CN104262354B - 一种制备8-甲氧基补骨脂素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备8-甲氧基补骨脂素的方法。本发明所提供的制备8-甲氧基补骨脂素的方法，包括用溶剂A浸提毛大丁草，收集浸提液，得到8-甲氧基补骨脂素；所述溶剂A为乙醇水溶液、乙酸乙酯、水和二氯甲烷中的任一种。本发明首次从中药材毛大丁草(Gerbera？piloselloides)中获得8-甲氧基补骨脂素，从而为获得8-甲氧基补骨脂素提供了新的途径。该制备方法简单，避免了繁琐柱层析分离纯化过程，易于操作，容易在工业上推广。

Description

一种制备8-甲氧基补骨脂素的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域中从中药材中提取药用成分的方法，具体是一种从毛大丁草中制备8-甲氧基补骨脂素的方法。
背景技术
毛大丁草(Gerberapiloselloides)为菊科大丁草属植物,是多年生被毛草本植物。临床报道毛大丁草全草入药，具有止咳、祛痰、平喘等作用。毛大丁草主要分布于我国的西藏、云南、四川、贵州、广西、广东、湖南、湖北和江西等地。
8-甲氧基补骨脂素(如式1所示)属呋喃香豆素类化合物，该化合物在临床治疗白癜风和银屑病主要是通过光敏反应发挥生物效应。补骨脂素光化学疗法(PUVA)是美国FDA以及欧洲许多国家认可的治疗白癜风和牛皮癣的最好方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备8-甲氧基补骨脂素的方法。
本发明所提供的制备8-甲氧基补骨脂素的方法，包括用溶剂A浸提毛大丁草，收集浸提液(提取液)，得到8-甲氧基补骨脂素；所述溶剂A为乙醇水溶液、乙酸乙酯、水和二氯甲烷中的任一种。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，所述方法包括除去所述浸提液含有的所述溶剂A，得到含有8-甲氧基补骨脂素的粗提物，除去所述粗提物含有的杂质，得到8-甲氧基补骨脂素。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，所述除去所述粗提物含有的杂质包括以下步骤：将所述粗提物加水溶解，得到含有8-甲氧基补骨脂素的粗提液，向所述粗提液中加入石油醚进行萃取，收集水相，该水相为含有8-甲氧基补骨脂素的提取液2，除去所述提取液2的杂质，得到8-甲氧基补骨脂素。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，所述除去所述提取液2的杂质包括以下步骤：向所述提取液2中加入溶剂B进行萃取，收集溶剂B相，所述溶剂B相为含有8-甲氧基补骨脂素的萃取液；除去所述萃取液含有的所述溶剂B，得到8-甲氧基补骨脂素的萃取物，除去所述萃取物中的杂质，得到8-甲氧基补骨脂素；
所述溶剂B为甲苯、乙酸乙酯、乙酸乙酯-石油醚混合液或二氯甲烷。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，所述除去所述萃取物中的杂质包括将所述8-甲氧基补骨脂素的萃取物用溶剂C溶解，重结晶析出8-甲氧基补骨脂素(向所述8-甲氧基补骨脂素的萃取物中加入溶剂C，使8-甲氧基补骨脂素结晶析出，得到8-甲氧基补骨脂素)；所述溶剂C为乙醇、异丙醇或乙酸乙酯-石油醚。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，所述毛大丁草为大丁草属植物毛大丁草(Gerberapiloselloides)的全草。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，所述溶剂A为乙醇水溶液；所述乙醇水溶液中乙醇的浓度可为40％-80％，所述40％-80％具体可为40％-70％，所述40％-70％具体可为40％-50％或50％-70％，所述50％-70％具体可为50％-60％或60％-70％，如60％。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，所述毛大丁草与所述溶剂A的配比为1g所述毛大丁草：5-30ml所述溶剂A。所述1g所述毛大丁草：5-30ml所述溶剂A具体可为1g所述毛大丁草：5-20ml所述溶剂A；所述1g所述毛大丁草：5-20ml所述溶剂A具体可为1g所述毛大丁草：5-15ml所述溶剂A；所述1g所述毛大丁草：5-15ml所述溶剂A具体可为1g所述毛大丁草：5-10ml所述溶剂A；所述1g所述毛大丁草：5-10ml所述溶剂A具体可为1g所述毛大丁草：10ml所述溶剂A。