CN105832720B - 一种补骨脂素类化合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种补骨脂素类化合物的用途。所述补骨脂素类化合物为1‑20，以不给药组和8‑甲氧基补骨脂素（8‑MOP）分别为阴性和阳性对照，考察了20个补骨脂素类化合物在小鼠B16细胞中对黑素生成量的影响，结果显示：与阴性对照相比，除化合物14以外的所有化合物均可促进B16细胞中黑素的生成，促进作用从112%到263%不等，其中化合物8，15，17，18和20对黑素生成的促进作用可以达到200%以上；与阳性对照相比，除11和14以外的所有化合物，对黑素生成的促进作用均优于阳性对照，其中化合物17和18对黑素生成的促进作用是阳性对照的2倍以上；除化合物14以外的19个补骨脂素类化合物均可用于临床上制备治疗白癜风的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种补骨脂素类化合物的用途，该类化合物经细胞活性筛选，其中19个化合物可用于临床上制备治疗白癜风的药物中的用途。
背景技术
白癜风是一种常见的自发或特发性的色素脱失性皮肤病，被称为世界皮肤病三大顽症之一，困扰全世界5000万以上的患者。在世界不同地域、不同种族间发病率从0.1％—8％不等，我国一般人群患病率为0.56％左右，大约一半患者于20周岁以前发病，男性和女性的患病率相等[7]。白癜风主要表现为皮肤、粘膜的白斑及灰/白色毛发等。西医认为白癜风是由于皮肤和毛囊的黑素细胞内酪氨酸酶系统的功能减退、丧失而引起的。
补骨脂为豆科一年生草本植物补骨脂(Psoralea corylifolia L.)的干燥成熟果实，收载于《中国药典》、《维吾尔药志》、《中华本草-维吾尔分卷》等，是历代传统维吾尔医治疗白癜风的主要经典药物。维吾尔医学认为白癜风主要由异常粘液质引起，治疗时主张清除异常体液，纠正异常气质，从而恢复机体自然力。补骨脂具有生干生热、清除异常黏液质、净血解毒、增加色素、杀驱肠虫等功效。此外，补骨脂还具有抗菌、雌激素样作用、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节和抗抑郁等多种生物活性。
目前以植物补骨脂为主要成分的药物和制剂，临床上主要用于治疗白癜风：如复方补骨脂颗粒、补骨脂注射液、复方补骨脂酊、驱白巴布斯片、复方卡力孜然酊(维药名维阿露)等。尽管维药治疗白癜风效果显著，优势明显，但是其物质基础研究薄弱，作用机制和体内外代谢过程亦不明晰，严重的制约了其二次开发。
经过多年研究，国内外研究人员已经从补骨脂(Psoralea corylifolia L.)中分离出补骨脂素类化合物(呋喃香豆素类化合物)、黄酮类、萜类、以及少量脂类和挥发油。其中补骨脂素类化合物(呋喃香豆素类化合物)作为其中的主要化学成分，研究范围最广。
补骨脂素类化合物(Psoralen)是目前临床上治疗白癜风最常用的光敏性药物，但是必须配合日光或长波紫外线(UVA)照射治疗，所以此种治疗方法称为PUVA(Psoralen+UVA)。常用的有8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)和5-甲氧补骨脂素(5-MOP)，后来又人工合成了三甲基补骨脂素(TMP)，如结构所示。在白癜风的治疗中，PUVA能够激活酪氨酸酶活性，催化黑素合成，促进黑素细胞的分裂及移动，最终使黑色素合成增加，白斑颜色逐渐恢复。
经检索，有关文献为：
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本发明在国内外有关专利、文献的综合分析和本课题组前期研究工作的基础上，对该植物中的活性化合物—补骨脂素进行简单的改造和修饰，将甲基、环己基和苯基等引入到补骨脂素分子中，提高其成药性，并研究了这些化合物对小鼠B16细胞中黑素生成的影响，以期发现疗效显著、靶点明确、作用机理清晰的抗白癜风新药。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种补骨脂素类化合物的用途。该类化合物以间苯二酚为起始原料，在硫酸的作用下与乙酰乙酸乙酯或苹果酸缩合得到不同的7-羟基香豆素，然后在K2CO3的作用下，与不同的取代苯乙酮反应得到取代香豆素，再在酸或碱的作用下关环形成呋喃环而得到。其中化合物14或15在钯碳催化下，与二氯二氰基苯醌(DDQ)脱氢得到化合物17或18。之后，还考察了这20个补骨脂素类化合物在小鼠B16细胞中对黑素生成量的影响，结果显示：与阴性对照(不给药组)相比，除化合物14以外的所有化合物均可促进B16细胞中黑素的生成，促进作用从112％到263％不等，其中化合物8，15，17，18和20对黑素生成的促进作用可以达到200％以上；与阳性对照(8-简甲氧基补骨脂素，即8-MOP)相比，除11和14以外的所有化合物，对黑素生成的促进作用均优于阳性对照，其中化合物17和18对黑素生成的促进作用是阳性对照的2倍以上；该方法反应条件温和，实验步骤简捷。通过本发明所述方法获得的20个补骨脂素类化合物，除化合物14以外均具备在临床上制备治疗白癜风的药物的用途。
本发明所述的一种补骨脂素类化合物的用途，其中所述补骨脂素类化合物为：
化合物1为9-甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮；
化合物2为8,9-二甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮；
