CN103961379B - 一种硫磺菌提取物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明还提供了一种硫磺菌提取物，所述的提取物中含有三氢化松苓酸B的重量百分含量为1‑12％。本发明还提供了该提取物及其中的化合物三氢化松苓酸B的用途。硫磺菌是常见食用真菌，安全性好，可以进行大规模发酵制备。制备得到的硫磺菌提取物质量稳定，可控性强；硫磺菌提取物以及分离得到的三氢化松苓酸B具有明显的抗炎活性，可用于治疗急慢性风湿性、类风湿性关节炎、急慢性肝炎、乳腺炎等炎性疾病，能够抑制COX2，减少PGE2等炎性介质释放，为临床提供了一种新的用药选择。

Description

一种硫磺菌提取物及用途

技术领域

本发明涉及一种硫磺菌提取物。

背景技术

硫磺菌(Ｌaetiporus sulphureus(Bull.)Murrill)又称硫色干酪菌、硫磺多孔菌，属担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，绚孔菌属。它是一种药食兼用的大型真菌。经常食用可增进身体健康，其子实体含齿孔酸(enruicoic acid)，可合成甾体药物肾上腺皮质激素，是预防和治疗多种疾病的重要药物。

目前关于硫磺菌功效的报道较少，如：申请号：99110871.X，发明名称：一种调理胃肠功能的硫磺菌制剂及其生产方法，本发明涉及一种调理胃肠功能的硫磺菌制剂及其生产方法。硫磺菌制剂包括:硫磺菌口服液、粉(散)、胶束、蜜丸剂型。本发明与一般具有相同功能的药品或保健品相比,有如下优点:迅速缓解病情,可产生即时药效应；对“气胀”病、结肠炎等疾病治愈率可达90％以上,而且不再重犯此类病状，它是直接将硫磺菌原生药粉入药。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种硫磺菌提取物。本发明的另一技术方案是提供了该提取物的用途。

本发明提供了一种硫磺菌提取物，其中，所述的提取物中含有三氢化松苓酸B的重量百分含量为1-12％。

它是硫磺菌子实体的有机溶剂提取物。

进一步优选地，所述的有机溶剂是95％乙醇。

该提取物的高效液相指纹图谱有4个特征峰，各特征峰的相对保留时间为(min)：峰1：33.11±0.1；峰2:35.13±0.1；峰3:50.46±0.1；峰4:52.21±0.1；

色谱条件为：液相色谱柱：色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；(AQ-C18，5um,4.6×250mm,velch)；流动相：10％-100％的乙腈水，50min；100％乙腈8min；检测波长：210nm。

该提取物的指纹图谱纹图谱具有8个特征峰，各特征峰的相对保留时间为(min)：峰1:34.57+0.1；峰2:36.27+0.1；峰337.13+0.1；峰4:39.03+0.1；峰5:42.30+0.1；峰6:49.14+0.1；峰7:50.93+0.1；峰8:52.15+0.1；

色谱条件为：液相色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；流动相：10％-100％的乙腈水，50min；100％乙腈8min；检测波长：254nm。

所述的指纹图谱如图2或图4所示。

本发明还提供了所述的硫横菌提取物或三氢化松苓酸B在制备抗炎的药物或/保健食品中的用途。

本发明还提供了所述的硫横菌提取物或三氢化松苓酸B在制备治疗急慢性风湿性、类风湿性关节炎或急慢性肝炎或乳腺炎的药物中的用途。

本发明还提供了所述的硫横菌提取物或三氢化松苓酸B在制备减少PGE2炎症介质释放的药物中的用途。

本发明还提供了所述的硫横菌提取物或三氢化松苓酸B在制备COX2抑制剂的药物中的用途。

其中，所述的药物是治疗胃炎、肠炎消化系统炎症；宫颈炎、等生殖系统炎症；尿道炎、肾炎泌尿系统炎症；急慢性咽炎、肺炎呼吸系统炎症的药物。

硫磺菌是常见食用真菌，安全性好，可以进行大规模微生物发酵制备。制备得到的硫磺菌提取物质量稳定，可控性强；硫磺菌提取物以及分离得到的三氢化松苓酸B具有明显的抗炎活性，可用于治疗急慢性风湿性、类风湿性关节炎、急慢性肝炎等炎性疾病，能够抑制COX2，减少PGE2等炎性介质释放，可减少胃酸分泌，保护胃，减轻抗炎药物对胃的不良反应，为临床提供了一种新的用药选择。