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，用溶剂A浸提毛大丁草是将所述毛大丁草在所述溶剂A中浸泡4-8小时，所述4-8小时具体可为4小时。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，所述石油醚与所述粗提液的体积比可为1：1。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，所述溶剂B为甲苯、乙酸乙酯、乙酸乙酯-石油醚混合液或二氯甲烷，具体可为甲苯。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，所述乙酸乙酯-石油醚混合液中，所述乙酸乙酯与所述石油醚的体积比可为1：1。
上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法中，所述重结晶在室温或-4℃下进行。
用上述制备8-甲氧基补骨脂素的方法制备的8-甲氧基补骨脂素。
实验证明，通过本发明的8-甲氧基补骨脂素的提取方法提取210g毛大丁草中的8-甲氧基补骨脂素，共得8-甲氧基补骨脂素晶体1.6g。本发明的8-甲氧基补骨脂素的提取方法简单，避免了繁琐的柱层析分离过程，易于操作，容易在工业上推广。
附图说明
图1为本申请制备的8-甲氧基补骨脂素的晶体。
图2为本申请制备的8-甲氧基补骨脂素的HPLC图谱。
图3为本申请制备的8-甲氧基补骨脂素的质谱图。
图4为本申请制备的8-甲氧基补骨脂素的核磁共振氢谱图。
图5为本申请制备的8-甲氧基补骨脂素的核磁共振碳谱图。
图6为本申请制备的方法得到的8-甲氧基补骨脂素的1H-1HCOSY分析图谱。
图7为本申请制备的8-甲氧基补骨脂素的HMBC分析图谱。
具体实施方式
下述实施例中的毛大丁草均指毛大丁草(Gerberapiloselloides)的干燥全草，产地为湖北，购买于安徽亳州中药材市场。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，8-甲氧基补骨脂素的制备过程除液氮中研磨和结晶步骤外，均在20-25℃进行。
实施例1、8-甲氧基补骨脂素的制备
一、制备8-甲氧基补骨脂素的溶剂A的确定
1、不同溶剂制备8-甲氧基补骨脂素的比较
将毛大丁草在液氮中研磨粉碎得到毛大丁草粉末，分别用下述溶剂A进行浸提：60％乙醇水溶液、乙酸乙酯、水和二氯甲烷中的任一种。具体方法如下：
向100ml二氯甲烷中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集100ml上清液(不足100ml用二氯甲烷溶剂补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为二氯甲烷提取液1。
向100ml水中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集100ml上清液(不足100ml用水补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为水提取液1。
向100ml60％乙醇水溶液中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集100ml上清液(不足100ml用60％乙醇溶剂补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为60％乙醇水溶液提取液1。
向100ml乙酸乙酯中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集100ml上清液(不足100ml用乙酸乙酯溶剂补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为乙酸乙酯提取液1。
分别取1ml二氯甲烷提取液1、1ml乙酸乙酯提取液1、1ml水提取液1和1ml60％乙醇水溶液提取液1，并分别将这四种提取液1减压浓缩分别除去二氯甲烷提取液1中的二氯甲烷、乙酸乙酯提取液1中的乙酸乙酯、水提取液1中的水、60％乙醇水溶液提取液1中的乙醇和水，分别得到8-甲氧基补骨脂素的二氯甲烷粗提物、8-甲氧基补骨脂素的乙酸乙酯粗提物、8-甲氧基补骨脂素的水粗提物和8-甲氧基补骨脂素的60％乙醇水溶液粗提物。分别用1ml色谱甲醇溶解上述四种粗提物，分别得到二氯甲烷粗提液、乙酸乙酯粗提液、水粗提液和60％乙醇水溶液粗提液。将上述二氯甲烷粗提液、乙酸乙酯粗提液、水粗提液和60％乙醇水溶液粗提液分别上样至预处理后的C18固相萃取柱(CNWBOND,HC-C18,1g,6ml)，并用10ml80％(体积百分比)的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱出的液体，该洗脱出的液体含有8-甲氧基补骨脂素，该洗脱出的液体即为8-甲氧基补骨脂素的富集液。