CN101933964A - 金龙胆草总皂苷在制备抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了金龙胆草总皂苷在制备抗肿瘤药物中的用途。利用MTT法检测金龙胆草总皂苷对宫颈癌Hela细胞和肺癌SPC-A1细胞的生长抑制率并计算IC50，结果说明金龙胆草总皂苷对Hela和SPC-A1细胞的生长抑制均呈时间和浓度依赖性。采用琼脂糖凝胶电泳方法，检测出金龙胆草总皂苷作用后细胞显示凋亡特征DNA ladder，表明金龙胆草总皂苷对Hela和SPC-A1细胞有凋亡作用；Western-blot方法检测金龙胆草总皂苷对细胞凋亡关键蛋白caspase-3含量的影响，通过半定量分析得出金龙胆草总皂苷作用细胞后caspase-3增加，说明金龙胆草总皂苷对细胞的生长抑制是由凋亡机制调节的。
Description
技术领域
本发明涉及一种金龙胆草总皂苷的用途。
背景技术
癌症是目前危害人类健康的三大疾病之一。近二十年来，由于受空气污染加重、吸烟人群增加以及一些长期与放射性物质、石棉等化学致癌物接触的职业相继出现等因素的影响使得肺癌的发病率逐年增高，肺癌已成为男性恶性肿瘤患者的首要死亡原因。宫颈癌是危害妇女生命及降低妇女生活质量的主要疾病之一。在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌。在发展中国家，宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤，排行榜首。目前在发展中国家，宫颈癌的发病率为女性恶性肿瘤的第2位。手术和放疗为主的癌症治疗方法，只对癌症初期可取得较好的疗效，对于中晚期的治疗不理想。近年来，随着对肿瘤发生，发展机制的深入研究，化疗在癌症的治疗中逐渐受到重视。化疗作为一种全身治疗手段，可有效提高晚期复发转移和癌症高危患者的生存率。从天然植物中获得有效的抗癌有效组分或抗癌化合物，已成为当今肿瘤药物开发研究的热点。
中国专利ZL 200610129423.9公开了金龙胆草总皂苷的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供金龙胆草总皂苷在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明的技术方案概述如下：
金龙胆草总皂苷在制备抗肿瘤药物中的用途。
所述金龙胆草总皂苷是用下述方法制成：将金龙胆草用乙醇水溶液提取；将乙醇提取液依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取；将正丁醇萃取液减压浓缩得到粗皂苷；将粗皂苷经大孔树脂柱层析，然后用水、体积浓度为30％的乙醇水溶液、体积浓度为70％的乙醇水溶液和体积浓度为95％的乙醇水溶液梯度洗脱，将70％乙醇洗脱液减压浓缩而得到金龙胆草总皂苷。
所述肿瘤为宫颈癌或肺癌。
利用MTT法检测金龙胆草总皂苷对宫颈癌细胞系Hela细胞和肺癌细胞系SPC-A1细胞的生长抑制率并计算IC50，结果说明金龙胆草总皂苷对Hela细胞和SPC-A1细胞的生长抑制均呈时间和浓度依赖性。采用琼脂糖凝胶电泳方法，检测出金龙胆草总皂苷作用后显示出凋亡细胞所应有的凋亡特征DNA ladder，表明金龙胆草总皂苷对Hela和SPC-A1细胞有凋亡作用；Western-blot方法检测金龙胆草总皂苷对细胞凋亡关键蛋白caspase-3含量的影响，通过半定量分析得出金龙胆草总皂苷作用细胞后caspase-3增加，说明金龙胆草总皂苷对细胞的生长抑制是由凋亡机制调节的。
附图说明
图1为XB-5对Hela细胞的作用*为与对照组(顺铂)对照，P＜0.05。
图2为XB-5对SPC-A1细胞的作用*为与对照组(紫杉醇)对照，P＜0.05。
图3为HE染色a：XB-5对SPC-A1作用48h结果，b：空白对照，c：电镜图片。
图4为琼脂糖凝胶电泳检测核DNA结果。