化合物3为4,9-二甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮；
化合物4为4,8,9-三甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮；
化合物5为4-甲基-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮；
化合物6为2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮；
化合物7为6-甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；
化合物8为4,6,7-三甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；
化合物9为4,6-二甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；
化合物10为6,7-二甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；
化合物11为4-甲基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；
化合物12为2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；
化合物13为8,9,10,11-四氢-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮；
化合物14为4-甲基-8,9,10,11-四氢-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮；
化合物15为4-甲基-6,7,8,9-四氢-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；
化合物16为6,7,8,9-四氢-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；
化合物17为4-甲基-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮；
化合物18为4-甲基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；
化合物19为6-苯基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；
化合物20为4-甲基-6-苯基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；
所述的补骨脂素类化合物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19和20在制备治疗白癜风药物中的用途。
本发明所述的一种补骨脂素类化合物的用途，所述补骨脂素类化合物的结构式为：
本发明所述的一种补骨脂素类化合物，其结构如通式(I)所示：
所述的补骨脂素类化合物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19和20在制备治疗白癜风药物中的用途。
本发明所述的补骨脂素类化合物的用途，其中补骨脂素类化合物的制备方法，按下列步骤进行：
中间体a的制备：
a、在室温条件下，先将间苯二酚溶解在5mL干燥的硫酸中，搅拌至全部溶解，再加入苹果酸或乙酰乙酸乙酯，升温至110℃，充分搅拌使其反应完全，反应液倾倒入冰水中，静置后采用乙酸乙酯萃取，有机相合并干燥，浓缩后得7-羟基香豆素或4-甲基伞形酮；
中间体b和b'的制备：
b、将适量碳酸钾和7-羟基香豆素或4-甲基伞形酮溶解在20mL的丙酮中，并加入不同的取代苯乙酮，如：2-氯乙醇、2-氯丙酮、2-氯丁酮、2-溴环己酮或2-溴苯乙酮，回流反应至原料全部消失，反应液过滤，浓缩，将残渣采用柱层析梯度洗脱，洗脱剂为体积比10:1－1∶1的石油醚∶乙酸乙酯，即得7位羟基取代的香豆素或4-甲基伞形酮；
c、将7位取代的香豆素或4-甲基伞形酮溶解在4％的KOH乙醇溶液中，回流反应至原料全部消失后，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用柱层析梯度洗脱，洗脱剂为体积比15:1－10∶1的石油醚∶乙酸乙酯，即得补骨脂素类化合物1和7、2和10、3和9、4和8、13和16、14和15、19或20；
中间体c的制备：
d、将草酰氯至于-78℃的低温反应器中，缓慢滴加二甲基亚砜(DMSO)，搅拌半小时，再将步骤b所得到的7-羟乙基氧基香豆素或4-甲基-7-羟乙基氧基香豆素溶解于干燥的二氯甲烷中，缓慢滴加至反应体系中，滴加完毕后搅拌半小时，再滴加三乙胺是反应体系中所形成复合物解离，滴加完毕后缓慢伸至室温，反应液水洗三遍，有机相干燥过夜，浓缩得7-甲酰甲氧基香豆素或4-甲基7-甲酰甲氧基香豆素；
e、制备1mol/L的NaOH水溶液，加热使其回流，将步骤d中所得到的7-甲酰甲氧基香豆素或4-甲基7-甲酰甲氧基香豆素溶解在1-,4二氧六环中，缓慢滴加至回流的NaOH水溶液中，充分搅拌并保持回流反应至原料全部消失，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用柱层析梯度洗脱，洗脱剂为体积比10:1－7∶1的石油醚∶乙酸乙酯，即得补骨脂素类化合物5和11、6和12；
