CN109939106B - 驱虫斑鸠菊中分离的倍半萜类化合物在制备治疗白癜风的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种驱虫斑鸠菊中分离的倍半萜类化合物在制备治疗白癜风的药物中的用途，该倍半萜类化合物是从驱虫斑鸠菊种子中分离纯化得到的具有促进黑素合成的倍半萜类化合物斑鸠菊大苦素、斑鸠菊醇D和vernodalinol 3个倍半萜类化合物。并考察了这3个倍半萜类化合物对小鼠B16黑色素瘤细胞黑素含量的影响，结果表明：在不影响细胞存活率的药物浓度作用下，化合物1‑3均能明显增加黑素的合成，可以作为治疗白癜风药物的先导化合物。

Description

驱虫斑鸠菊中分离的倍半萜类化合物在制备治疗白癜风的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种从驱虫斑鸠菊种子中分离纯化得到的具有促进黑素合成的倍半萜类化合物斑鸠菊大苦素、斑鸠菊醇D和vernodalinol，在制备治疗白癜风的药物中的用途。

背景技术

白癜风是一种常见的自发或特发性的后天性色素脱失性疾病，主要特征为皮肤和毛发黑素细胞选择性破坏导致的色素脱失。白癜风在不同地域和种族间有较大的差异，肤色较深的人群更易患病，我国白癜风的患病率为0.09％-2.7％。通过我国6个省、自治区中各选择1个城市作为调查点，进行多地区、大样本白癜风流行病学研究，结果表明白癜风总患病率0.70％，标化患病率为0.56％。其中男性患病率为0.95％，标化患病率为0.69％，女性患病率为0.50％，标化患病率为0.45％,男性患病率较女性高。据世界卫生组织统计，全球白癜风患病人数高达5000多万，我国约有1200万名患者，发病率呈年轻化趋势。白癜风病因和发病机制目前尚不完全清楚，目前有自身免疫学说、黑素细胞自毁学说、神经化学因子学说、遗传学说、黑素细胞内在缺陷学说、自由基防御机制缺陷学说和黑素细胞经表皮丢失学说等七种学说。由于其难以治疗，愈后复发和皮损的特点，白癜风往往对患者造成较大的心理困扰，对患者的工作、学习、社交、就业、婚姻等各方面造成不良影响。

驱虫斑鸠菊(Vernonia anthelmintica(L.)willd.)为一年生高大草本，茎直立，高达60厘米。此种据文献记载只见于巴基斯坦、印度、斯里兰卡、尼泊尔、阿富汗、马来西亚等国，在中国分布于云南西部，在新疆南部的阿克苏、和田有栽培。《中华人民共和国卫生部药品标注维吾尔药分册》中记载，本品属于三级干热，主要功能与主治为清除异常粘液质、驱虫、消肿、散寒止痛。常用于湿寒性胃痛及肝病、白癜风等。

有关驱虫斑鸠菊的化学成分研究主要集中在种子油部分以及提取物，除去油之后部分的化学成分研究并不多。查阅国内外文献发现，从驱虫斑鸠菊中分离得到的脂肪酸及其酯类除外的化合物类型主要包括倍半萜内酯类、黄酮类、三萜类、甾体类、咖啡酰基奎宁酸类等。

目前白癜风治疗药物的西药有补骨脂素及其衍生物、大剂量维生素、免疫调节剂、皮质类固醇激素等，但是副作用大；中药有白癜风丸、敏白灵片、敏柏宁、白癜风胶囊、祛白酊、复方白芷酊等，但是疗效较为一般。从中药及天然药物资源中寻找和发现高效、低毒、结构独特的治疗白癜风的药物成为一条有效的途径。经过多年研究，治疗白癜风的药物主要集中在香豆素、黄酮等类型的化合物，倍半萜类化合物作为治疗白癜风的药物用途尚未有报道。

经文检索，有关文献为：

[1].王娟，马慧群,白癜风的治疗进展,中国医学文摘-皮肤科学2010,27,(3):149-153.

[2].靳旺洋，訾绍霞，刘爱英,治疗白癜风中药对黑素细胞代谢影响的研究进展,中国中西医结合杂志2016,36,(9):1149-1152.