将从二氯甲烷粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为二氯甲烷富集液；将从乙酸乙酯粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为乙酸乙酯富集液；将从水粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为水富集液；将从60％乙醇水溶液粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为60％乙醇水溶液富集液。
HPLC法测定不同提取条件下的8-甲氧基补骨脂素的含量：以8-甲氧基补骨脂素晶体(CAS号298-81-7，大连美仑生物技术有限公司)为标准品检测上述各种8-甲氧基补骨脂素的富集液中的8-甲氧基补骨脂素的含量，根据标准品采用标准曲线法(外标法)进行定量分析8-甲氧基补骨脂素。标准曲线的制作方法如下：精密称取标准品——8-甲氧基补骨脂素晶体(大连美仑生物技术有限公司，CAS号298-81-7)10.0mg，用色谱甲醇溶解后定容于20ml容量瓶中，得到浓度为500μg/ml的标准曲线母液；各取母液适量精密配制成浓度分别为2μg/ml，4μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml，250μg/ml，500μg/ml的标准曲线溶液；分别将这九种标准曲线溶液经0.20μm有机微孔滤膜过滤，并分别吸取10μl进样进行HPLC检测。HPLC的色谱柱为WatersXbridge(150mm×4.6mm×5mm)，流动相为甲醇水溶液(该甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1：1)，流速为1ml/min；检测波长为297nm；柱温为30℃。测得8-甲氧基补骨脂素浓度与峰面积的回归方程为A＝2.04255×105+2.3529×104X，R2＝0.99936。
将上述二氯甲烷富集液、乙酸乙酯富集液、水富集液和60％乙醇水溶液富集液分别用0.20μm的有机微孔膜过滤除气，各取10μl上样后HPLC测试，按照上述标准曲线定量分析二氯甲烷富集液、乙酸乙酯富集液、水富集液和60％乙醇水溶液富集液的8-甲氧基补骨脂素含量，结果表明二氯甲烷富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为15±2μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到1000ml二氯甲烷富集液)；乙酸乙酯富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为49±5μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到1000ml乙酸乙酯富集液)；60％乙醇水溶液富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为153±40μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到1000ml60％乙醇水溶液富集液)；水富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为4±2μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到1000ml水富集液)。上述结果为三次重复的平均值。说明60％乙醇水溶液在这四种溶剂中对8-甲氧基补骨脂素提取效果最好。
2、不同浓度的乙醇水溶液制备8-甲氧基补骨脂素的比较
将毛大丁草在液氮中研磨粉碎后，向40ml40％乙醇水溶液中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集上清液，该上清液即为提取液，将该提取液命名为40％乙醇水溶液提取液1。
向40ml50％乙醇水溶液中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集40ml上清液(不足40ml用50％乙醇水溶液补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为50％乙醇水溶液提取液1。
向40ml60％乙醇水溶液中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集40ml上清液(不足40ml用60％乙醇水溶液补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为60％乙醇水溶液提取液1。