f、将步骤c所得到的化合物14或15溶解在甲苯中，再加入催化量的钯碳和二氯二氰基苯醌(DDQ)进行脱氢反应，加热回流至原料完全消失，冷却至室温，过滤，浓缩，将残渣采用柱层析梯度洗脱，洗脱剂为体积比10:1的石油醚∶乙酸乙酯，即得补骨脂素类化合物17或18。
本发明所述的补骨脂素类化合物的用途，其中补骨脂素类化合物，是以间苯二酚为起始原料，在硫酸的作用下与乙酰乙酸乙酯或苹果酸缩合得到不同的7-羟基香豆素，然后在K2CO3的作用下，与不同的取代苯乙酮反应得到取代香豆素，再在酸或碱的作用下关环形成呋喃环而得到。其中化合物14或15在钯碳催化下，与二氯二氰基苯醌(DDQ)脱氢得到化合物17或18。化学反应式为：
其中：(i)对于1,2,6,7,10,12,13,16,19:苹果酸，H2SO4,温度120℃；对于3,4,5,8,9,11,14,15,17,18,20:乙酰乙酸乙酯，H2SO4，温度120℃；
(ii)对于1,3,7,9:氯丙酮，K2CO3,丙酮，回流；对于2,4,8,10:3-氯-2-丁酮,K2CO3，丙酮，回流；对于5,6,11,12:氯乙醇，K2CO3，丙酮，回流；对于13-18:2-溴环己酮，K2CO3，丙酮，回流；对于19,20:α-溴代苯乙酮，K2CO3，丙酮，回流；
(iii)对于1-4，7-10，13-16,19-20:4％KOH乙醇溶液，回流；
(iv)对于5,6,11,12:温度-78℃，草酰氯，DMSO，三乙胺，DCM；
(v)1M NaOH溶液，1,4-二氧六环；
(vi)Pd-C，DDQ,甲苯，回流。
附图说明
图1为本发明黑素含量用碱消化法测得化合物1-20对黑素的细胞活性结果图。
具体实施方式
依据实施例对本发明进一步说明，但本发明不仅限于这些实施例；
试剂：所有试剂均为市售的分析纯；
实施例1
9-甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物1)和6-甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物7)的制备：
在室温条件下，将0.11g(1mmol)间苯二酚溶解在20mL干燥的硫酸中，搅拌至全部溶解，再加入0.161g(1.2mmol)苹果酸，升温至120℃，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液倾倒入冰水中，静置后采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空脱溶剂，后得7-羟基香豆素0.140g；
将0.81g(5mmol)7-羟基香豆素和5g碳酸钾(36mmol)溶解在50mL丙酮中，并加入0.48mL(6mmo)2-氯丙酮，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液过滤，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比1∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得7-乙酰甲氧基香豆素0.87g；
将1.09g(5mmol)7-乙酰氧基香豆素溶解在25mL的4％KOH乙醇溶液中，回流反应，TLC检测反应完全后，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比10∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得补骨脂素类化合物1 0.13g和化合物7 0.69g。
9-甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物1)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝9.5Hz,1H),7.43(s,1H),7.37(d,J＝8.6Hz,1H),7.33(d,J＝8.5Hz,1H),6.37(d,J＝9.6Hz,1H),2.53(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.02(s),158.02(s),149.90(s),144.76(s),142.39(s),123.83(s),117.58(s),116.08(s),113.87(s),113.48(s),108.98(s),9.77(s).
6-甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物7)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝9.6Hz,1H),7.55(s,1H),7.44(s,1H),7.36(s,1H),6.34(d,J＝9.6Hz,1H),2.25(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.22(s),156.80(s),152.11(s),144.26(s),143.26(s),126.77(s),118.24(s),115.62(s),114.98(s),114.41(s),99.78(s),7.93(s).
