CN103285052A

CN103285052A - 长柱金丝桃提取物在制备抗肿瘤及抑制肿瘤生长药物中的应用

Info

Publication number: CN103285052A
Application number: CN2013102400095A
Authority: CN
Inventors: 张同存; 李秀梅; 罗学刚; 王楠; 李琨; 马宁; 张瑶; 白俊珍
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-06-17
Also published as: CN103285052B

Abstract

本发明涉及了一种长柱金丝桃提取物在制备抗肿瘤及抑制肿瘤生长药物中的应用，本发明通过长柱金丝桃提取物对细胞毒性、细胞存活率和细胞凋亡的分析，得出长柱金丝桃提取物对肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用；长柱金丝桃提取物对人宫颈癌细胞（Hela）具有抑制增殖和凋亡的作用。

Description

长柱金丝桃提取物在制备抗肿瘤及抑制肿瘤生长药物中的应用

技术领域

本发明属于中医药领域，涉及长柱金丝桃提取物，尤其是长柱金丝桃提取物在制备抗肿瘤及抑制肿瘤生长药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，极大地危害人类的健康，并将成为新世纪人类的第一杀手。从世界范围来看，2000年全球新发癌症病例1010万，死亡620万，现患癌症病例2240万，2008年癌症发病人数和死亡人数分别上升到1266万和756万，估计到2015年将有1500万新发病例。同时，恶性肿瘤已不再只是发达工业国家的严重疾病，发展中国家面临着更大的疾病负担。2008年恶性肿瘤发病人数发展中国家占56%；2009年80%的癌症患者集中在中低收入国家，到2015年，发展中国家估计有900万人死于癌症。

近年来，大量的临床和实验研究证明，中医药在肿瘤的防治和康复方面具有重要的作用。长柱金丝桃(Hypericumascyron)为藤黄科、金丝桃属植物黄海棠的干燥地上部分，以全草入药，收载于《全国中草药汇编》，性寒，味微苦。具有凉血止血、清热解毒的功效，用于治疗出血、跌打损伤、疮疖肿毒、肝炎等症。现代药理研究表明长柱金丝桃具有平喘，止咳，祛痰的作用。专利号CN103091439A，报道了长柱金丝桃药材HPLC指纹图谱的建立方法及标准指纹图谱和应用。尚未见长柱金丝桃抗肿瘤作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供长柱金丝桃提取物在制备抗肿瘤及抑制肿瘤生长药物中的应用，本发明涉及的长柱金丝桃提取物的细胞毒性实验结果表明，该提取物具有细胞毒性，72小时的半数致死浓度为58.24μg/mL。

本发明实现目的的技术方案如下：

长柱金丝桃提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

而且，长柱金丝桃提取物的制备方法为：长柱金丝桃全草阴干，粉碎成粗粉，过60目分析筛，采用超声萃取法提取长柱金丝桃全草中的总黄酮，在超生功率700W，乙醇浓度60%，料液比g:ml为1：30的条件下，超生30min，5000rpm离心10min，取上清液，浓缩，干燥，得长柱金丝桃提取物。

而且，所述的肿瘤为MCF-7，MDA-MB-231，HCT-8，HeLa，HepG2细胞。

长柱金丝桃提取物在制备抑制肿瘤生长药物中的应用。

而且，所述的肿瘤为MCF-7，MDA-MB-231，HCT-8，HeLa，HepG2细胞。

本发明的优点和有益效果为：

⑴本发明通过长柱金丝桃提取物对细胞毒性、细胞存活率和细胞凋亡的分析说明：长柱金丝桃提取物对肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用；长柱金丝桃提取物对人宫颈癌细胞(Hela)具有抑制增殖和凋亡的作用。

⑵本发明通过MTT法分析了长柱金丝桃提取物对5种肿瘤细胞（MCF-7，MDA-MB-231，HCT-8，HeLa，HepG2）存活率的影响，长柱金丝桃提取物具有显著的抑制肿瘤增殖的作用。

