CN101548995A - 桑寄生提取物作为NF-κB抑制剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种桑寄生提取物作为NF-κB抑制剂的应用。尤其是在治疗由NF-κB因子异常激活引起白血病、实体瘤、自身免疫性疾病、肾脏疾病、心脑血管疾病、各种炎症、神经变形性疾病、眼科疾病的用途。
Description
技术领域:
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种桑寄生植物提取物对细胞核转录因子NF-κB的抑制及其作为治疗与NF-κB异常激活有关疾病药物的应用。
背景技术:
NF-κB最早是从B细胞的核抽提物中发现的一种能与免疫球蛋白κ链基因的增强子κB序列(GGGACTTTCC)特异性结合的核蛋白因子,因而称为NF-κB。此因子与κ序列的特异性结合后,促进κ轻链基因的表达。但后来越来越多的证据表明,这一因子可启动众多基因转录。调节包括细胞因子和炎症介质(如IL-2、IL-2a、IL-6、IL-8,VCAM、ICAM、E-selectin、IFN-β、MCP-1、RANTES等)在内的众多蛋白质表达,从而参与调节组织细胞的生理、病理反应。
NF-κB的异常激活与很多疾病相关,例如恶性肿瘤、白血病、自身免疫性疾病(例如类风湿关节炎、红斑狼疮)、肾脏疾病、心脑血管疾病、各种炎症、神经变形性疾病、眼科疾病发生时,其病变细胞均存在NF-κB的异常激活。因此NF-κB已成为一个重要的药物作用的研究靶点。针对NF-κB激活途径中的不同环节为靶点进行拮抗,可以治疗与之相关的疾病。寻找NF-κB抑制剂是药物研究的一项重要工作。
在白血病、实体瘤等的细胞中,NF-κB往往通过遗传学改变或信号转导异常而持续性激活。近年来的研究发现NF-κB在白血病、实体瘤等的发生发展过程中具有重要且复杂的作用。总的说来,NF-κB的异常激活可导致一系列与恶性肿瘤相关基因的异常表达,从而抑制恶性细胞凋亡、促进肿瘤新生血管形成、诱导恶性肿瘤细胞耐药等。NF-κB已成为抗肿瘤、白血病药物研究的一个重要靶点,NF-κB抑制剂的研究为白血病治疗提供了一种新的选择,将NF-κB抑制剂和传统放化疗配合应用,由于其本身即有的抗白血病活性,又可显著降低白血病细胞对化疗药物的耐药性,在白血病治疗方面有着很好的应用前景。
桑寄生是一味常用的中药,桑寄生科的同科数种植物,例如桑寄生(Taxilluschinensis)、红花桑寄生(Scurrula parasitica L.)、四川寄生(Taxillus sutchuenensisDanser)等常作为中药材桑寄生入药,具补肝肾、祛风湿、降血压、安血养胎等功效,主治风湿、关节痛、高血压、坐骨神经痛、腰痛、产后乳少等症。未见其有抑制NF-κB活性的报道。
发明内容:
本发明的目的是提供寄主为夹竹桃科植物的桑寄生提取物在制备治疗人和动物因NF-κB因子异常激活相关疾病药物中的应用;尤其是治疗白血病等与NF-κB因子异常激活相关疾病中的应用;其次要目的是该提取物还可与其它药物联用,作为增敏剂或减毒剂用于治疗白血病等与NF-κB因子异常激活相关疾病的用途。
本发明公开的技术方案是一种桑寄生提取物作为一种NF-κB抑制剂的应用。
桑寄生提取物是以下列制备方法制得,本发明选择的桑寄生是指来源于桑寄生科(Loranthaceae)梨果寄生属的红花桑寄生(Scurrula parasitica L.),也包括桑寄生(Taxillus chinensis)、四川寄生(Taxillus sutchuenensis Danser)等,其最根本的特征是其寄主是夹竹桃科植物,优选的是夹竹桃(Nernium indicum Mill)和黄花夹竹桃(Thevetia peruviana)。