附图说明

图1硅胶柱洗脱物高效液相分析图

图2硫磺菌提取物波长210时局部放大高效液相分析图

图3硫磺菌提取物波长210时高效液相分析图

图4硫磺菌提取物波长254时高效液相分析局部放大图

图5硫磺菌提取物波长254时高效液相分析图

图6对照品波长210时高效液相分析图

图7 HE染色(放大200倍)

图8 M染色放大200倍

图9三氢化松苓酸B与COX2结合模型

具体实施方式

实施例1硫磺菌提取物及三氢化松苓酸B的制备

1、实验材料

1.1、实验用菌

硫磺菌(Laetiporus sulphureus(Fr.)Muttill)由三峡旅游职业技术学院王绍柏教授鉴定并提供子实体及菌株。

1.2、实验试剂

95％的医用酒精、双蒸水、色谱级乙腈、石油醚、丙酮等。

1.3、实验仪器

KQ-500DB型超声波清洗仪，艾朗旋转蒸发仪(德国)，ME215S型十万分之一电子天平(德国Sartorios公司)，紫外分光光度计(UV—2201,日本岛津公司)，高效液相色谱仪(DIONEX Ultimate3000,美国戴安液相色谱有限公司)，核磁共振仪(UltrashiedTM400MHZPlus,bruker布鲁克公司)，冷冻干燥机(FREEZ0NE PLUS6,LABCONCO)。

2、实验方法与结果

2.1、硫磺菌醇提物的制备

将100g硫磺菌子实体用95％的乙醇回流提取三次，每次1.5h，趁热过滤并合并三次滤液，与旋转蒸发仪上减压除去乙醇，得流浸膏50g,再将提取物于50℃烘干，得25g醇提物。

2.2、三氢化松苓酸B的制备与鉴定

将上述醇提物用石油醚：丙酮＝3:1作洗脱剂经硅胶柱分离，所得洗脱物占醇提取物的24％，再将洗脱物经HPLC分析其成分，条件为双蒸水(A)-乙腈(B)洗脱体系洗脱，B/A＝95％，洗脱物中主要有化合物1(见图.1)。

精确称取60mg洗脱物，用B/A＝95％作流动相，经高效液相色谱分离，得18mg化合物1。按同法制备化合物1，供实验用。

经核磁鉴定，化合物1：¹³C-NMR(DMSO-d6,500MHz):177.1,134.4,133.5,131.2,124.0,76.9,50.2,49.2,47.6,46.7,43.9,38.7,36.7,35.4,32.3,30.2,28.5,28.2,27.7,26.6,26.1,25.7,25.6,24.2,20.4,19.1,18.0,17.5,15.9,15.7；1H-NMR(DMSO-d6,500MHz):0.68(s,3H),0.69(s,3H),0.81(s,3H),0.90(s,3H),0.90(s,3H),1.52(s,3H),1.62(s,3H),4.25(d,J＝3.5Hz,1H),5.06(s,1H),11.96(s,1H).

与文献对照，符合三氢化松苓酸B的结构。

2.3、硫磺菌醇提物的高效液相特征分析

实验仪器

高效液相色谱仪(DIONEX Ultimate3000,美国戴安液相色谱有限公司)，液相色谱柱AQ-C18，5um,4.6×250mm,velch)

实验试剂

色谱级乙腈(TEDIA)，蒸馏水，色谱级甲醇(TEDIA),四氢呋喃(分析纯)

实验方法

将2.1mg样品于1.2ml甲醇与四氢呋喃混合物中溶解，过滤，待用；将对照品1.6mg三氢化松苓酸B和1.1mg齿孔酸用0.6ml甲醇与四氢呋喃混合物中溶解，过滤，待用；