⑶本发明通过TUNEL/DAPI双染色法，证明了长柱金丝桃提取物对人宫颈癌细胞（Hela）具有凋亡的作用。

⑷本发明通过Hoechst33342/PI双染色法，进一步证明了长柱金丝桃提取物对人宫颈癌细胞(Hela)具有凋亡的作用。

附图说明

图1长柱金丝桃总黄酮对几种肿瘤的细胞毒性作用，◆HCT-8，□Hela，▲MDA-MB-231，△HepG2，■MCF-7和●H9c2。

图2长柱金丝桃总黄酮对人宫颈癌细胞存活率的影响，图A代表的是不同浓度(12.5,25,50,100and200μg/mL)长柱金丝桃总黄酮在不同作用时间下，对Hela细胞存活率的影响，▲24h;■48h;◆72h；图B代表的是不同时间（24h，48h和72h）下，长柱金丝桃总黄酮(12.5,25,50,100，200μg/mL)对Hela细胞存活率的影响，◆12.5μg/mL;■25μg/mL;▲50μg/mL;╳100μg/mL;□200μg/mL。

图3长柱金丝桃总黄酮对Hela细胞形态学的影响，A：对照组；B:12.5μg/mL；C:25μg/mL；D：50μg/mL;E:100μg/mL；F:200μg/mL。

图4长柱金丝桃总黄酮诱导Hela细胞凋亡。A：用不同浓度(12.5,25,50,100，200μg/mL)的长柱金丝桃总黄酮培养Hela细胞72h，细胞被TUNEL/DAPI双染色，在荧光显微镜下观察。B：用不同浓度(12.5,25,50,100，200μg/mL)的长柱金丝桃总黄酮培养Hela细胞72h，细胞被Hoechst33342/PI双染色，在荧光显微镜下观察。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

如无特殊说明，本发明中所使用的试剂为常规试剂；如无特殊说明，所使用的方法为常规方法。

本发明提供的长柱金丝桃提取物在抗肿瘤和抑制肿瘤增殖中的应用，其中长柱金丝桃提取物是从长柱金丝桃全草中提取出来的，提取是按如下步骤进行的：

所述长柱金丝桃提取物的制备方法如下：

⑴长柱金丝桃全草阴干，粉碎成粗粉，过60目分析筛，采用超声萃取法（超生功率700W，乙醇浓度60%，料液比（g:ml）为1：30的条件下，超生30min）提取长柱金丝桃全草中的总黄酮，过滤，得滤液；

⑵在温度低于50℃的条件下，减压浓缩，得长柱金丝桃提取物浸膏。

⑶富集长柱金丝桃提取物：上样于大孔树脂柱（树脂型号:D101），按浸膏与树脂的质量比为1：5～8比例上样，再以质量浓度为20%～80%、体积为大孔树脂柱体积的2～6倍的乙醇洗脱，收集洗脱液以低于50℃的条件减压浓缩，干燥，得长柱金丝桃提取物。

本发明的长柱金丝桃提取物的细胞实验。

一、细胞毒性和细胞存活率实验

用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测长柱金丝桃提取物的细胞毒性作用。取对数生长期的细胞接种于96孔培养板,每孔100μL,37℃,5%CO₂培养箱中培养。24h后弃去培养基，分别加入无血清培养基和无菌的长柱金丝桃提取物（终浓度分别为12.5、25、50、100、200μg/mL,各组设3个重复孔,对照组加100μL培养液,在37℃,5%CO₂条件下继续培养72h后，每孔加入MTT(5mg/mL)10μL,继续培养4h；弃上清,每孔加二甲基亚砜100μL，避光振荡10min,使MTT结晶物充分溶解。选择490nm波长测定各孔吸光值,记录结果，计算细胞存活率。MCF-7,MDA-MB-231,HCT-8,HeLa,andHepG2的IC50值分别为66.41,73.07,56.41,22.19,and104.04μg/mL。长柱金丝桃提取物对正常的H9c2细胞的半数致死浓度为58.24μg/mL。所以，我们选择Hela细胞作为研究的对象。结果如附图1所示。

二、凋亡分析

1、光学显微镜下细胞形态学的改变

HeLa细胞（1×10⁶细胞/孔,2ml/孔）被接种于6孔板，37℃,5%CO₂培养箱中培养。培养24h后，分别加入长柱金丝桃提取物（终浓度分别为0，12.5、25、50、100、200μg/mL），在37℃,5%CO₂条件下，继续培养72h。显微镜下观察细胞形态变化，实验结果见附图3。与对照相比，在低浓度(12.5μg/mL)时，细胞形态没有明显的变化。在长柱金丝桃提取物浓度为25，50,100,200μg/mL时，细胞核变圆。并且，随着长柱金丝桃提取物浓度的增加，细胞形成越来越大的空泡。另外，细胞呈现分散状态，而且暴露出中央核。

