4小时,20目筛整粒,加入滑石粉,填充胶囊,得续断总皂苷胶囊969粒。
药效学试验
一、试验材料
1、受试药物
续断总皂苷(XDS),由广州博济医药生物技术有限公司提供,批号:070201。用前以纯水配成所需浓度的混悬液。
2、对照药及主要试剂
强的松片,西安利君制药股份公司生产,批号0401027;颈复康颗粒,承德中药集团有限公司生产,批号030115;盐酸哌替啶注射液,湖北宜药集团有限公司生产,批号010205;复方丹参片,广州白云山制药股份有限公司生产,批号0401436;尼尔雌醇片由上海华联制药有限公司生产,批号:QS0110。
尿Hyp标准品由Sigma公司提供;U-Cr试剂盒为上海荣盛生物试剂厂产品;BGP试剂盒由北京长城免疫技术研究所提供。
3、仪器
LG-III型旋转筒式血液粘度测试仪,中国科学院传感技术公司生产;9103-B血小板粘附仪,中国科学院传感技术公司生产;3F-3型高速微量离心机,华兴机轮公司生产;RB100热板仪,成都泰盟仪器科技有限公司生产;SXC-1型生物信息测量系统,复旦大学医学院生理教研室、上海医科大学仪器厂生产;Powerlab/8sp系统及T Chart软件,ADInstruments产品;  MFV-1200型电磁流量计,日本光电公司生产;BS-124S电子天平,北京赛多利斯仪器有限公司生产。QDR-2000+型BMD仪(美国Hologic公司);INSTRON-1122型万能材料试验机(英国);游标卡尺(中国金华);80-1型离心沉淀机(中国上海)。
4、动物
NIH小鼠,质量合格证粤监证字第2004A064号;SD品系大白鼠,质量合格证粤监证字第2004A067号;新西兰大耳白家兔,质量合格证粤监证字第2004A062号,均由南方医科大学实验动物中心提供。
二、统计处理
采用SPSS统计软件进行组间方差分析或给药前后自身比较的t检验。
三、试验方法及结果
1、活血化瘀试验
1.1对家兔颈动脉血流量的影响
取家兔40只,雌雄各半,随机分为5组,每组8只。第一组为阴性对照组,给等容积纯化水;第二组为阳性对照组,给颈复康颗粒3.0g/kg;第三、四、五组为XDS大、中、小剂量组,分别给XDS 20、40、80mg/kg。术前静脉注射20%乌拉坦5ml/kg麻醉家兔,仰卧固定,切开颈部皮肤,分离气管并插管。然后分离左侧颈总动脉,结扎颈外动脉,在颈总动脉上放置电磁流量计探头,测量颈总动脉血流量。另切开腹壁,十二指肠插管以备给药。手术结束后停留20~30min,待颈总动脉血流量稳定后,记录正常值(给药前)。然后十二指肠给药,10ml/kg。给药后30、60、90、120min分别记录颈总动脉血流量。按下式计算颈总动脉血流量变化率,以变化率进行组间比较的统计学处理。结果见表1。
Figure S2007100315586D00081
表1 XDS对家兔颈动脉血流量的影响(
Figure S2007100315586D00082
ml/min)
组别    剂量(mg/kg)     动物数(只)     给药前血流量   给药后血流量
  30min   60min   90min   120min
  阴性对照组 - 8     203.3±16.3   193.7±24.1   194.5±28.9   197.5±26.2   196.7±21.3
  变化率(%)   -5.43±11.14   -5.59±9.87   -3.43±7.81   -3.43±6.54
  颈复康颗粒 3000 8     205.1±12.5   205.4±19.6   219.1±25.7   209.3±18.9   203.4±22.4
  变化率(%)   0.52±13.35   6.92±15.55*   2.15±9.90   -0.43±11.55
  XDS小剂量 20 8     197.3±19.7   204.1±22.3   198.3±19.5   186.1±24.6   193.7±21.6
  变化率(%)   3.69±12.76   1.25±16.22   -4.90±9.95   -1.44±9.43
  XDS中剂量 40 8     197.5±22.5   198.0±21.6   208.6±19.6   209.2±18.7   208.4±18.8
  变化率(%)     0.58±16.67   6.73±16.78*   6.67±15.65*   7.42±16.21*