向40ml70％乙醇水溶液中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集40ml上清液(不足40ml用70％乙醇水溶液补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为70％乙醇水溶液提取液1。
向40ml80％乙醇水溶液中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集40ml上清液(不足40ml用80％乙醇水溶液补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为80％乙醇水溶液提取液1。
分别取1ml40％乙醇水溶液提取液1、1ml50％乙醇水溶液提取液1、1ml60％乙醇水溶液提取液1、1ml70％乙醇水溶液提取液1和1ml80％乙醇水溶液提取液1，并分别将这五种提取液1减压浓缩除去乙醇和水，分别得到8-甲氧基补骨脂素的40％乙醇水溶液粗提物、8-甲氧基补骨脂素的50％乙醇水溶液粗提物、8-甲氧基补骨脂素的60％乙醇水溶液粗提物、8-甲氧基补骨脂素的70％乙醇水溶液粗提物和8-甲氧基补骨脂素的80％乙醇水溶液粗提物。分别用1ml色谱甲醇溶解上述五种粗提物，分别得到40％乙醇水溶液粗提液、50％乙醇水溶液粗提液、60％乙醇水溶液粗提液、70％乙醇水溶液粗提液和80％乙醇水溶液粗提液。将上述40％乙醇水溶液粗提液、50％乙醇水溶液粗提液、60％乙醇水溶液粗提液、70％乙醇水溶液粗提液和80％乙醇水溶液粗提液分别上样至预处理后的C18固相萃取柱(CNWBOND,HC-C18,1g,6ml)，并用10ml80％(体积百分比)的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱出的液体，该洗脱出的液体含有8-甲氧基补骨脂素，该洗脱出的液体即为8-甲氧基补骨脂素的富集液。将从40％乙醇水溶液粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为40％乙醇水溶液富集液；将从50％乙醇水溶液粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为50％乙醇水溶液富集液；将从60％乙醇水溶液粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为60％乙醇水溶液富集液；将从70％乙醇水溶液粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为70％乙醇水溶液富集液；将从80％乙醇水溶液粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为80％乙醇水溶液富集液。
将40％乙醇水溶液富集液、50％乙醇水溶液富集液、60％乙醇水溶液富集液、70％乙醇水溶液富集液和80％乙醇水溶液富集液分别用0.20μm的有机微孔膜过滤除气，并各取10μl上样后HPLC测试，按照上述标准曲线定量分析40％乙醇水溶液富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为12.1±5.3μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到400ml的40％乙醇水溶液富集液)、50％乙醇水溶液富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为14.5±6.2μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到400ml的50％乙醇水溶液富集液)、60％乙醇水溶液富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为18.1±7.3μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到400ml的60％乙醇水溶液富集液)、70％乙醇水溶液富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为16.5±6.4μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到400ml的70％乙醇水溶液富集液)和80％乙醇水溶液富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为14.7±5.3μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到400ml的80％乙醇水溶液富集液)。上述结果为三次重复的平均值。说明60％乙醇水溶液在这五种浓度的乙醇水溶液中对8-甲氧基补骨脂素提取效果最好。