[3].王晓艳，王婷琳，周城，沈佚葳，丁晓岚，田珊，刘盈，彭光辉，周俊娥，薛树旗,中国六省市白癜风流行病学调查,中华皮肤科杂志2010,43,(7):463-466.

[4].宋树玲,白癜风发病机制和治疗方法新进展,中国实用医药2018,(5):193-194.

[5].王莉,白癜风发病机制及病因学研究进展,医学信息2014,(17):663.

[6].陈军，康晓静,白癜风病因及其发病机制研究进展,中国麻风皮肤病杂志2011,27,(2):112-114.

[7].古东,白癜风病因及发病机制研究现状,皮肤病与性病2000,(4):17-20.

[8].鲁燕侠，王向党，刁俊龙，刘振华,白癜风治疗药物概况,现代生物医学进展2010,10,(13):2587-2589.

[9].周平兰，欧阳恒，王竹鑫,白癜风的药物治疗进展,中医药导报2005,11,(1):77-79.

[10].朱铁君,白癜风药物治疗的进展和临床应用评价,中国医院用药评价与分析2005,5,(6):331-334。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种驱虫斑鸠菊中分离的倍半萜类化合物在制备治疗白癜风的药物中的用途，该倍半萜类化合物是从驱虫斑鸠菊种子中分离纯化得到的具有促进黑素合成的倍半萜类化合物斑鸠菊大苦素、斑鸠菊醇D和vernodalinol 3个倍半萜类化合物。并考察了这3个倍半萜类化合物对小鼠B16黑色素瘤细胞黑素含量的影响，结果表明：在不影响细胞存活率的药物浓度作用下，化合物1-3均能明显增加黑素的合成，可以作为治疗白癜风药物的先导化合物。

本发明所述的一种驱虫斑鸠菊中分离的倍半萜类化合物在制备治疗白癜风的药物中的用途，其中所述倍半萜类化合物为化合物1为斑鸠菊大苦素；化合物2为斑鸠菊醇D；化合物3为vernodalinol。

本发明所述的一种驱虫斑鸠菊中分离的倍半萜类化合物在制备治疗白癜风的药物中的用途，所述的驱虫斑鸠菊中分离的倍半萜类化合物，其结构式为：

其中：

化合物1为斑鸠菊大苦素；

化合物2为斑鸠菊醇D；

化合物3为vernodalinol。

本发明所述的一种驱虫斑鸠菊中分离的倍半萜类化合物在制备治疗白癜风的药物中的用途，所述的驱虫斑鸠菊中分离的倍半萜类化合物的制备方法，按下列步骤进行：

制备驱虫斑鸠菊提取液：

a、将粉粹的驱虫斑鸠菊种子0.5Kg，用40％乙醇回流提取3次，合并提取液，浓缩至无醇味，得到驱虫斑鸠菊提取液；

分离纯化：

b、将步骤a得到的提取液加入水定容至6倍树脂的柱床体积，经HPD-300大孔吸附树脂进行色谱洗脱，先用0.5倍柱床体积的蒸馏水洗脱去除杂质，再用浓度为60％的乙醇溶液洗脱3倍柱床体积，收集洗脱液，浓缩得到浸膏；

c、将步骤b中得到的浸膏用体积比1:1的氯仿:甲醇混合溶剂溶解，与硅胶(100-200目)拌样，用正相中压制备色谱进行分离，按体积比100:0，80:20，60:40，40:60，20:80的氯仿:甲醇依次梯度洗脱，检测波长为210nm，254nm和330nm，根据紫外检测图谱进行合并，得到6个流分A-F；

d、将步骤c中得到的流分C与质量1.5倍的反相硅胶(ODS)进行拌样，用反相中压制备色谱进行分离，按照体积比为10％，20％，40％，60％，80％的甲醇:水进行梯度洗脱，检测波长为210nm，根据紫外检测图谱进行合并，得到流分C1-C7；

e、将步骤d中得到的流分C2和C3用半制备高效液相色谱(pHPLC)进行反复分离纯化，洗脱剂为不同浓度的乙腈/水，流速为2.5-3ml/min，检测波长为210nm，按照色谱图收集，得到化合物1斑鸠菊大苦素、化合物2斑鸠菊醇D和化合物3vernodalinol，再将化合物2斑鸠菊醇D和化合物3vernodalinol经真空干燥得到白色粉末，化合物1斑鸠菊大苦素经冷冻干燥得到白色粉末；