  XDS大剂量 80 8   206.6±14.6     205.5±9.65   223.5±18.89   224.6±16.36   226.1±22.83
  变化率(%)     3.34±15.24   17.43±15.18**   15.58±18.64**   16.65±15.67**
与阴性对照组比较,  *P<0.05,  **P<0.01
由表1可见,XDS可增加家兔颈总动脉血流量,与阴性对照组比较,中、大剂量组给药后60min、90min、120min均有显著性差异(P<0.05或P<0.01),提示XDS可增加家兔颈总动脉血流量。阳性对照药颈复康颗粒也可轻度增加家兔颈总动脉血流量。
1.2寒凝血瘀证模型大鼠血液流变学的影响
大鼠60只,雌雄各半,随机分为6组,每组10只。第一组为正常对照组,给等容积纯化水;第二组为模型对照组,给等容积纯化水;第三组为阳性对照组,给复方丹参片0.6g/kg;第四、五、六组为XDS组,分别给XDS30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg。灌胃给药,等容量2ml/100g,每天给药一次,连续5天。试验第6天除正常对照组外,其余各组均按文献方法复制寒凝血瘀证模型。每只大鼠皮下注射肾上腺素8μg/kg,2小时后将大鼠浸入0℃冰水中5min,再过2小时后第二次皮下注射等量肾上腺素。然后禁食,12小时后乙醚麻醉下颈动脉采血,肝素抗凝,用于测定全血高切(200s-1)和低切粘度(40s-1)、血沉、红细胞压积并计算全血还原粘度;用热沉淀法测定血液纤维蛋白原含量;另取肝素抗凝血离心分离血浆,测定血浆粘度;再取枸橼酸钠抗凝血,用于测定血小板粘附率。结果见表2、表3。
表2 XDS对急性血瘀证大鼠血液粘度的影响(
Figure S2007100315586D00091
)
组别     剂量(mg/kg)   动物数(只)     全血粘度(mPa.s)     血浆粘度(mPa.s) 全血还原粘度(mPa.s)
    高切变率     低切变率
正常对照组    -     10     3.43±0.29     7.71±0.75     2.65±0.25 6.19±0.68
模型对照组 - 10     4.46±0.46##     9.48±1.35##     3.22±0.16## 8.32±0.84##
复方丹参片 500 10     3.12±0.12**     7.12±0.28**     2.84±0.14** 5.07±0.53**
XDS小剂量 30 10 4.03±0.43 8.37±0.16     2.91±0.35** 7.82±1.11
XDS中剂量 60 10   3.83±0.44*   8.03±0.87*   2.82±0.35** 6.63±1.02**
XDS大剂量 120 10   3.42±0.37**   7.48±0.75**   2.61±0.24** 5.78±0.78**
与正常对照组比较,##P<0.01;与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
表3 XDS对急性血瘀证大鼠血纤维蛋白原含量、血沉、血小板粘附率及红细胞压积的影响(
Figure S2007100315586D00101
)
组别 剂量(g/kg)     动物数(只)  纤维蛋白原(g/L) 血小板粘附率(%)  红细胞压积(%)      血沉(mm/h)
正常对照组模型对照组复方丹参片XDS小剂量XDS中剂量XDS大剂量 10105003060120     101010101010  2.12±0.232.65±0.42##2.30±0.212.39±0.282.31±0.262.32±0.33 24.2±4.634.4±5.2##28.4±3.1**32.4±2.630.6±4.328.3±3.0*  40.9±3.341.2±3.141.4±1.642.0±3.241.3±2.641.0±1.9  0.76±0.321.13±0.421.04±0.491.15±0.521.12±0.611.02±0.46
与正常对照组比较,##P<0.01;和模型对照组比较,*P<0.05