药物组合物,通常本发明药物组合物含有0.1~99.9%重量的桑寄生提取物,药物组合可以根据本领域已知的方法制备。用于此目的时,如果需要,可将该桑寄生提取物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合,制成可作为人用的适当形式或剂量形式。给药途径可为肠道或非肠道,如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔黏膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型如片剂、胶囊、滴丸、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、冻干粉针剂等,可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成上述各种剂型,可以广泛使用本领域公知的各种载体。此外,如需要,也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
提取物的制备方法
(1)采摘寄主为夹竹桃科植物上的桑寄生药材洗净凉干或烘干后粉碎,用极性或非极性溶剂加热或常温提取,优选的提取溶剂为60~80%的乙醇或同样浓度的其它醇类溶剂,优选的提取温度在60~80℃范围内;提取1~10遍,优选的提取遍数为3~5遍,每遍提取时间加热提取是一般1~4小时或更长,常温提取时间一般每遍1天或更长。也可以将药材先用有机溶剂(如石油醚、苯、甲苯或乙烷等)提取,过滤,弃去滤液保留滤渣以去除色素等脂溶性物质,滤渣再用上述方法提取。
(2)滤液调整至含醇约50~70%,放4℃冰箱过夜或更长时间,以使色素和油脂析出,过滤除去色素和油脂;也可再用石油醚萃取进一步除去色素和油脂。滤液回收溶剂,浓缩得浸膏。
(3)浸膏用聚酰胺粉或硅胶粉拌成糊状,干燥去除水分后研磨成细粉,过聚酰胺柱(优选的聚酰胺颗粒大小为100~200目)纯化,用水、10%~90%的梯度醇液洗脱,收集洗脱液,回收溶剂浓缩得到浸膏,此浸膏经进一步干燥去除水分,得所需提取物。
(4)步骤(2)中浓缩时也可仅浓缩成较浓的水溶液,这时的浓缩液也可直接过聚酰胺柱纯化。
提取物中化学成分的定性分析
采用化学显色的方法对提取物中的主要化学成分进行分析,结果表明其中主要含有黄酮、强心苷和生物碱(表1,2)。
表1提取物中黄酮、强心苷检测结果
表2提取物中生物碱检测结果
附图说明:
图1.0.75μg/mL该提取物处理后不同时间白血病细胞HL-60中NF-κB活性EMSA检测结果,可明显看出随作用时间增加,NF-κB活性被逐渐抑制。
图2.免疫荧光法显示该提取物对白血病细胞HL-60中NF-κB核转移的抑制,可明显看出细胞核中的荧光强度减弱,说明细胞核中的NF-κB蛋白量减少。A:未处理细胞;B:0.75μg/mL该提取物处理24h细胞
图3.0.75μg/mL该提取物白血病细胞对HL-60中NF-κBp65蛋白表达的影响,可明显看出随作用时间增加,细胞中总的NF-κB蛋白量降低。
图4.该提取物处理对淋巴瘤细胞CA46凋亡相关蛋白表达的影响,可以明显看出该提取物作用导致CA46细胞中的促凋亡蛋白表达量增加,而抑细胞凋亡蛋白表达量减少。该提取物也使NF-κB的抑制蛋白I-κB表达量减少。A:未处理细胞;B:5.0μg/mL;C:10.0μg/mL;D:20.0μg/mL
图5.该提取物处理前后的白血病细胞HL-60AO/EB荧光染色,可明显看出该提取物诱导了HL-60细胞的凋亡。