f、将步骤e中得到的化合物1斑鸠菊大苦素、化合物2斑鸠菊醇D和化合物3vernodalinol经高分辨质谱以及核磁共振测定，与文献对比，确认其结构。

具体实施方式

实施例

本发明所述的一种驱虫斑鸠菊中分离的倍半萜类化合物对小鼠B16黑色素瘤细胞黑素含量测定实验：

将分离得到的3个倍半萜化合物对B16黑色素瘤细胞的黑素含量测定：

筛选模型：小鼠B16黑素瘤细胞；

细胞来源：中科院细胞库提供；

培养条件：用10％胎牛血清、1％双抗的高糖杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM培养基)培养细胞24h后，加入不同浓度的药物和阳性对照，分别在48h和72h测定酪氨酸活性和黑素含量；

测定方法：

蛋白定量用Bradford法测定：

完全溶解蛋白标准品(5mg/ml BSA)，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml，蛋白样品与标准品用相同溶液稀释；但是为了简便起见，或用0.9％NaCl或PBS稀释标准品；将稀释后标准品(0.5mg/ml BSA)按0,1,2,4,8,12,16,20μl分别加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20μl；各孔加入200μl Bradford染色液，用加样枪轻轻吹打混匀(注意不要弄出气泡影响读数)室温放置3-5分钟；用酶标仪测定A595；根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度；

黑素的含量用碱消化法进行测定：

正处于对数生长期的B16黑素瘤细胞接种于6cm培养皿中，浓度为2×10⁵个/ml，各孔加5ml细胞悬浮液；接种12h后，待细胞完全贴壁后接种化合物1斑鸠菊大苦素、化合物2斑鸠菊醇D和化合物3vernodalinol，将3个化合物配置成浓度：化合物1斑鸠菊大苦素和化合物2斑鸠菊醇D为0.1，1,和10μM；化合物3vernodalinol为1,10和50μM，在72h后收集细胞，在不破碎细胞的情况下加入200μl的1M NaOH/10％二甲基亚砜(DMSO)溶液，置温度80℃水浴中2h后再470nm处测定吸收值A，8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)作为阳性对照，未用药组(阴性对照组)作为对照组与用药组进行对比，见表1；

表1.三种倍半萜对细胞中黑素合成作用结果

注：样品按浓度梯度作用于B16细胞,每个样品重复3次进行测定；

阴性对照：2μL DMSO；

阳性对照：8-MOP；

由于化合物1斑鸠菊大苦素在浓度为10μM时细胞全部死亡，无法检测，故稀释用药浓度为2,3和5μM，结果见表2.

表2稀释后斑鸠菊大苦素对细胞中黑素合成作用结果

注：样品按浓度梯度作用于B16细胞，每个样品重复3次进行测定；

阴性对照：2μL DMSO；

阳性对照：8-MOP；

从表中可以看出，化合物2斑鸠菊醇D在浓度为1μM和10μM时能明显促进黑素合成，其黑素含量比浓度为50μM的阳性对照8-MOP都高；化合物3vernodalinol促进黑素合成的作用与阳性对照相当；化合物1斑鸠菊大苦素在浓度为2μM时与浓度为50μM的阳性对照的黑素含量相当，说明斑鸠菊大苦素也能明显促进黑素合成作用。该3种倍半萜类化合物可作为治疗白癜风的药物用途的先导化合物。

Claims (1)

1.一种驱虫斑鸠菊中分离的倍半萜类化合物作为活性成分在制备治疗白癜风的药物中的用途，其中所述倍半萜类化合物为化合物1或化合物2或化合物3，其中化合物1是浓度为0.1μM-5μM的斑鸠菊大苦素；化合物2是浓度为0.1μM-10μM的斑鸠菊醇D；化合物3是浓度为1μM-50μM的vernodalinol；

其中化合物1斑鸠菊大苦素的结构式为：

化合物2斑鸠菊醇D的结构式为：

化合物3vernodalinol的结构式为：