将高效液相色谱分析条件设为；10％-100％的乙腈水,50min；100％乙腈8min，共计58min，进样量为10ul。

实验结果，见图2-图6。

实施例2本发明药物片剂的制备

取硫磺菌醇提物或三氢化松苓酸B，加入淀粉和1％硬脂酸镁，压片，使每片含硫磺菌醇提物0.1-1.0g,或齿孔酸10-100mg。(所用的辅料可以是微晶纤维素、改性淀粉、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等片剂常用的辅料中的一种或几种)。

实施例3本发明药物胶囊剂的制备

取硫磺菌醇提物或三氢化松苓酸B，加入淀粉，制粒，整粒，装胶囊，每粒胶囊中含硫磺菌醇提物0.1-0.5g,或三氢化松苓酸B10-100mg。(所用的辅料可以是微晶纤维素、改性淀粉、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等胶囊剂常用的辅料中的一种或几种)。

实施例4本发明药物软膏剂的制备

取硫磺菌醇提物或三氢化松苓酸B，加入羊毛脂、凡士林、单硬脂酸甘油脂等辅料制作成软膏，每100g软膏中含硫磺菌醇提物0.1-0.5g,或齿孔酸三氢化松苓酸B10-100mg。

以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1硫磺菌提取物及三氢化松苓酸B小鼠耳廓肿胀实验

1、实验材料

1.1实验动物

体重18-22g；雄性昆明小鼠。由三峡大学动物实验中心提供(生产许可证：SCXK(鄂)2011-0012；使用许可证：SYXK(鄂)2011-0061)。

1.2实验试剂

二甲苯，4％CMC

1.3仪器

ME215S型十万分之一电子天平(德国Sartorios公司)

2、实验方法与结果

2.1、实验方法

2.1.1、造模与给药方式

将实验小鼠随机分组，分别为对照组、阳性组、硫磺菌提取物高剂量组、中剂量组、低剂量组和三氢化松苓酸B低剂量组和高剂量组，每组10只。连续灌胃给药5天。

2.1.2、检测指标与检测方法

(1)末次给药后1h后，将各组小鼠右耳上、下两面分别均匀涂抹二甲苯20μl致炎，左耳作为空白对照，20min后处死小鼠，剪下双耳，用6mm直径的打孔器冲下耳片，随即在电子天平称重并记录。用右耳重量减去左耳重量作为肿胀度，并计算肿胀率。

计算公式：

耳肿胀度＝左耳片重(g)-右耳片重(g)

肿胀率＝(对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度×100％

(2)采用SPSS11.5统计软件对数据处理。先进行数据的正态分布检验，方差齐性检验，组间比较采用方差分析。计量数据用均数±标准差表示，组间差异用单因素方差分析，多个样本均数间每两个均数的比较采用Q检验。P<0.05说明有差异，P<0.01为有显著性差异。

2.2、实验结果

硫磺菌酒精提取物对二甲苯所致小鼠急性耳肿胀的影响(见表1)

表1硫磺菌醇取物及TAB对小鼠耳廓肿胀的影响N＝8)

注：与对照组比较*p<0.05,**P<0.01；与阳性组比较#p<0.05，##P<0.01；N表示样本数目。

实验结果表明：阳性组耳肿胀度低于对照组，有差异有显著性(P<0.05),硫磺菌提取物高剂量组、中剂量组、低剂量组和三氢化松苓酸B低剂量组、高剂量组小鼠的耳肿胀度均明显低于对照组,组间均有明显差异(P<0.01)，有统计学意义，说明以上给药组对二甲苯所致小鼠耳肿胀有抑制作用。且硫磺菌醇提物高剂量组的耳肿胀度低于阳性组，组间有差异(P<0.05)，三氢化松苓酸B高剂量耳肿胀度明显低于阳性组(P<0.01)，有统计学意义。说明硫磺菌高剂量和三氢化松苓酸B高剂量组对二甲苯所致小鼠耳肿胀的抑制作用优于阳性组。

试验例2本发明药物大鼠慢性肝损伤实验

1、实验材料

1.1、实验动物

雄性SD大鼠，180-200g，由三峡大学动物实验中心提供(生产许可证：SCXK(鄂)2011-0012；使用许可证：SYXK(鄂)2011-0061)。

1.2、实验试剂

丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20100515；

天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20100515；

其他试剂皆为分析纯。

1.3、仪器

ME215S型十万分之一电子天平(德国Sartorios公司)Stat Fax-2100型酶标仪(单通道)，美国Awareness公司；U-3010紫外-可见分光光度计，日本Hitachi High-Technol公司；DMR多功能显微镜及图象分析系统，德国Leica公司；TP1020组织脱水机，德国Leica公司；超薄石蜡切片机，德国Leica公司；Suprafuge22高速冷冻离心机，德国HeraeusINSTRUMENTS公司