图6.该提取物处理前后的白血病细胞HL-60TUNEL染色,可明显看出该提取物诱导了白血病细胞HL-60的凋亡。
图7.该提取物处理淋巴瘤细胞CA46 96h的DNA片段化检测结果,可明显看出该提取物诱导了淋巴瘤细胞CA46的凋亡。
A:未处理细胞;B:5.0μg/mL;C:10.0μg/mL;D:20.0μg/mL
具体实施方式:
下面结合具体实施例及生物活性实验对本发明做进一步说明:
本专利申请提取物的制备方法一
(1)采摘寄主为夹竹桃科植物上的桑寄生药材洗净凉干或烘干后粉碎,用10倍量60%~80%乙醇加热或常温提取,或同样浓度的其它醇类溶剂,提取温度在60~80℃范围内;提取遍数为3遍,每遍提取时间加热提取是一般1~4小时或更长,常温提取时间一般每遍1天或更长。也可以将药材先用有机溶剂(如石油醚、苯、甲苯或乙烷等)提取,过滤,弃去滤液保留滤渣以去除色素等脂溶性物质,滤渣再用上述方法提取。
(2)滤液调整至含醇约50~70%,放4℃冰箱过夜或更长时间,以使色素和油脂析出,过滤除去色素和油脂;也可再用石油醚萃取进一步除去色素和油脂。滤液回收溶剂,浓缩得浸膏。
(3)浸膏用聚酰胺粉或硅胶粉拌成糊状,干燥去除水分后研磨成细粉,过聚酰胺柱(优选的聚酰胺颗粒大小为100~200目),也可采用大孔树脂AB-8柱、硅胶柱、硅藻土柱等本技术领域人员熟知的材料和方法纯化该粗提物,用水、10%~90%的梯度乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,回收溶剂浓缩得到浸膏,此浸膏经进一步干燥去除水分,得所需提取物。
(4)步骤(2)中浓缩时也可仅浓缩成较浓的水溶液,这时的浓缩液也可直接过聚酰胺柱纯化。
本专利申请提取物的制备方法二
(1)采摘寄主为夹竹桃科植物上的桑寄生药材洗净凉干或烘干后粉碎,将药材先用2~3倍量的有机溶剂(如石油醚)浸泡1h,重复2次,过滤,弃去滤液保留滤渣以去除色素和油脂;
(2)用10倍量60%~80%乙醇浸泡12~24h,用30~50khz的超声波,在120v下,超声处理30min,同样操作重复3次,过滤回收提取液,浓缩得浸膏;
(3)浸膏用硅胶粉拌成糊状,干燥去除水分后研磨成细粉,采用大孔树脂AB-8柱住层析,按顺序分别用水、30%、50%、70%和90%乙醇梯度洗脱,收集洗脱液,浓缩干燥得所需提取物。
本专利申请提取物的制备方法三
(1)采摘寄主为夹竹桃科植物上的桑寄生药材洗净凉干或烘干后粉碎,将药材先用2~3倍量的有机溶剂(如石油醚)浸泡1h,重复2次,过滤,弃去滤液保留滤渣以去除色素和油脂;
(2)用10倍量60%~80%乙醇浸泡12~24h,微波照射,控制微波辐照功率为50~70W/g,辐照时间30~60秒,以乙醇溶液不沸腾为限,然后冰水浴冷却;同样操作重复3次。过滤回收提取液,浓缩得浸膏;
(3)浸膏用硅胶粉拌成糊状,干燥去除水分后研磨成细粉,采用大孔树脂AB-8柱住层析,按顺序分别用水、30%、50%、70%和90%乙醇梯度洗脱,收集洗脱液,浓缩干燥得所需提取物。
用上述方法制备的提取物,在实验上的药理和病理情况如下:
一)凝胶迟滞电泳分析(EMSA)检测NF-κB的活性
分别收集对照组和0.75μg/mL该提取物处理3、6、12和24h的HL-60细胞,每组约1×107个细胞,冷的PBS洗涤三次,采用NE-PER Nuclear and CytoplasmicExtraction Reagents试剂盒提取细胞核蛋白,按说明书操作。采用Lightshift EMSA Kit行NF-κB活性分析,按说明书操作,蛋白上样量8μg/孔。NF-κB特异性结合探针序列如下:5’--AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C--3’,生物素标记,化学发光法检测。结果(图1)可见药物处理导致细胞中NF-κB活性下降。