图5为SPC-A1细胞免疫印迹实验结果。
图6为XB-5对SPC-A1细胞内caspase的作用*为与对照组对照，P＜0.05。
图7为Hela细胞免疫印迹实验结果。
图8为XB-5对Hela细胞内caspase的作用*为与对照组对照，P＜0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发有作进一步的说明。
实施例1
金龙胆草总皂苷的制备：
将金龙胆草用体积百分浓度为95％的乙醇水溶液回流提取2次，然后用体积百分浓度为60％的乙醇水溶液回流提取1次；提取液经过滤后合并，减压浓缩至无乙醇，然后用水混悬至浓度约30％，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取；将正丁醇萃取液减压浓缩得到粗皂苷；将粗皂苷经大孔树脂柱层析，然后用水、体积浓度为30％乙醇水溶液、体积浓度为70％乙醇水溶液和体积浓度为95％的乙醇水溶液梯度洗脱，最后将70％乙醇洗脱液减压浓缩而得到金龙胆草总皂苷。
实施例2
金龙胆草总皂苷对宫颈癌细胞(Hela细胞)的抑制作用：
用0.25％的胰酶消化液1mL，37℃消化Hela细胞5min，显微镜下观察胞质回缩、细胞间隙增大也即细胞变圆后，终止消化；加入含10％FBS的培养液中和胰酶；细胞计数，将细胞稀释至2×104个/mL，加入96孔板中，每孔加200μl细胞悬液；将培养板置培养箱中培养24h，使细胞贴壁，等细胞进入指数生长期时加入药物；用培养基将实验组(金龙胆草总皂苷，XB-5实施例1制备)和对照组(顺铂，DDP)药物10倍系列稀释，浓度(XB-5以M＝1200计算)依次为10-3M，10-4M，10-5M，10-6M，10-7M，并做空白对照，每个药物浓度设5个复孔，分别于24、48和72h取出；每孔加入5mg/mL MTT 20μl，继续培4h后弃培养液，每孔加入DMSO 150μl，震荡10min，酶标仪570nm波长测各孔的吸光值A值(OD值)，计算细胞抑制率[细胞抑制率(％)＝(1-试验组OD值/对照组OD值)×100％]。以药物浓度为横轴，存活率为纵轴，绘制浓度效应曲线，确定半数抑制(IC50)浓度。见图1。
从图1可以看出T＝48h时，XB-5对Hela细胞的生长抑制作用较明显，并呈时间和浓度依赖性(A图)。T＝72h时检测XB-5对Hela细胞的抑制作用，结果与48h药效变化不明显，因此在选定浓度下做存活率与时间关系图(B图)，结果说明XB-5对Hela细胞的生长抑制呈时间和浓度依赖性，本实验选择T＝48h，IC50＝15.01μg/mL为实验浓度。
实验数据均用spss11.5统计软件进行分析。数据表示为x±SD，用t检验比较组间显著性差异。
实施例3
金龙胆草总皂苷对肺癌细胞(SPC-A1)细胞的抑制作用。
用0.25％的胰酶消化液1mL，37℃消化SPC-A1细胞5min，显微镜下观察胞质回缩、细胞间隙增大也即细胞变圆后，终止消化；加入含10％FBS的培养液中和胰酶；细胞计数，将细胞稀释至2×104个/mL，加入96孔板中，每孔加200μl细胞悬液；将培养板置培养箱中培养24h，使细胞贴壁，等细胞进入指数生长期时加入药物；用培养基将实验组(金龙胆草总皂苷，XB-5)和对照组(紫杉醇，Paclitaxel)药物10倍系列稀释，浓度(XB-5以M＝1200计算)依次为10-3M，10-4M，10-5M，10-6M，10-7M，并做空白对照，每个药物浓度设5个复孔，分别于24、48和72h取出；每孔加入5mg/mL MTT 20μl，继续培4h后弃培养液，每孔加入DMSO 150μl，震荡10min，酶标仪570nm波长测各孔的吸光值A值(OD值)，计算细胞抑制率[细胞抑制率(％)＝(1-试验组OD值/对照组OD值)×100％]。以药物浓度为横轴，存活率为纵轴，绘制浓度效应曲线，确定半数抑制(IC50)浓度。见图2。