2、实验方法与结果

2.1、实验方法

2.1.1、给药方法与剂量：

取健康SD大鼠40只，随机分成4组，分别为空白对照组，模型组，硫磺菌醇提物高剂量组，硫磺菌醇提物低剂量组，三氢化松苓酸B低剂量组，三氢化松苓酸B高剂量组。验室中常规饲养，观察1天。从第2天开始，按照10mL/kg的剂量连续灌胃56天，除空白组腹腔注射0.2ml/只纯橄榄油外，其他组都用50％的四氯化碳橄榄油来代替，每隔4天造模一次。

2.1.2检测指标和方法

(1)血清样品的收集

最后一次给药后，禁食不禁水过夜，大鼠腹腔主动脉取血，自然凝结后分离血清，按照试剂盒说明书叙述的方法检测血清中天门冬氨酸氨基转移酶(ALT)、丙氨酸氨基转移酶(AST)的水平。

(2)肝组织样品处理

处死小鼠后剖取肝脏，4℃生理盐水冲尽表面浮血，滤纸拭干、称重，按肝指数＝[肝脏湿重(g)/体重(g)]×100计算大鼠肝指数，脾脏指数＝脾脏重(mg)/体重(kg)计算大鼠脾指数，胸腺指数＝胸腺重(mg)/体重(kg)计算胸腺指数；然后取小鼠肝脏右叶同一部位切成小片,4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作厚4μm连续切片，苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下察肝组织病变程度；胶原纤维染色(Masson染色)，显微镜下观察胶原沉积情况。

(3)统计学方法

采用SPSS11.5统计软件对数据处理。先进行数据的正态分布检验，方差齐性检验，组间比较采用方差分析。计量数据用均数±标准差表示，组间差异用单因素方差分析，多个样本均数间每两个均数的比较采用Q检验。P<0.05说明有差异，P<0.01为有显著性差异。

2.2、实验结果

2.2.1、硫磺菌醇提物及三氢化松苓酸B对大鼠脏器指数的影响(见表2)表2硫磺菌醇提取物及TAB对大鼠脏器指数的影响N＝7)

注：与空白组比较*p<0.05,**P<0.01；与模型组比较#p<0.05。

实验结果显示与空白组比较，模型组大鼠肝指数有明显升高(P<0.01)，给药组比模型组的肝脏指数都有减小(P<0.05)；空白组与模型组比较，脾脏指数变化不大，与给药组比较，差异有显著性(P<0.05)或(P<0.01)；与空白组比较，模型组，给药低剂量组胸腺指数提高不明显，与给药高剂量组有显著性差异(P<0.05)。

2.2.2、硫磺菌醇提物及三氢化松苓酸B对慢性肝损大鼠血清中AST和ALT的影响(见表3)

表3硫磺菌醇提物及TAB对肝损伤大鼠血清中AST和ALT含量影响数据表N＝6)

注：与模型组比较*p<0.05,**P<0.01。

结果显示：与空白组比较，模型组大鼠血清中的AST和ALT含量都明显升高,差异有显著性(p<0.01)；与模型组比较醇取物和三氢化松苓酸B组大鼠血清中AST和ALT含量都明显减小，差异有显著性(p<0.01)。

2.2.3、组织切片染色

(1)硫磺菌醇提物及三氢化松苓酸B对肝纤肝损伤大鼠肝组织变化的影响

空白组大鼠肝脏表面光滑，色泽红润，显微镜观察显示肝细胞排列整齐，无明显病变症状；模型组大鼠肝脏显著增大，表面布满大小不一的颗粒状突起。有大量肝细胞损伤和炎性细胞浸润。硫磺菌醇取物、三氢化松苓酸B组大鼠肝脏明显好于模型组，肝纤损伤和炎性浸润程度明显降低。(见图7)