二)免疫荧光法检测NF-κB在细胞中的分布
分别收集对照组和0.75μg/mL该提取物处理3、6、12、24h的HL-60细胞,PBS洗涤,加入固定液固定15分钟,用NF-κB激活-核转运检测试剂盒(cy3标记二抗)检测NF-κB p65在细胞中分布的变化情况。按说明书操作,一抗4℃过两夜,荧光显微镜下观察,p65所在部位显红色荧光。结果(图2)可见药物处理导致细胞核中NF-κB p65量大为降低,细胞质中的NF-κB p65量也有所下降。
三)Western blot法检测该提取物作用后HL-60细胞中NF-κB的表达
分别收集对照组和0.75μg/mL该提取物处理24h和48h的HL-60细胞,每组约1×107个细胞,用M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent提取细胞总蛋白。不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,10%分离胶,蛋白上样量20μg/孔,电泳完成后湿法转至NC膜上,兔p65多抗4℃孵育过夜,以β-Actin为内参,化学发光法检测。结果可见药物处理导致细胞中NF-κB p65蛋白表达下降(图3)。
四)Western blot法检测该提取物作用后淋巴瘤细胞CA46细胞中凋亡相关蛋白的表达
分别取对照组与5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL该提取物处理48h的CA46细胞,提取细胞总蛋白,按上法操作检测CA46细胞中IκB、NF-κBp65、C-myc、Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP等蛋白的表达。可明显看出该提取物作用后显著下调了CA46细胞中IκB、NF-κBp65的表达,从而下调了下游抑凋亡蛋白的表达,上调了促凋亡蛋白的表达(图4),进而诱导恶性细胞的凋亡。
五)ELISA法检测该提取物对HL-60细胞分泌VEGF的影响
新生血管生成是恶性肿瘤发展和迁移的一个重要原因,肿瘤细胞通过大量分泌促内皮细胞生长因子VEGF等来促进自身组织周围血管的增生。抑制新生血管生成是抑制肿瘤生长和迁移的一条重要途径。有研究表明,抑制肿瘤细胞中NF-κB的活性可以降低其VEGF的表达。采用ELISA法检测细胞培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF)的含量。取对数生长期HL-60细胞,调整细胞密度至2.5×106/mL,培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中,分别收集对照组和0.25μg/mL、0.50μg/mL和0.75μg/mL该提取物处理12和24h的细胞培养上清液,用Endogen Human VEGF ELISA Kit检测上清液中的VEGF含量,按说明书操作,于450nm波长处测定A值。标准曲线和样品均做复孔。重复三次。该试剂盒检测的VEGF为分泌型的VEGF165及其异构体VEGF121。结果(表3)表明该提取物可减少HL-60细胞分泌VEGF,因而有一定抑制新生血管生成的作用。该提取物下调HL-60细胞中VEGF的分泌可能与其对NF-κB的抑制相关。
表3不同浓度该提取物对HL-60细胞分泌VEGF的影响(n=6,x±s)
**P<0.01,*P<0.05与对照组比较;
用上述方法制备的提取物单独或者与其它药物协同作用实验:
一)将肿瘤细胞与该提取物共培养