2、TUNEL/DAPI双染色法

细胞（1×10⁵细胞/孔,0.5mL/孔）被接种于24孔板，37℃,5%CO₂培养箱中培养。培养24h后分别加入长柱金丝桃提取物（终浓度分别为0，12.5、25、50、100、200μg/mL），在37℃,5%CO₂条件下继续培养72h。吸掉培养液,PBS洗3次,用4%多聚甲醛，在4℃，放置25分钟。再用新鲜的PBS中浸泡，在室温放5分钟。重复用PBS洗。通透细胞，加入0.2%配制于PBS中的

X-100溶液，放置5分钟。洗涤样本，用新鲜的PBS洗，在室温放置5分钟。重复用PBS洗。去掉多余的液体。用100μL平衡缓冲液覆盖细胞。在室温下放置5-10分钟平衡。在平衡后的区域周围用吸水纸吸掉100μL平衡缓冲液中的大部分，然后加上100μLrTdT孵育缓冲液。在37℃孵育60分钟发生加尾反应。将24孔板用铝箔纸包裹以避免光照。用去离子水1:10稀释20XSSC，加入足量配好的2XSSC，室温放置15分钟以终止反应。用新鲜的PBS洗涤样本，室温放置5分钟。重复两次，总共洗三次以去除未掺入的荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷。加入终浓度10μg/mL的DAPI，室温放置15分钟，此处DAPI是用PBS新配稀释到1μg/mL的。用新鲜的PBS洗涤样本，室温放置5分钟。重复两次，总共洗三次。立即在荧光显微镜下分析样本，用标准的荧光过滤装置在520±20nm的荧光下观察绿色荧光；以及在460nm观察蓝色荧光。

结果如图附图4所示，与对照相比，在低浓度为12.5μg/mL时,细胞核为完整蓝色的核，浓度为25μg/mL时,细胞核为蓝色，部分发生固缩，变圆；在浓度为50,100,200μg/mL时，细胞核表现为固缩，变圆，核变小。这些结果说明，细胞正处于凋亡状态。

3、Hoechst33342/PI

细胞（1×10⁵细胞/孔,2mL/孔）被接种于6孔板，37℃,5%CO₂培养箱中培养。培养24h后，分别加入长柱金丝桃提取物（终浓度分别为0，12.5、25、50、100、200μg/mL），在37℃,5%CO₂条件下继续培养72h。吸掉培养液,PBS轻洗3次,培养细胞中加入hoechst33342/PI混合染液（终浓度10μg/mL），避光染色30min，荧光显微镜下观察。

结果如附图4所示，在浓度为12.5μg/mL时，细胞核表现为蓝色完整的核，部分细胞核发生固缩，变为亮蓝色；在浓度为25,50,100,200μg/mL时，细胞核全部变为亮蓝色，细胞变少，变圆。结果说明细胞正处于凋亡早中期。

Claims

1.长柱金丝桃提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的长柱金丝桃提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：长柱金丝桃提取物的制备方法为：长柱金丝桃全草阴干，粉碎成粗粉，过60目分析筛，采用超声萃取法提取长柱金丝桃全草中的总黄酮，在超生功率700W，乙醇浓度60%，料液比g:ml为1：30的条件下，超生30min，5000rpm离心10min，取上清液，浓缩，干燥，得长柱金丝桃提取物。

3.根据权利要求1所述的长柱金丝桃提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为MCF-7，MDA-MB-231，HCT-8，HeLa，HepG2细胞。

4.长柱金丝桃提取物在制备抑制肿瘤生长药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的长柱金丝桃提取物在制备抑制肿瘤生长药物中的应用，其特征在于：长柱金丝桃提取物的制备方法为：长柱金丝桃全草阴干，粉碎成粗粉，过60目分析筛，采用超声萃取法提取长柱金丝桃全草中的总黄酮，在超生功率700W，乙醇浓度60%，料液比g:ml为1：30的条件下，超生30min，5000rpm离心10min，取上清液，浓缩，干燥，得长柱金丝桃提取物。

6.根据权利要求4所述的长柱金丝桃提取物在制备抑制肿瘤生长药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为MCF-7，MDA-MB-231，HCT-8，HeLa，HepG2细胞。