实施例2
8,9-二甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物2)和6,7-二甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物10)的制备：
在室温条件下，将0.11g(1mmol)间苯二酚溶解在20mL干燥的硫酸中，搅拌至全部溶解，再加入0.161g(1.2mmol)苹果酸，升温至120℃，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液倾倒入冰水中，静置后采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空脱溶剂，后得7-羟基香豆素0.140g；
将0.81g(5mmol)7-羟基香豆素和5g碳酸钾(36mmol)溶解在50mL丙酮中，并加入0.60mL(6mmo)2-氯丁酮，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液过滤，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比1∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得7-(1-乙酰基乙基)氧基香豆素0.93g；
将1.16g(5mmol)7-(1-乙酰基乙基)氧基香豆素溶解在25mL的4％KOH乙醇溶液中，回流反应，TLC检测反应完全后，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比10∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得补骨脂素类化合物2 0.14g和化合物10 0.72g。
8,9-二甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物2)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝9.6Hz,1H),7.28(d,J＝8.4Hz,1H),7.24(d,J＝8.4Hz,1H),6.34(d,J＝9.5Hz,1H),2.46(s,3H),2.40(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.03(s),156.32(s),151.76(s),148.91(s),130.87(s),128.80(s),122.47(s),118.60(s),113.38(s),109.93(s),108.06(s),11.65(s),9.60(s).
6,7-二甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物10)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝9.6Hz,1H),7.41(s,1H),7.29(s,1H),6.32(d,J＝9.5Hz,1H),2.39(s,3H),2.16(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.33(s),155.51(s),152.80(s),151.59(s),144.28(s),128.22(s),116.86(s),114.59(s),113.97(s),109.48(s),98.99(s),11.93(s),7.86(s).
实施例3
8,9,10,11-四氢-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物13)和6,7,8,9-四氢-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物16)的制备：
在室温条件下，将0.11g(1mmol)间苯二酚溶解在20mL干燥的硫酸中，搅拌至全部溶解，再加入0.161g(1.2mmol)苹果酸，升温至120℃，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液倾倒入冰水中，静置后采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空脱溶剂，后得7-羟基香豆素0.140g；
将0.81g(5mmol)7-羟基香豆素和5g碳酸钾(36mmol)溶解在50mL丙酮中，并加入0.70mL(6mmo)2-溴环己酮，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液过滤，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比1∶3的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得7-(2-甲氧代环己基)氧基香豆素1.07g；
将1.29g(5mmol)7-(2-甲氧代环己基)氧基香豆素溶解在25mL的4％KOH乙醇溶液中，回流反应，TLC检测反应完全后，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比12∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得补骨脂素类化合物13 0.16g和化合物16 0.81g。
8,9,10,11-四氢-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物13)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(d,J＝9.6Hz,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,1H),7.23(d,J＝8.4Hz,1H),6.33(d,J＝9.5Hz,1H),3.03-2.95(m,2H),2.73-2.79(m,2H),2.00-1.92(m,2H),1.92-1.83(m,2H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ159.99(s),155.72(s),154.12(s),147.64(s),143.55(s),121.25(s),116.49(s),112.56(s),112.36(s),111.61(s),107.29(s),22.41(s),21.70(s),21.56(s),20.82(s).
6,7,8,9-四氢-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物16)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(d,J＝9.6Hz,1H),7.41(s,1H),7.32(s,1H),6.32(d,J＝9.5Hz,1H),2.69-2.77(m,2H),2.57-2.65(m,2H),1.99-1.90(m,2H),1.90-1.81(m,2H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.30(s),156.35(s),156.03(s),151.44(s),144.26(s),126.58(s),116.57(s),114.60(s),113.98(s),112.55(s),99.34(s),23.37(s),22.63(s),22.37(s),20.27(s).