(2)硫磺菌醇提物及三氢化松苓酸B对肝损伤大鼠肝组织胶原沉积的影响

空白组大鼠肝脏中只存在极少量的胶原表达，而模型组大鼠的肝脏中存在大量的蓝色胶原沉积，呈片状分布；硫磺菌醇取物、三氢化松苓酸B组均能降低肝纤损伤大鼠肝脏中的胶原沉积。(见图8)

试验例3本发明药物大鼠类风湿关节炎试验

1、实验材料

1.1、实验动物

雄性SD大鼠，180-200g，由三峡大学动物实验中心提供(生产许可证：SCXK(鄂)2011-0012；使用许可证：SYXK(鄂)2011-0061)。

1.2、实验试剂

Rat IL-6ELISA KIT,USA；Rat TNF-αELISA KIT,USA，Rat PGE₂ELISA KIT，USA；其他试剂皆为分析纯。

1.3、仪器

ME215S型十万分之一电子天平(德国Sartorios公司)Stat Fax-2100型酶标仪(单通道)，美国Awareness公司；U-3010紫外-可见分光光度计，日本Hitachi High-Technol公司；DMR多功能显微镜及图象分析系统，德国Leica公司；TP1020组织脱水机，德国Leica公司；超薄石蜡切片机，德国Leica公司；Suprafuge22高速冷冻离心机，德国HeraeusINSTRUMENTS公司,YZS-7C足趾容量测量仪,济南益延科技发展有限公司。

1、实验方法与结果

2.1、实验方法

2.1.1、造模与给药方法：

除空白组外，每只大鼠右后脚注射0.1ml弗氏佐剂造模，之后给与药物。空白组；0.5％CMC，模型组：0.5％CMC，硫磺醇取物高剂量组和低剂量组；400mg/kg，200mg/kg硫磺菌醇提物，三氢化松苓酸B高剂量组和低剂量组：40mg/kg，20mg/kg三氢化松苓酸B,连续灌胃35天。造模后第7天开始测足肿胀，每周测一次足肿胀及体重，根据体重调整用药量。

足肿胀度计算公式：

足肿胀度＝右后足跖体积(ml)-左后足跖体积(ml)；

2.1.2、观察指标：

大鼠造模后是否出现：活动减少，倦怠乏力，情绪低落，皮毛暗淡无光泽，食欲下降，轻度腹泻和鼻粘膜充血等关节外症。

2.1.3检测指标和方法

(1)血清样品的收集

腹腔主动脉取血后，脱颈处死，全血样本自然凝结30min后2000r/min离心15min，分离血清，-20℃保存按照试剂盒说明书叙述的方法检测血清中IL-6、TNF-α、PGE₂的含量。

(2)关节组织样品处理

取大鼠左右后肢的踝关节剥去皮肉置于4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作厚4μm连续切片，苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下察肝组织病变程度；足趾关节剥去皮肉包在锡箔纸中，-20℃保存，组织匀浆，按照试剂盒说明书叙述的方法检测滑膜组织中IL-6、TNF-α、PGE₂的含量。

(3)统计学方法

采用SPSS11.5统计软件对数据处理。先进行数据的正态分布检验，方差齐性检验，组间比较采用方差分析。计量数据用均数±标准差表示，组间差异用单因素方差分析，多个样本均数间每两个均数的比较采用Q检验。P<0.05说明有差异，P<0.01为有显著性差异。

2.2、实验结果

2.2.1、观察现象：

大鼠右后足至炎后Id开始发红并逐渐肿胀、表面皮肤绷紧发亮，触之有明显的躲避行为，模型组大鼠情绪暴躁，毛色暗淡；第6天开始，处空白组外，都有腹泻症状，与空白组比较食欲未明显减少；第20天，所有至炎大鼠关节活动度明显变差，腹泻症状减轻。

2.2.2、硫磺菌提取物和三氢化松苓酸B对大鼠足肿胀度的影响(见表4)

表4硫磺菌醇提物及TAB对大鼠足肿胀度(ml)的影响N＝7)