图2中XB-5对SPC-A1细胞的生长抑制作用较明显，并呈时间和浓度依赖性(A图)。T＝72h时检测XB-5对SPC-A1细胞的抑制作用，结果与48h药效变化不明显，因此在选定浓度下做存活率与时间关系图(B图)，结果说明XB-5对SPC-A1细胞的生长抑制呈时间和浓度依赖性，本实验选择T＝48h，IC50＝12.42μg/mL，作为实验浓度。
实验数据均用spss11.5统计软件进行分析。数据表示为x±SD，用t检验比较组间显著性差异。
实施例4
金龙胆草总皂苷对肿瘤细胞形态学影响的观察：
SPC-A1细胞和Hela细胞，以1×107个/ml的浓度接种于25cm2培养瓶中，加入RPMI1640培养液(Gibco公司)，含5％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。SPC-A1细胞和Hela细胞的生长速度都较快，每两天换液一次，每四到五天传代一次，两种细胞均为上皮样细胞，呈多角形、铺路石状生长；然后用XB-5诱导细胞48h后取出，用PBS漂洗，乙醇固定后进行苏木素、伊红(HE)染色，倒置显微镜下观察染色结果。
图3为经XB-5作用后SPC-A1细胞HE染色结果：在倒置相差显微镜(400×)下观察，XB-5作用后细胞由原来的多角形变小、变圆，核呈蓝色或蓝黑色，胞浆呈淡粉色，核固缩、破碎，细胞周围出现空泡。如果在电镜下观察会看到细胞周围形成的凋亡小体。
实施例5
金龙胆草总皂苷对肿瘤细胞琼脂糖凝胶电泳结果的影响：
细胞凋亡是通过蛋白水解的一系列连锁反应实现的，需要激活caspase家族，并最终激活核酸内切酶。在内源性核酸内切酶作用下，DNA会进行有控降解，产生长度为180～200bp整倍数的DNA片段。
首先加XB-5刺激，将SPC-A1细胞和Hela细胞分别分为阳性对照组和实验组，分别加入含有IC50值浓度的XB-5培养液，空白组更换新鲜培养液，培养48h后用细胞裂解液提取DNA，置-20℃冰箱中保存备用。
图4为经XB-5作用后细胞出现了DNA ladder，对比相关文献中的琼脂糖凝胶电泳图，能定性说明XB-5抑制细胞生长的途径与凋亡有关。
实施例6
金龙胆草总皂苷对SPC-A1细胞内caspase-3含量的影响：
将SPC-A1细胞分为阳性对照组和实验组，分别加入含有IC50值浓度的XB-5和DDP培养液，空白组更换新鲜培养液，培养48h后，吸出培养液并用胰酶消化，离心提取细胞内总蛋白，总蛋白提取液与上样缓冲液1∶1混匀后，沸水浴5min，跑SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后曝光显影观察结果。
曝光显影之后X光片上分别显示出了SPC-A1细胞内caspase-3和β-actin(内参)的条带(见图5)。
图6中β-actin为内参，采用半定量的方法对比XB-5、空白对照以及阳性对照DDP作用后SPC-A1细胞内Caspase-3的含量，结果表明XB-5能促进Caspase-3的表达。实验数据均用spss11.5统计软件进行分析。数据表示为x±SD，用t检验比较组间显著性差异。
实施例7
金龙胆草总皂苷对Hela细胞内caspase-3含量的影响：
将Hela细胞分为阳性对照组和实验组，分别加入含有IC50值浓度的XB-5和DDP培养液，空白组更换新鲜培养液，培养48h后，吸出培养液并用胰酶消化，离心提取细胞内总蛋白，总蛋白提取液与上样缓冲液1∶1混匀后，沸水浴5min，跑SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后曝光显影观察结果。
曝光显影之后X光片上分别显示出了Hela细胞内caspase-3和β-actin(内参)的条带(见图7)。
图8中β-actin为内参，采用半定量的方法对比XB-5、空白对照以及阳性对照顺铂作用后Hela细胞内Caspase-3的含量，结果表明XB-5促进Caspase-3的表达。实验数据均用spss11.5统计软件进行分析。数据表示为x±SD，用t检验比较组间显著性差异。