由表2及表3可见,寒凝血瘀证模型大鼠全血粘度、血浆粘度、全血还原粘度、血液纤维蛋白原含量和血小板粘附率明显增高,与正常对照组比较,统计学有显著性差异(P<0.01)。XDS降低急性血瘀证大鼠全血粘度、血浆粘度和全血还原粘度,与模型对照组比较,中、大剂量组有显著性差异(P<0.05或P<0.01);降低血小板粘附率,与模型对照组比较,大剂量组有显著性差异(P<0.05);对血液纤维蛋白原含量、红细胞压积和血沉无明显影响。提示XDS可改善大鼠血液流变性,具有活血化瘀作用。阳性对照药复方丹参片也可降低急性血瘀证大鼠全血粘度、血浆粘度、全血还原粘度及血小板粘附率。
2镇痛试验
2.1扭体法
小鼠50只,雌雄各半,随机分为5组,每组10只。第一组为阴性对照组,给等容积纯化水;第二组为阳性对照组,腹腔注射哌替啶注射液50mg/kg;第三、四、五组为XDS组,分别给XDS60mg/kg、120mg/kg、240mg/kg。除阳性对照组外,各组皆灌胃给药1次,0.5ml/10g。灌胃给药1小时后(腹腔注射30min后),腹腔注射0.6%醋酸溶液0.1ml/10g,观察记录15min内小鼠扭体反应(小鼠腹部贴地、内凹、伸展后肢、扭曲)次数,结果见表4。
表4 XDS对小鼠扭体反应的影响()
  组别    剂量(mg/kg)   动物数(只)   扭体反应(次/15min)
  阴性对照组哌替啶注射液XDS小剂量组XDS中剂量组XDS大剂量组    -5060120240   1010101010   22.2±10.20.9±1.12**14.8±7.97*9.3±5.50**9.6±6.09**
与阴性对照组比较  *P<0.05,**P<0.01
由表4可见,XDS可抑制醋酸刺激的小鼠扭体反应,与阴性对照组比较,中、大剂量组有显著性差异(P<0.01),提示XDS对醋酸刺激的疼痛有镇痛作用。阳性对照药哌替啶注射液也能明显抑制醋酸刺激的小鼠扭体反应。
2.2热板法
以小鼠舔后足作为疼痛表现,从小鼠接触热板到舔后足所需时间为痛阈指标。预先测定二次痛阈,取平均痛阈为10~30s的小鼠参加实验。取合格雌性ICR种小鼠50只,随机分为5组,每组10只。第一组为阴性对照组,给等容积纯化水;第二组为阳性对照组,腹腔注射哌替啶注射液50mg/kg,第三、四、五组为XDS组,分别给XDS60mg/kg、120mg/kg、240mg/kg。除阳性对照组外,各组皆灌胃给药1次,0.5ml/10g。给药前及给药后(灌胃给药1小时后,腹腔注射30min后)分别测定小鼠痛阈,如痛阈大于60s,以60s计算。结果见表5。
表5 XDS对小鼠痛阈的影响(
Figure S2007100315586D00112
)
  组别    剂量(mg/kg)   动物数(只)     痛阈值(s)
  阴性对照组哌替啶注射液XDS小剂量组XDS中剂量组XDS大剂量组    -5060120240   1010101010     21.5±11.4553.3±11.62**23.5±15.2126.1±15.7135.2±13.57*
与阴性对照组比较  *P<0.05,**P<0.01
由表5可见,XDS可不同程度提高小鼠痛阈,大剂量组有显著性差异(P<0.01),提示XDS对小鼠热刺激引起的疼痛有镇痛作用。阳性对照药哌替啶注射液也能提高小鼠痛阈。
3抗炎试验
3.1急性炎症试验
小鼠50只,雌雄各半,随机分为5组,每组10只。第一组为阴性对照组,给等容积纯化水;第二组为阳性对照组,给强的松片10mg/kg;第三、四、五组为XDS组,分别给XDS60mg/kg、120mg/kg、240mg/kg。各组皆灌胃给药,0.5ml/10g,每天1次,连续3天。末次给药1小时后,每鼠右耳涂二甲苯0.1ml致炎,左耳作为正常对照。致炎1小时后处死小鼠,用直径9mm的打孔器取下双侧耳片,分别称其重量,以两耳片重量之差作为肿胀度,按下式计算抑制率。结果见表6。
Figure S2007100315586D00121
表6 XDS对小鼠急性渗出性炎症的影响(
Figure S2007100315586D00122
)
    组别    剂量(mg/kg)     动物数(只)     肿胀度(mg)   抑制率(%)
  阴性对照组强的松片XDS小剂量XDS中剂量XDS大剂量    -1060120240     1010101010     10.23±1.234.45±2.13**8.15±2.33*6.89±2.21**6.58±1.89** 56.520.332.635.7
与阴性对照组比较  **P<0.01