该提取物在较低的浓度范围内(例如1~20μg/mL)对多种肿瘤细胞(例如人急性髓系白血病细胞株HL-60、人小细胞肺癌细胞株NCI-H446、人宫颈癌细胞株Hela、人T淋巴细胞白血病Jurkat、人急性早幼粒白血病细胞株NB4、人慢性粒细胞白血病细胞株K562、人T淋巴细胞白血病细胞株Molt4、人鼻咽癌细胞株CNE和人骨髓瘤细胞株U266、人慢性粒细胞白血病原代细胞)有显著的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用(表4,图5、6、7)。
表4该提取物作用于10种人源肿瘤细胞72h的IC50值
二)该提取物增强多柔比星抗白血病效果的实验
NF-κB的异常激活除了导致一系列与肿瘤相关基因的异常表达,从而抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤血管形成和肿瘤转移外,也诱导肿瘤细胞耐药等。本实验证明了该提取物作为一种良好的NF-κB抑制剂,可以逆转白血病细胞的耐药从而增敏化疗药物的抗肿瘤效果。
高致瘤性HL-60细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中,37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养,2~3天传代一次。取对数生长期细胞用于实验,无血清培养液洗涤后调整细胞密度为1×106/mL,每只裸鼠接种0.2mL于右后肢背侧皮下。接种后第6天,瘤长到约黄豆大小时即给药治疗。裸鼠称重,测量瘤径,据瘤体大小随机分组。实验共设8组,每组动物6只,分组如下:①阴性对照组:含1%DMSO的生理盐水;②提取物(以下简称Nispex)组:Nispex 10mg/kg/d;③ADR高剂量组:多柔比星15mg/kg;④ADR高剂量+Nispex组:多柔比星15mg/kg,Nispex 10mg/kg/d;⑤ADR中剂量组:多柔比星10mg/kg;⑥ADR中剂量+Nispex组:多柔比星10mg/kg,Nispex 10mg/kg/d;⑦ADR低剂量组:多柔比星5mg/kg;⑧ADR低剂量+Nispex组:多柔比星5mg/kg,Nispex10mg/kg/d。给药方式为:多柔比星于治疗第1天尾静脉一次性给药,第2天开始每天10mg/kg Nispex腹腔注射给药,连续9d,每2d称量裸鼠体重,按0.1mL/10g体重的体积给药。结果见表5
表5Nispex与多柔比星对HL-60移植瘤的协同抑制作用
**P<0.01,*P<0.05与对照组比较;△△P<0.01,△P<0.05与ADR组比较
以上实施例表明了本发明所说的提取物可以显著诱导人类肿瘤细胞凋亡,可增敏抗肿瘤化疗药物的疗效。
实验表明了本发明药物的药理作用,用上述方法制备的寄生于夹竹桃科植物上的红花桑寄生提取物经研究发现对肿瘤细胞中异常激活的NF-κB活性有很好的抑制作用,对肿瘤细胞中的NF-κB的核转移和NF-κB蛋白表达都有良好的抑制作用。同时可以上调肿瘤细胞中NF-κB的下游促凋亡基因表达,下调抑凋亡基因的表达。是一种良好的NF-κB抑制剂。可作为治疗NF-κB因子异常激活引起动物和人的白血病、自身免疫性疾病、肾脏疾病、心脑血管疾病、各种炎症、神经变形性疾病、眼科疾病的新用途。