实施例4
2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物6)和2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物12)的制备：
在室温条件下，将0.11g(1mmol)间苯二酚溶解在20mL干燥的硫酸中，搅拌至全部溶解，再加入0.161g(1.2mmol)苹果酸，升温至120℃，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液倾倒入冰水中，静置后采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空脱溶剂，后得7-羟基香豆素0.140g；
将0.81g(5mmol)7-羟基香豆素和5g碳酸钾(36mmol)溶解在50mL丙酮中，并加入0.675mL(10mmo)2-氯乙醇，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液过滤，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比1∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得7-羟乙基氧基香豆素0.95g；
将0.85mL(10mmol)草酰氯至于-78℃的低温反应器中，氮气保护下，缓慢滴加0.039mL(10mmol)二甲基亚砜(DMSO)，滴加完毕后搅拌半小时，将7-羟乙基氧基香豆素1.10g(5mmol)溶解在100mL干燥的二氯甲烷中，缓慢滴加至反应体系中，滴加完毕后继续搅拌半小时，最后滴加3.5mL(25mmol)干燥三乙胺使得生成的复合物解离，滴加完毕后缓慢伸至室温，反应液水洗三遍，有机相干燥过夜，浓缩得0.87g 7-甲酰甲氧基香豆素；
加热使其回流，将1.02g(5mmol)7-甲酰甲氧基香豆素溶解在50mL 1-,4二氧六环中，缓慢滴加至回流的1mol/L的NaOH水溶液中，充分搅拌至原料全部消失，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比7∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得补骨脂素类化合物6 0.10和120.46g。
2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物6)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝9.6Hz,1H),7.70(d,J＝2.2Hz,1H),7.44(dd,J＝8.5,0.8Hz,1H),7.38(d,J＝8.5Hz,1H),7.14(dd,J＝2.2,0.8Hz,1H),6.40(d,J＝9.6Hz,1H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.96(s),156.02(s),145.39(s),144.63(s),124.55(s),123.96(s),114.28(s),108.95(s),104.26(s),103.98(s).
2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物12)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝9.6Hz,1H),7.71-7.67(m,2H),7.48(s,1H),6.83(d,J＝2.2,1H),6.38(d,J＝9.6Hz,1H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.15(s),156.55(s),152.17(s),147.04(s),144.20(s),125.02(s),119.97(s),115.55(s),114.80(s),106.51(s),100.01(s).
实施例5
6-苯基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物19)的制备：
在室温条件下，将0.11g(1mmol)间苯二酚溶解在20mL干燥的硫酸中，搅拌至全部溶解，再加入0.161g(1.2mmol)苹果酸，升温至120℃，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液倾倒入冰水中，静置后采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空脱溶剂，后得7-羟基香豆素0.140g；
将0.81g(5mmol)7-羟基香豆素和5g碳酸钾(36mmol)溶解在50mL丙酮中，并加入1.20g(6mmol)α-溴代苯乙酮，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液过滤，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比5∶1石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得7-苯甲酰基甲氧基香豆素1.25g；
将1.40g(5mmol)7-苯甲酰基甲氧基香豆素溶解在25mL的4％KOH乙醇溶液中，回流反应，TLC检测反应完全后，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比10∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得补骨脂素类化合物19 1.11g。
6-苯基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物19)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.89(s,1H),7.84(s,1H),7.82(d,J＝9.6Hz,1H),7.60-7.66(m,2H),7.48-7.55(m,J＝8.3,6.7Hz,3H),7.42(td,J＝7.4,1.1Hz,1H),6.40(d,J＝9.6Hz,1H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.04(s),157.34(s),152.33(s),144.18(s),143.00(s),131.06(s),129.33(s),128.21(s),127.64(s),124.35(s),122.30(s),119.40(s),115.73(s),114.97(s),100.34(s).
实施例6
4,9-二甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物3)和4,6-二甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物9)的制备：
在室温条件下，将0.11g(1mmol)间苯二酚溶解在20mL干燥的硫酸中，搅拌至全部溶解，再加入0.151ml(1.2mmol)乙酰乙酸乙酯，升温至120℃，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液倾倒入冰水中，静置后采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空脱溶剂，后得4-甲基伞形酮0.152g；
将0.88g(5mmol)4-甲基伞形酮和5g碳酸钾(36mmol)溶解在50mL丙酮中，并加入0.48mL(6mmo)2-氯丙酮，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液过滤，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比1∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得4-甲基-7-乙酰甲氧基香豆素1.07g；
将1.16g(5mmol)4-甲基-7-乙酰甲氧基香豆素溶解在25mL的4％KOH乙醇溶液中，回流反应，TLC检测反应完全后，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比10∶1石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得补骨脂素类化合物3 0.14g和化合物9 0.80g。
4,9-二甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物3)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.48(d,J＝8.7Hz,1H),7.42(s,1H),7.37(d,J＝8.7Hz,1H),6.26(s,1H),2.53(s,3H),2.49(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.88(s),157.78(s),153.58(s),149.25(s),142.14(s),120.34(s),117.40(s),116.17(s),114.36(s),112.53(s),108.41(s),19.54(s),9.71(s).