由表6可见,XDS抑制二甲苯刺激小鼠耳部诱发的急性渗出性炎症反应,使肿胀度减小,与阴性对照组比较,各剂量组均有显著性差异(P<0.05或P<0.01),提示XDS有较强的抗急性渗出性炎症作用。阳性对照药强的松片也能明显抑制二甲苯刺激小鼠耳部诱发的急性渗出性炎症反应。
3.2慢性炎症试验
大鼠50只,雌雄各半,随机分为5组,每组10只。第一组为阴性对照组,给等容积纯化水;第二组为阳性对照组,给强的松片8mg/kg;第三、四、五组为XDS组,分别给XDS 30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg。在乙醚浅麻下,剪毛消毒,于下腹部正中切开皮肤,将重50mg的灭菌棉球植入两侧腹股沟皮下,然后缝合皮肤,消毒,整个过程为无菌操作。从手术前3天开始灌胃给药,2ml/100g,每天1次,连续10天。第11天处死大鼠,小心剥离取出棉球及包裹的肉芽组织,60℃干燥12小时后称重,减去原棉球重量即为肉芽组织重量,结果以每100g体重所含肉芽组织重量(双侧)表示。结果见表7。
表7 XDS对大鼠慢性增生性炎症的影响(
Figure S2007100315586D00123
)
组别 剂量(mg/kg) 动物数(只)     肉芽组织重量(mg/100g体重)
阴性对照组强的松片XDS小剂量XDS中剂量XDS大剂量 83060120     1010101010     45.2±13.621.7±6.2**39.1±10.2*30.3±7.9**26.6±7.4**
与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
由表7可见,XDS抑制棉球刺激的大鼠肉芽组织增生,与阴性对照组比较,各剂量组有显著性差异(P<0.05或P<0.01),提示XDS对大鼠慢性增生性炎症明显有抑制作用。阳性对照药强的松片也能抑制棉球刺激的大鼠肉芽组织增生。
4 XDS对去势雌鼠骨质疏松的影响
4.1实验方法
模型的复制  实验动物选用12月龄SD雌性大鼠60只,骨质疏松模型复制参照文献法(陈奇主编.中药药效研究思路与方法.北京:人民卫生出版社,2005:957),3%戊巴比妥腹腔麻醉,无菌条件下取腰椎两旁切口进入腹腔背侧,完整摘除双侧卵巢,止血缝合。假手术组除不摘除卵巢外,同法操作。缝合后,正常饲养。
实验分组与给药3个月后,将造模大鼠随机分为5组,分别为模型组,阳性药物对照组(尼尔雌醇片),XDS大剂量组(120mg/kg),XDS中剂量组(60mg/kg)、XDS小剂量组(30mg/kg)。假手术组与模型组大鼠灌胃法给服纯化水,1.0ml/100g体重,每天1次,XDS用药组,按规定剂量配制相应浓度,按1.0ml/100g体重,每天灌胃1次;阳性药物组尼尔雌醇片,根据大鼠剂量换算,每鼠每次0.01mg,每周1次;连续用药3个月为一疗程。
各组大鼠分笼饲养,自由摄取标准大鼠饲料(钙1.01%,磷0.78%),自由饮用蒸馏水。各组动物均在3个月后处死,处死前一天将大鼠分别置入代谢笼中收集12h空腹尿液;处死即刻剖开腹部,在后腔静脉处抽取静脉血,分离血清。血清及尿标本均置于-20℃冰箱保存,集中待测。处死大鼠后摘取右侧股骨,刮净肌肉备用。
观察指标及测定方法
(1)生化指标测定
用放免分析法测定血清中骨钙素(BGP)、用分光光度计法测定U-Cr、U-Hyp。
(2)全身骨密度(MBD)的测定
处死前,大鼠腹腔注射5%氯氨酮注射液10mg/100g,当大鼠呈现稳定的昏睡状态持续10min以上时,置于DPX-L型双能X线BMD仪(Lunar Co.U.S.A)的探头下,应用GMBD软件进行全身扫描,测定结果。
(3)骨抗弯强度(FBS)的测定
取大鼠右侧股骨,首先用游标卡尺测定股骨中段的宽度并计算截面积,然后将股骨放在万能材料试验机的支架上(跨距=25mm),以5mm/min的速度下压股骨中段,记录最大的压力载荷,最后计算抗弯强度(单位截面面积上最大的压力载荷)。
4.2结果
4.2.1各组大鼠GMBD、FBS的测定结果
13周后,XDS治疗大、中剂量组的GMBD和FBS明显高于模型组(P<0.05或P<0.01),但未达到假手术组水平,阳性对药组的GMBD和FBS均明显高于模型组(P<0.01)。提示XDS可明显改善卵巢摘除大鼠的骨密度和骨硬度,结果见表8。
表8  各组大鼠GBMD与FBS测定结果比较(X±S)
分组     剂量(mg/kg)     动物数(只)   GBMD(g/cm2)   FBS(N/mm2)