二、不同料液比制备8-甲氧基补骨脂素的比较
将毛大丁草在液氮中研磨粉碎后，向50ml60％乙醇水溶液中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集50ml上清液(不足50ml用60％乙醇水溶液补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为料液比1:5提取液1。
将毛大丁草在液氮中研磨粉碎后，向100ml60％乙醇水溶液中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集100ml上清液(不足100ml用60％乙醇水溶液补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为料液比1:10提取液1。
将毛大丁草在液氮中研磨粉碎后，向150ml60％乙醇水溶液中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集150ml上清液(不足150ml用60％乙醇水溶液补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为料液比1:15提取液1。
将毛大丁草在液氮中研磨粉碎后，向200ml的60％乙醇水溶液中加入10g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集200ml上清液(不足200ml用60％乙醇水溶液补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为料液比1:20提取液1。
分别取1ml料液比1:5提取液1、1ml料液比1:10提取液1、1ml料液比1:15提取液1和1ml料液比1:20提取液1，并分别将这四种提取液1减压浓缩除去乙醇和水，分别得到8-甲氧基补骨脂素的料液比1:5粗提物、8-甲氧基补骨脂素的料液比1:10粗提物、8-甲氧基补骨脂素的料液比1:15粗提物和8-甲氧基补骨脂素的料液比1:20粗提物。分别用1ml色谱甲醇溶解上述四种粗提物，分别得到料液比1:5粗提液、料液比1:10粗提液、料液比1:15粗提液和料液比1:20粗提液。将上述料液比1:5粗提液、料液比1:10粗提液、料液比1:15粗提液和料液比1:20粗提液分别上样至预处理后的C18固相萃取柱(CNWBOND,HC-C18,1g,6ml)，并用10ml80％(体积百分比)的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱出的液体，该洗脱出的液体含有8-甲氧基补骨脂素，该洗脱出的液体即为8-甲氧基补骨脂素的富集液。将从料液比1:5粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为料液比1:5富集液；将从料液比1:10粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为料液比1:10富集液；将从料液比1:15粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为料液比1:15富集液；将从料液比1:20粗提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为料液比1:20富集液。
将上述料液比1:5富集液、料液比1:10富集液、料液比1:15富集液、料液比1:20富集液分别用0.20μm的有机微孔膜过滤除气，并各取10μl上样。按照上述标准曲线定量分析料液比1:5富集液、料液比1:10富集液、料液比1:15富集液和料液比1:20富集液中8-甲氧基补骨脂素的含量，确定当料液比为1:5、料液比为1:10、料液比为1:15和料液比为1:20时8-甲氧基补骨脂素的提取量。