4,6-二甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物9)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(s,1H),7.46(s,1H),7.40(s,1H),6.25(s,1H),2.52(s,3H),2.29(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.21(s),156.63(s),152.77(s),151.62(s),143.11(s),126.39(s),116.08(s),115.64(s),114.74(s),113.23(s),99.77(s),19.25(s),7.90(s).
实施例7
4,8,9-三甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物4)和4,6,7-三甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物8)的制备：
在室温条件下，将0.11g(1mmol)间苯二酚溶解在20mL干燥的硫酸中，搅拌至全部溶解，再加入0.151ml(1.2mmol)乙酰乙酸乙酯，升温至120℃，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液倾倒入冰水中，静置后采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空脱溶剂，后得4-甲基伞形酮0.152g；
将0.88g(5mmol)4-甲基伞形酮和5g碳酸钾(36mmol)溶解在50mL丙酮中，并加入0.60mL(6mmo)2-氯丁酮，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液过滤，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比1∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得4-甲基-7-(1-乙酰基乙基)氧基香豆素1.07g；
将1.23g(5mmol)4-甲基-7-(1-乙酰基乙基)氧基香豆素溶解在25mL的4％KOH乙醇溶液中，回流反应，TLC检测反应完全后，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比10∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得补骨脂素类化合物4 0.12g和化合物8 0.62g。
4,8,9-三甲基-2H-呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物4)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38(d,J＝8.7Hz,1H),7.28(d,J＝8.7Hz,1H),6.22(s,1H),2.47(d,J＝0.9Hz,3H),2.45(s,3H),2.40(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.06(s),156.21(s),153.67(s),151.59(s),148.39(s),119.08(s),118.55(s),114.31(s),112.30(s),110.13(s),107.64(s),19.48(s),11.65(s),9.66(s).
4,6,7-三甲基-2H-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物8)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.51(s,1H),7.30(s,1H),6.22(s,1H),2.50(s,3H),2.39(s,3H),2.18(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.38(s),155.39(s),152.91(s),152.71(s),151.13(s),127.92(s),115.72(s),113.45(s),112.88(s),109.59(s),99.00(s),19.22(s),11.94(s),7.90(s).
实施例8
4-甲基-8,9,10,11-四氢-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物14)和4-甲基-6,7,8,9-四氢-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物15)的制备：
在室温条件下，将0.11g(1mmol)间苯二酚溶解在20mL干燥的硫酸中，搅拌至全部溶解，再加入0.151ml(1.2mmol)乙酰乙酸乙酯，升温至120℃，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液倾倒入冰水中，静置后采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空脱溶剂，后得4-甲基伞形酮0.152g；
将0.88g(5mmol)4-甲基伞形酮和5g碳酸钾(36mmol)溶解在50mL丙酮中，并加入0.70mL(6mmo)2-溴环己酮，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液过滤，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比1∶3的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得4-甲基-7-(2-甲氧代环己基)氧基香豆素1.19g；
将1.36g(5mmol)4-甲基-7-(2-甲氧代环己基)氧基香豆素溶解在25mL的4％KOH乙醇溶液中，回流反应，TLC检测反应完全后，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比12∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得补骨脂素类化合物14 0.18g和化合物15 0.85g。
4-甲基-8,9,10,11-四氢-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物14)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39(d,J＝8.7Hz,1H),7.32(d,J＝8.6Hz,1H),6.23(s,1H),3.05-2.98(m,2H),2.81-2.74(m,2H),2.48(s,3H),2.00-1.92(m,2H),1.92-1.85(m,2H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.98(s),156.60(s),154.93(s),130.80(s),128.79(s),118.83(s),114.36(s),112.81(s),112.41(s),107.85(s),23.41(s),22.64(s),21.85(s),19.33(s).
4-甲基-6,7,8,9-四氢-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物15)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53(s,1H),7.34(s,1H),6.22(s,1H),2.71-2.79(m,2H),2.68-2.61(m,2H),2.49(s,3H),2.00-1.92(m,2H),1.92-1.84(m,2H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.39(s),156.30(s),155.94(s),152.92(s),151.03(s),126.34(s),115.77(s),113.21(s),112.94(s),112.70(s),99.42(s),23.42(s),22.70(s),22.45(s),20.36(s),19.23(s).