  假手术对照组模型对照组阳性对照组XDS小剂量组中剂量组大剂量组     --0.013060120     1010910910   0.4143±0.0160.34261±0.026##0.3942±0.017**0.3675±0.0380.3792±0.023*0.3907±0.015**   21.31±3.6115.45±2.35##18.42±3.75*16.44±2.5617.89±3.05*19.45±2.83**
注:与正常对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;
4.2.2各组大鼠生化指标测定结果
XDS大、中、小组的BGP明显高于模型组(P<0.05或P<0.01),在大剂量时接近正常组;XDS大、中组及西药组尿U-Hyp/Cr明显低于模型组(P<0.05),而XDS组尿Hyp/Cr仍然高于正常组。见表9。
表9各组大鼠S-BGP与U-Hyp/Cr的影响(X±S)
分组     剂量(mg/kg)     动物数(只) S-BGP(g/L) U-Hyp/Cr
  假手术组模型对照组西药对照组XDS低剂量组中剂量组高剂量组     --0.013060120     1010910910   3.017±0.2362.146±0.323##2.723±0.209**2.424±0.213*2.624±0.314**2.833±0.421**     0.027±0.0030.041±0.004##0.031±0.003*0.037±0.0040.035±0.003*0.031±0.004*
注:与正常对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;

Claims (10)

1.续断总皂苷,其特征在于由续断药材提取制备而得,续断总皂苷的重量百分数占续断药材提取物总量的60%~95%,并且续断总皂苷中3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1-6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷占续断药材提取物总量的30%~90%。
2.权利要求1所述续断总皂苷的提取方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)取续断药材,用6-10倍量的40%~90%乙醇或水提取1~3次,每次回流1~3小时,合并提取液,减压浓缩,回收乙醇至无醇味,加水稀释成每毫升含0.2-1.5g药材的溶液,静置12~36小时,取上清液,超滤或微滤纯化,得滤液;
(2)将滤液加入D101、D201、AB-8或其它大孔树脂的层析柱上,循环吸附2-3次,用3~6倍量柱体积的0.5-5.0%的碱液洗脱,再用3~6倍量柱体积水洗脱至中性,弃去两次洗脱液,再用3~8倍量柱体积的50%-95%乙醇洗脱,收集洗脱液,减压回收乙醇,浓缩、干燥,即得总皂苷。
3.根据权利要求2所述续断总皂苷的提取方法,其特征在于步骤(2)所述的碱液为NaOH、KOH或NaHCO3
4.权利要求1所述续断总皂苷在制备防治颈椎病、关节炎、骨质增生或骨质疏松的药物方面的应用。
5.根据权利要求4所述续断总皂苷的应用,其特征在于与药用辅料混合制成缓释制剂、固体制剂或液体制剂。
6.根据权利要求5所述续断总皂苷的应用,其特征在于所述的缓释制剂为缓释片、胶囊或微丸,其组分及重量百分比含量为:续断总皂苷25%~80%,骨架性材料10%~55%,稀释剂1%~10%,各组分的重量百分比含量总和为100%。
7.根据权利要求6所述续断总皂苷的应用,其特征在于所述的缓释制剂中,骨架性材料为乙基纤维素、羟丙甲基纤维素或脂肪酸及其酯;稀释剂为乳糖、微晶纤维素、甘露醇、淀粉、糊精或硫酸钙。
8.根据权利要求6所述所述续断总皂苷的应用,其特征在于所述的缓释制剂的组分中还含有2%~5%的润滑剂和/或1%~3%的助流剂,各组分的重量百分比含量总和为100%。
9.根据权利要求5所述续断总皂苷的应用,其特征在于所述的固体制剂为片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、贴剂或注射用冻干粉。
10.根据权利要求5所述续断总皂苷的应用,其特征在于所述的液体制剂为口服液、软胶囊、膏剂或注射液。
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