当毛大丁草与60％乙醇水溶液的比值为1:5时，按照上述工艺提取毛大丁草中的8-甲氧基补骨脂素的浓度为15±6μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到500ml的60％乙醇水溶液富集液)；当毛大丁草与60％乙醇水溶液的比值为1:10时，按照上述工艺提取毛大丁草中的8-甲氧基补骨脂素浓度为123±48μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到1000ml的60％乙醇水溶液富集液)；当毛大丁草与60％乙醇水溶液的比值为1:15时，按照上述工艺提取毛大丁草中的8-甲氧基补骨脂素浓度为91±36μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到1500ml的60％乙醇水溶液富集液)；当毛大丁草与60％乙醇水溶液的比值为1:20时，按照上述工艺提取毛大丁草中的8-甲氧基补骨脂素浓度为64±26μg/ml(10g毛大丁草粉末按照该工艺共可得到2000ml的60％乙醇水溶液富集液)。上述结果为三次重复的平均值，其中料液比1:10、1:15和1:20条件下提取的8-甲氧基补骨脂素较为相近，考虑到溶剂的使用量，以下步骤三、步骤四和步骤五的实验选择料液比为1:10的条件。
三、不同萃取剂制备8-甲氧基补骨脂素的比较
本实验测定了萃取剂为甲苯、乙酸乙酯、乙酸乙酯-石油醚(乙酸乙酯-石油醚中乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：1)或二氯甲烷对8-甲氧基补骨脂素产率的影响，具体的实验方法和实验结果如下：
将毛大丁草在液氮中研磨粉碎后，向1000ml60％乙醇水溶液中加入100g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集1000ml上清液(不足1000ml用60％乙醇水溶液补齐)，该上清液即为提取液，将该提取液命名为提取液1。将该提取液1减压浓缩除去该提取液1中的乙醇和水，得到8-甲氧基补骨脂素的粗提物。将该粗提物加水溶解，得到8-甲氧基补骨脂素的粗提液，将该粗提液在分液漏斗中用等体积的石油醚萃取3次，每次萃取后收集水相,得到含有8-甲氧基补骨脂素的提取液2(含有8-甲氧基补骨脂素的提取液2的总体积为1000ml)。将8-甲氧基补骨脂素的提取液2平均分成四份，其中四分之一用2倍体积的甲苯进行萃取，收集甲苯相，得到含有8-甲氧基补骨脂素的甲苯萃取液。将8-甲氧基补骨脂素的提取液2中的四分之一用2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯相，得到含有8-甲氧基补骨脂素的乙酸乙酯萃取液。将8-甲氧基补骨脂素的提取液2中的四分之一用2倍体积的乙酸乙酯-石油醚(乙酸乙酯-石油醚中乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：1)进行萃取，收集乙酸乙酯-石油醚相，得到含有8-甲氧基补骨脂素的乙酸乙酯-石油醚萃取液。将8-甲氧基补骨脂素的提取液2中的四分之一用2倍体积的二氯甲烷进行萃取，收集二氯甲烷相，得到含有8-甲氧基补骨脂素的二氯甲烷萃取液。
分别取这四种萃取液各1ml，减压浓缩除去甲苯萃取液中的甲苯得到甲苯萃取物，减压浓缩除去乙酸乙酯萃取液中的乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物，减压浓缩除去乙酸乙酯-石油醚萃取液中的乙酸乙酯和石油醚得到乙酸乙酯-石油醚萃取物，减压浓缩除去二氯甲烷萃取液中的二氯甲烷得到二氯甲烷萃取物。将这四种萃取物分别用1ml色谱甲醇溶解，得到甲苯精提液、乙酸乙酯精提液、乙酸乙酯-石油醚精提液和二氯甲烷精提液。分别将甲苯精提液、乙酸乙酯精提液、乙酸乙酯-石油醚精提液和二氯甲烷精提液上样至预处理后的C18固相萃取柱(CNWBOND,HC-C18,1g,6ml)，并用10ml80％(体积百分比)的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱出的液体，该洗脱出的液体含有8-甲氧基补骨脂素，该洗脱出的液体即为8-甲氧基补骨脂素的富集液。将从甲苯精提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为甲苯富集液；将从乙酸乙酯精提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为乙酸乙酯富集液；将从乙酸乙酯-石油醚精提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为乙酸乙酯-石油醚富集液；将从二氯甲烷精提液中得到的8-甲氧基补骨脂素的富集液命名为二氯甲烷富集液。