注：与模型组比较*p<0.05,**P<0.01。

结果显示：模型组与空白组比较有显著差异(P<0.01)，7天后，硫磺和三氢化松苓酸B剂量组大鼠与模型组比较有差异有显著性(P<0.05)，说明硫磺菌醇提物、三氢化松苓酸B能很好地抑制大鼠的足趾肿胀。

2.2.3、硫磺菌提取物和三氢化松苓酸B对关节炎大鼠血清和病患关节滑膜组织中IL-6、TNF-a、PGE₂含量的影响(见表5和表6)。

表5硫磺菌醇提物及TAB对关节炎大鼠血清中IL-6、TNF-a、PGE2含量的影响N＝3)

注：与模型组比较*p<0.05,**P<0.01。

有上述表格可知：与空白组比较，模型组血浆中IL-6、TNF-a和PGE₂的含量均明显升高，差异有显著性(P<0.01)；与模型组比较给药组均能使关节炎大鼠血浆中IL-6、TNF-a和PGE₂的含量不同程度的下降(P<0.05，P<0.01)，尤其是硫磺菌醇提物及三氢化松苓酸B高剂量组大鼠的血浆中IL-6、TNF-a和PGE₂的含量与正常组大鼠相当，说明硫磺菌提取物和三氢化松苓酸B能减少风湿关节炎大鼠血清中IL-6、TNF-a和PGE₂等炎性介质含量。

表6硫磺菌醇提物及TAB对关节炎大鼠滑膜组织中IL-6、TNF-a、PGE2含量的影响N＝3)

注：与模型组比较*p<0.05,**P<0.01。

结果显示，与空白组比较，模型组大鼠病患滑膜组织中的IL-6、TNF-a和PGE₂的含量均有不同程度的升高(P<0.05，P<0.01)，与模型组比较，各给药组能明显降低关节炎大鼠病患滑膜组织中的IL-6、TNF-a和PGE₂的含量(P<0.01)。表明硫磺菌醇提物和三氢化松苓酸B能减少风湿关节炎大鼠病患滑膜组织中的IL-6、TNF-a和PGE₂等炎症介质含量。

试验例4本发明药物大鼠乳腺炎试验

1、实验材料

1.1、实验动物

SD大鼠，雌性40只，体质量250～280g：雄性20只，体质量300～350g，由三峡大学动物实验中心提供(生产许可证：SCXK(鄂)2011-0012；使用许可证：SYXK(鄂)2011-0061)。

1.2、实验试剂

内毒素(Sigma公司，O55﹕B5血清型大肠杆菌分离提纯)。

Rat TNF-αELISA KIT,USA，NAGase，AKP试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。其他试剂皆为分析纯。

1.3、仪器

ME215S型十万分之一电子天平(德国Sartorios公司)Stat Fax-2100型酶标仪(单通道)，美国Awareness公司；U-3010紫外-可见分光光度计，日本Suprafuge22高速冷冻离心机，

2、实验方法与结果

2.1、实验方法

2.1.1、造模与给药方法：

动物适应性饲养1周后，将雌鼠与雄鼠按2：1比例同笼饲养，使之交配受孕。确认雌鼠怀孕后，将其随机分为6组，每组6只，正常对照组(n＝6)，模型组(n＝6)给予生理盐水，硫磺菌醇提物高(400mg/kg^-1.d^-1,n＝6)、低(200mg/kg^-1.d^-1,n＝6)2个剂量实验组；三氢化松苓酸B高(40mg/kg^-1.d^-1,n＝6)、低(20mg/kg^-1.d^-1,n＝6)2个剂量实验组。给药时间自妊娠第1天直至处死(产后4d).模型组及实验组分别于产后72h经乳头管注入内毒素0.05mL(50ug)，正常对照组于产后72h经乳头管注入灭菌生理盐水0.05mL.灌注后24h将雌鼠颈静脉放血处死。

2.1.2、检测指标和方法

(1)血清样品的收集

收集颈静脉血，3000r/min离心15min分离血清，-20℃保存按照试剂盒说明书叙述的方法检测血清中TNF-α、NAGase，AKP的含量。

(2)乳腺组织样品处理

雌鼠颈静脉放血处死后，分离第4对乳腺，取适量乳腺组织，按1:6(W/V)加入生理盐水，冰浴匀浆后，3000r/min离心30min，上清液-20℃保存待测。按照试剂盒说明书叙述的方法检测组织中TNF-α、NAGase，AKP的含量。