实施例9
4-甲基-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物5)和4-甲基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物11)的制备：
在室温条件下，将0.11g(1mmol)间苯二酚溶解在20mL干燥的硫酸中，搅拌至全部溶解，再加入0.151ml(1.2mmol)乙酰乙酸乙酯，升温至120℃，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液倾倒入冰水中，静置后采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空脱溶剂，后得4-甲基伞形酮0.152g；
将0.88g(5mmol)4-甲基伞形酮和5g碳酸钾(36mmol)溶解在50mL丙酮中，并加入0.675mL(10mmo)2-氯乙醇，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液过滤，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比1∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得4-甲基-7-羟乙基氧基香豆素0.88g；
将0.85mL(10mmol)草酰氯至于-78℃的低温反应器中，氮气保护下，缓慢滴加0.039mL(10mmol)二甲基亚砜(DMSO)，滴加完毕后搅拌半小时，4-甲基-7-羟乙基氧基香豆素1.20g(5mmol)溶解在100mL干燥的二氯甲烷中，缓慢滴加至反应体系中，滴加完毕后继续搅拌半小时，最后滴加3.5mL(25mmol)干燥三乙胺使得生成的复合物解离，滴加完毕后缓慢伸至室温，反应液水洗三遍，有机相干燥过夜，浓缩得0.99g 4-甲基-7-甲酰甲氧基香豆素；
加热使其回流，将1.09g(5mmol)4-甲基-7-甲酰甲氧基香豆素溶解在50mL 1-,4二氧六环中，缓慢滴加至回流的1mol/L的NaOH水溶液中，充分搅拌至原料全部消失，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比7∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得补骨脂素类化合物50.11g和110.60g。
4-甲基-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物5)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.69(d,J＝2.2Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,1H),7.45(d,J＝8.7Hz,1H),7.15(d,J＝2.1Hz,1H),6.28(s,1H),2.51(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.89(s),157.25(s),153.58(s),145.76(s),120.48(s),117.00(s),112.86(s),110.02(s),108.41(s),104.37(s),19.44(s).
4-甲基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物11)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(s,1H),7.69(d,J＝2.2Hz,1H),7.47(s,1H),6.85(d,J＝2.1Hz,1H),6.27(s,1H),2.50(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.24(s),156.43(s),152.78(s),151.75(s),146.96(s),124.77(s),116.70(s),113.62(s),106.67(s),100.00(s),19.30(s).
实施例10
4-甲基-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物17)和4-甲基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物18)的制备：
将实施例8中所得到的化合物14或15 1.27g(5mmol)溶解在25mL甲苯中，再加入催化量的钯碳和2.84g(12.5mmol)二氯二氰基苯醌(DDQ)，加热回流至原料完全消失，冷却至室温，过滤，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比6:1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得补骨脂素类化合物17或18 1.05g。
4-甲基-2H-苯并呋喃[2,3-h]苯并吡喃-2-酮(化合物17)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.40(d,J＝7.6Hz,1H),7.64(d,J＝8.7Hz,1H),7.59(d,J＝8.2Hz,1H),7.52(t,J＝7.8Hz,1H),7.40-7.49(m,2H),6.29(s,1H),2.50(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.65(s),158.42(s),156.27(s),153.34(s),149.61(s),127.89(s),123.93(s),123.73(s),123.33(s),121.98(s),115.12(s),113.07(s),111.62(s),108.40(s),19.48(s).
4-甲基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物18)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(s,1H),7.98(d,J＝7.6Hz,1H),7.59(d,J＝8.2Hz,1H),7.53-7.48(m,2H),7.39-7.43(m,1H),6.31(s,1H),2.58(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.08(s),158.05(s),153.53(s),152.78(s),129.28(s),128.01(s),123.66(s),121.79(s),120.75(s),116.23(s),113.57(s),112.07(s),100.38(s),19.39(s).