将甲苯富集液、乙酸乙酯富集液、乙酸乙酯-石油醚富集液和二氯甲烷富集液分别用0.20μm的有机微孔膜过滤除气，并各取10μl上样。按照上述标准曲线定量分析这四种8-甲氧基补骨脂素的富集液中的8-甲氧基补骨脂素的浓度。结果表明二氯甲烷富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为58.0±11μg/ml，当萃取剂为乙酸乙酯时，乙酸乙酯富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为46.3±5μg/ml，当萃取剂为乙酸乙酯-石油醚时，乙酸乙酯-石油醚富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为53.8±10μg/ml，当萃取剂为甲苯时，甲苯富集液中8-甲氧基补骨脂素的浓度为60.8±10μg/ml。上述结果为三次重复的平均值。结果表明甲苯对8-甲氧基补骨脂素的萃取效果最好。
四、不同溶剂重结晶8-甲氧基补骨脂素的比较
分别向处于回流条件下的12ml乙醇(温度为79℃)和10ml异丙醇(温度为83℃)中加入步骤三中的甲苯萃取物各10g(1g甲苯萃取物中含有810.6mg8-甲氧基补骨脂素)使12ml乙醇和10ml异丙醇中8-甲氧基补骨脂素过饱和，趁热过滤，去除不溶物。分别将乙醇的滤液和异丙醇的滤液于室温(20℃)冷却，析出8-甲氧基补骨脂素晶体，分别称取结晶析出的8-甲氧基补骨脂素晶体，乙醇溶液析出晶体重3.72g；异丙醇溶液中析出的晶体为3.23g。结果说明乙醇对8-甲氧基补骨脂素的重结晶效果较好。
五、8-甲氧基补骨脂素的制备
实验重复三次，每次重复实验的步骤如下：
1、8-甲氧基补骨脂素的制备
将毛大丁草在液氮中研磨粉碎后，向2000ml60％乙醇水溶液中加入200g毛大丁草粉末，混匀放置4小时，收集上清液，该上清液即为提取液，将该提取液命名为提取液1。将该提取液1减压浓缩除去该提取液1中的乙醇和水，得到8-甲氧基补骨脂素的粗提物。将该粗提物加水溶解，得到8-甲氧基补骨脂素的粗提液，将该粗提液在分液漏斗中用等体积的石油醚萃取3次，每次萃取收集水相，得到含有8-甲氧基补骨脂素的提取液2。向该提取液2中加入是提取液2两倍体积的甲苯，并进行萃取，萃取三次，合并甲苯相，得到含有8-甲氧基补骨脂素的甲苯萃取液，减压浓缩除去甲苯萃取液中的甲苯，得到甲苯萃取物。向甲苯萃取物中加入乙醇(乙醇温度为79℃)，然后在室温(20℃)使8-甲氧基补骨脂素重结晶析出。三次重复实验的结果表明200g毛大丁草粉末得到1.3g±0.4g8-甲氧基补骨脂素晶体。采用HPLC方法检测8-甲氧基补骨脂素晶体的纯度，方法如下：流动相为甲醇水溶液(该甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1：1)，流速为1ml/min；检测波长为297nm；柱温为30℃。结果表明该8-甲氧基补骨脂素晶体的纯度为98％。结果见图1和图2，其中图1为8-甲氧基补骨脂素的晶体外观，图2为8-甲氧基补骨脂素的HPLC图谱。
2、制备的8-甲氧基补骨脂素的结构确定
对上述步骤1得到的8-甲氧基补骨脂素进行质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、1H-1HCOSY分析和HMBC分析，质谱如图3所示，核磁共振氢谱如图4所示，核磁共振碳谱如图5所示，1H-1HCOSY分析结果如图6所示，HMBC分析结果如图7所示，结果表明步骤五得到的8-甲氧基补骨脂素的结构式为式1：

Claims (3)

1.制备8-甲氧基补骨脂素的方法，包括用溶剂A浸提毛大丁草，收集浸提液，除去所述浸提液含有的所述溶剂A，得到含有8-甲氧基补骨脂素的粗提物，除去所述粗提物含有的杂质，得到8-甲氧基补骨脂素；
所述除去所述粗提物含有的杂质包括以下步骤：将所述粗提物加水溶解，得到含有8-甲氧基补骨脂素的粗提液，向所述粗提液中加入石油醚进行萃取，收集水相，该水相为含有8-甲氧基补骨脂素的提取液2，除去所述提取液2的杂质，得到8-甲氧基补骨脂素；
所述除去所述提取液2的杂质包括以下步骤：向所述提取液2中加入溶剂B进行萃取，收集溶剂B相，所述溶剂B相为含有8-甲氧基补骨脂素的萃取液；除去所述萃取液含有的所述溶剂B，得到8-甲氧基补骨脂素的萃取物，除去所述萃取物中的杂质，得到8-甲氧基补骨脂素；
所述除去所述萃取物中的杂质包括将所述8-甲氧基补骨脂素的萃取物用溶剂C溶解，重结晶析出8-甲氧基补骨脂素；
所述溶剂A为乙醇水溶液；所述乙醇水溶液中乙醇的浓度为60％；所述溶剂B为甲苯；所述溶剂C为乙醇、异丙醇或乙酸乙酯-石油醚。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述毛大丁草与所述溶剂A的配比为1g所述毛大丁草：5-30ml所述溶剂A。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，用溶剂A浸提毛大丁草是将所述毛大丁草在所述溶剂A中浸泡4-8小时。
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