实施例8
将干燥且经过粉碎的金龙胆草62g用体积百分浓度为94％的乙醇水溶液加热回流提取2次，每次2小时；过滤后将滤渣用体积百分浓度为61％乙醇的水溶液加热回流提取2小时并过滤，将滤液合并，然后减压浓缩至乙醇完全挥发。将上述浓缩液用蒸馏水稀释至100ml，然后在分液漏斗中用等量乙酸乙酯萃取4次以去除杂质，并将水层减压浓缩至乙酸乙酯完全挥发，之后再于分液漏斗中用等量正丁醇萃取7次，最后将合并后的正丁醇萃取液减压浓缩而得到粗皂苷3.5g。将上述粗皂苷溶于水并经大孔树脂D101柱层析，然后依次用水、体积浓度为30％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液进行梯度洗脱，最后将70％乙醇洗脱液减压浓缩即可获得金龙胆草总皂苷1.8g，得率为2.9％。
抗肿瘤实验证明，实施例8制备的金龙胆草总皂苷具有较高的抗癌活性，对Hela细胞和SPC-A1细胞的生长抑制均呈时间和浓度依赖性。
实施例9
将干燥且经过粉碎的金龙胆草1kg用体积百分浓度为98％的乙醇水溶液加热回流提取2次，每次2小时，过滤后将滤渣用63％的乙醇加热回流提取2小时并过滤，将滤液合并，然后减压浓缩至乙醇完全挥发。将上述浓缩液用蒸馏水稀释至1000ml，然后在分液漏斗中用等量乙酸乙酯萃取4次以去除杂质，并将水层减压浓缩至乙酸乙酯完全挥发，之后再于分液漏斗中用等量正丁醇萃取7次，最后将合并后的正丁醇萃取液减压浓缩而得到粗皂苷45.9g。将上述粗皂苷溶于水并经大孔树脂D101柱层析，然后依次用水、体积浓度为30％的乙醇水溶液、70％乙醇的乙醇水溶液、95％乙醇的乙醇水溶液进行梯度洗脱，最后将70％乙醇洗脱液减压浓缩即可获得金龙胆草总皂苷19.3g，得率为1.9％。
抗肿瘤实验证明，实施例9制备的金龙胆草总皂苷具有较高的抗癌活性，对Hela细胞和SPC-A1细胞的生长抑制均呈时间和浓度依赖性。
结论
本发明中建立的细胞模型为宫颈癌Hela细胞和肺癌SPC-A1细胞，选择临床常用的紫杉醇和顺铂两种抗癌药物作为阳性对照，通过MTT实验确定顺铂为Hela细胞的阳性对照，紫杉醇为SPC-A1的阳性对照。通过体外细胞培养试验筛选，表明金龙胆草总皂苷具有较高的抗癌活性，对Hela细胞和SPC-A1细胞的生长抑制均呈时间和浓度依赖性，并测得其IC50值分别为15.01μg/mL和12.42μg/mL。经形态学观察初步显示有凋亡现象后，通过琼脂糖凝胶电泳方法检测DNA，结果出现了特征性DNA ladder，这说明金龙胆草总皂苷对细胞的生长抑制作用与凋亡有关。最后采用Western Blot方法检测蛋白，经半定量分析，发现金龙胆草总皂苷能够促进细胞凋亡机制中关键蛋白caspase-3的表达，说明金龙胆草总皂苷对肿瘤细胞的生长抑制是由凋亡机制调节的。
Claims (3)
1.金龙胆草总皂苷在制备抗肿瘤药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的金龙胆草总皂苷在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征是所述金龙胆草总皂苷是用下述方法制成：将金龙胆草用乙醇水溶液提取；将乙醇提取液依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取；将正丁醇萃取液减压浓缩得到粗皂苷；将粗皂苷经大孔树脂柱层析，然后用水、体积浓度为30％的乙醇水溶液、体积浓度为70％的乙醇水溶液和体积浓度为95％的乙醇水溶液梯度洗脱，将70％乙醇洗脱液减压浓缩而得到金龙胆草总皂苷。
3.根据权利要求1的所述的金龙胆草总皂苷在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征是所述肿瘤为宫颈癌或肺癌。
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