实施例11
4-甲基-6-苯基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物20)的制备：
在室温条件下，将0.11g(1mmol)间苯二酚溶解在20mL干燥的硫酸中，搅拌至全部溶解，再加入0.151ml(1.2mmol)乙酰乙酸乙酯，升温至120℃，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液倾倒入冰水中，静置后采用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，真空脱溶剂，后得4-甲基伞形酮0.152g；
将0.88g(5mmol)4-甲基伞形酮和5g碳酸钾(36mmol)溶解在50mL丙酮中，并加入1.20g(6mmol)α-溴代苯乙酮，充分搅拌，TLC检测反应完全后，冷却至室温，反应液过滤，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比5∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得4-甲基-7-苯甲酰基甲氧基香豆素1.26g；
将1.47g(5mmol)4-甲基-7-苯甲酰基甲氧基香豆素溶解在25mL的4％KOH乙醇溶液中，回流反应，TLC检测反应完全后，冷却至室温，加入1mol/L盐酸溶液调节pH至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，将残渣采用洗脱剂为体积比10∶1的石油醚:乙酸乙酯柱层析梯度洗脱，即得补骨脂素类化合物20 1.18g。
4-甲基-6-苯基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮(化合物20)的核磁数据：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.98(s,1H),7.83(s,1H),7.64(dd,J＝8.2,1.1Hz,2H),7.50-7.56(m,3H),7.44(td,J＝7.4,1.1Hz,1H),6.29(s,1H),2.52(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.99(s),157.10(s),152.64(s),151.80(s),142.88(s),131.06(s),129.25(s),128.06(s),127.58(s),123.96(s),122.32(s),116.80(s),115.77(s),113.64(s),100.23(s),19.26(s).
实施例12
本发明所述的补骨脂素类化合物的用途，将实施例1-11获得的化合物1-20对B16黑素瘤细胞的黑素含量测定：
(1)筛选模型：小鼠B16黑素瘤细胞；
(2)细胞来源：中科院细胞库提供；
(3)培养条件：10％胎牛血清、1％双抗的高糖DMEM培养基来培养细胞24h后加入不同浓度的药物和阳性对照，分别在48h和72h测定酪氨酸活性和黑素含量；
(4)测定方法：
蛋白定量用Bradford法测定：
完全溶解蛋白标准品(5mg/mlBSA)，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9％NaCl或PBS稀释标准品；将稀释后标准品(0.5mg/mlBSA)按0，1，2，4，8，12，16，20μl分别加到96孔板中，加标准品稀释液将所有标准品补足到20μl；加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液补足到20μl；各孔加入200μl Bradford染色液，用加样枪轻轻吹打混匀(注意不要弄出气泡影响读数)室温放置3-5分钟；用酶标仪测定A595；根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度；
黑素的含量用碱消化法进行测定：
正处于对数生长期的B16黑素瘤细胞接种于6cm培养皿中、浓度为2×105个/ml，各孔加5ml细胞悬浮液；接种12h后、待细胞完全贴壁后用药，用药浓度分别为5、10、20和40μg/ml；在72h后收集细胞；在不破碎细胞的情况下加入200μl的1MNaOH/10％DMSO溶液，置温度80℃水浴中2h后在470nm处测定吸收值A，未用药的组作为对照组与用药组进行对比见表1；
表1.化合物对小鼠B16细胞中黑素合成的作用结果
结果显示：与阴性对照(不给药组)相比，除化合物14以外的所有化合物均可促进B16细胞中黑素的生成，促进作用从112％到263％不等，其中化合物8，15，17，18和20对黑素生成的促进作用可以达到200％以上；与阳性对照(8-简甲氧基补骨脂素，即8-MOP)相比，除11和14以外的所有化合物，对黑素生成的促进作用均优于阳性对照，其中化合物17和18对黑素生成的促进作用是阳性对照的2倍以上；该方法反应条件温和，实验步骤简捷。通过本发明所述方法获得的20个补骨脂素类化合物，除化合物14以外均具备在临床上制备治疗白癜风的药物的用途。
Claims (1)
1.一种补骨脂素类化合物在制备治疗白癜风药物中的用途，其特征在于，所述补骨脂素类化合物为：化合物15为4-甲基-6, 7, 8, 9-四氢-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；化合物16为6, 7, 8, 9-四氢-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；化合物18为4-甲基-2H-苯并呋喃 [3,2-g]苯并吡喃-2-酮；化合物19为6-苯基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮；化合物20为4-甲基-6-苯基-2H-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-2-酮。
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