(3)统计学方法

采用SPSS11.5统计软件对数据处理。先进行数据的正态分布检验，方差齐性检验，组间比较采用方差分析。计量数据用均数±标准差表示，组间差异用单因素方差分析，多个样本均数间每两个均数的比较采用Q检验。P<0.05说明有差异，P<0.01为有显著性差异。

2.2、实验结果

2.2.1、硫磺菌提取物和三氢化松苓酸B对乳腺炎大鼠血清IL-6、TNF-a、PGE2含量的影响(见表7)

表7硫磺菌醇提物及TAB对乳腺炎大鼠血清IL-6、TNF-a、PGE2含量的影响N＝7)

注：与模型组比较*p<0.05,**P<0.01。

2.2.2、硫磺菌提取物和三氢化松苓酸B对大鼠乳腺组织中IL-6、TNF-a、PGE2含量的影响(表8)。

表8硫磺菌提取物和三氢化松苓酸B对大鼠乳腺组织中细胞因子和酶的影响N＝3)

注：与模型组比较*p<0.05,**P<0.01。

结果显示：与空白组比较，模型组大鼠血清、乳腺组织中的IL-6、TNF-a和PGE₂的含量均有不同程度的升高(P<0.01)，与模型组比较，各给药组能明显降低乳腺炎大鼠血清、乳腺组织中的IL-6、TNF-a和PGE₂的含量(P<0.01)。表明硫磺菌醇提物和三氢化松苓酸B能减少乳腺炎大鼠IL-6、TNF-a和PGE₂等炎症介质含量，发挥抗炎作用。

2.2.3、计算机辅助药物设计

采用诱导契合柔性对接，设置如下：群规模：50；最大代数：2000；变异概率：0.2000；交叉概率：0.8000；结合位点盒子大小为12&Aring；×12&Aring；×12&Aring。

结果：三氢化松苓酸B与COX2作用活性较好，GScore＝-14.58,IFDCore＝-979.55，结合模型见图9。

计算和实验结果表明：三氢化松苓酸B可通过与COX2结合，从而抑制COX2活性，减少PGE₂等炎症介质含量，实验抗炎作用。

Claims (7)

1.硫磺菌提取物在制备减少PGE2炎症介质释放的药物中的用途，其中，所述的硫磺菌提取物中含有三氢化松苓酸B的重量百分含量为1-12%，所述的药物为治疗类风湿关节炎、乳腺炎的药物。

2.硫磺菌提取物在制备COX2抑制剂的药物中的用途，其中，所述的硫磺菌提取物中含有三氢化松苓酸B的重量百分含量为1-12%，所述的药物为治疗类风湿关节炎、乳腺炎的药物。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的硫磺菌提取物是硫磺菌子实体的有机溶剂提取物。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的有机溶剂是95%乙醇。

5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的硫磺菌提取物的高效液相指纹图谱有4个特征峰，各特征峰的保留时间为：峰1：33.11±0.1 min；峰2：35.13±0.1 min；峰3：50.46±0.1 min；峰4：52.21±0.1 min；

色谱条件为：液相色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；流动相：10%-100%的乙腈水，50min，100%乙腈，8min，共计58min，进样量为10ul；检测波长：210nm。

6.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的硫磺菌提取物的指纹图谱具有8个特征峰，各特征峰的保留时间为：峰1：34.57+0.1 min；峰2：36.27+0.1 min；峰3：37.13+0.1min；峰4：39.03+0.1 min；峰5：42.30+0.1 min；峰6：49.14+0.1 min；峰7：50.93+0.1 min；峰8：52.15+0.1 min；

色谱条件为：液相色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；流动相：10%-100%的乙腈水，50min，100%乙腈，8min，共计58min，进样量为10ul；检测波长：254nm。

7.三氢化松苓酸B在制备减少PGE2炎症介质释放的药物中的用途，其中，所述的药物为治疗类风湿关节炎、乳腺炎的药物。

8. 三氢化松苓酸B在制备COX2抑制剂的药物中的用途，其中，所述的药物为治疗类风湿关节炎、乳腺炎的药物。