细胞中NF-κB因子的异常激活与很多人类疾病相关,很多病变细胞中均存在NF-κB的异常激活,但NF-κB的正常活性对人的正常生命活动又是必须的,特别对维持人的正常免疫功能来说。因此作为治疗用的NF-κB抑制剂最好能选择性地抑制病变细胞中NF-κB因子的异常激活,而不影响正常免疫细胞中NF-κB因子活性。我们的研究表明,本发明所说的提取物对来自于正常人的外周血单个核细胞(免疫细胞)中的NF-κB因子活性没有影响,因此是一种优良的NF-κB抑制剂。且桑寄生在我国分布广泛,作为药用植物使用历史悠久,无毒副作用。而目前国内外研制NF-κB抑制剂主要通过对单一结构化合物的筛选或通过基因工程的方法,对环境存在潜在的危险以及对可能存在对人体的毒副作用。
Claims (10)
1、一种桑寄生提取物在制备NF-κB抑制剂的应用。
2、根据权利要求1所述的应用,其特征是桑寄生是指桑寄生科植物,其寄主为夹竹桃科植物。
3、根据权利要求2所述的应用,其特征是夹竹桃科植物是指夹竹桃(Nerium indicumMill)和黄花夹竹桃(Thevetia peruviana)。
4、根据权利要求1或2所述的应用,其特征是桑寄生是指桑寄生科植物中的红花桑寄生植物。
5、根据权利要求4所述的应用,其特征是桑寄生提取物中,经测定,至少含有黄酮、强心苷和生物碱类成分。
6、根据权利要求1所述的应用,其特征是在治疗NF-κB因子异常激活引起人的白血病等细胞异常增殖等相关疾病的用途。
7、根据权利要求1所述的应用,其特征是在治疗NF-κB因子异常激活引起人的自身免疫性疾病、肾脏疾病、心脑血管疾病、各种炎症、神经变形性疾病、眼科疾病的用途。
8、根据权利要求1所述的桑寄生提取物的制备方法,其特征是:
(1)采摘寄主为夹竹桃科植物上的桑寄生药材洗净凉干或烘干后粉碎,用极性或非极性溶剂加热或常温提取,优选的提取溶剂为60~80%的乙醇或同样浓度的其它醇类溶剂,优选的提取温度在60~80℃范围内;提取1~10遍,优选的提取遍数为3~5遍,每遍提取时间加热提取是一般1~4小时或更长,常温提取时间一般每遍1天或更长。也可以将药材先用有机溶剂(如石油醚、苯、甲苯或乙烷等)提取,过滤,弃去滤液保留滤渣以去除色素等脂溶性物质,滤渣再用上述方法提取。
(2)滤液调整至含醇约50~70%,放4℃冰箱过夜或更长时间,以使色素和油脂析出,过滤除去色素和油脂;也可再用石油醚萃取进一步除去色素和油脂。滤液回收溶剂,浓缩得浸膏。
(3)浸膏用聚酰胺粉或硅胶粉拌成糊状,干燥去除水分后研磨成细粉,过聚酰胺柱(优选的聚酰胺颗粒大小为100~200目)纯化,用水、10%~90%的梯度醇液洗脱,收集洗脱液,回收溶剂浓缩得到浸膏,此浸膏经进一步干燥去除水分,得所需提取物。
(4)步骤(2)中浓缩时也可仅浓缩成较浓的水溶液,这时的浓缩液也可直接过聚酰胺柱纯化。
9、根据权利要求1所述的桑寄生提取物的制备方法,其特征是:
(1)采摘寄主为夹竹桃科植物上的桑寄生药材洗净凉干或烘干后粉碎,将药材先用2~3倍量的有机溶剂(如石油醚)浸泡1h,重复2次,过滤,弃去滤液保留滤渣以去除色素和油脂;
(2)用10倍量60%~80%乙醇浸泡12~24h,用30~50khz的超声波,在120v下,超声处理30min,同样操作重复3次,过滤回收提取液,浓缩得浸膏;
(3)浸膏用硅胶粉拌成糊状,干燥去除水分后研磨成细粉,采用大孔树脂AB-8柱住层析,按顺序分别用水、30%、50%、70%和90%乙醇梯度洗脱,收集洗脱液,浓缩干燥得所需提取物。
10、根据权利要求1所述的桑寄生提取物的制备方法,其特征是:
(1)采摘寄主为夹竹桃科植物上的桑寄生药材洗净凉干或烘干后粉碎,将药材先用2~3倍量的有机溶剂(如石油醚)浸泡1h,重复2次,过滤,弃去滤液保留滤渣以去除色素和油脂;
(2)用10倍量60%~80%乙醇浸泡12~24h,微波照射,控制微波辐照功率为50~70W/g,辐照时间30~60秒,以乙醇溶液不沸腾为限,然后冰水浴冷却;同样操作重复3次。过滤回收提取液,浓缩得浸膏;
(3)浸膏用硅胶粉拌成糊状,干燥去除水分后研磨成细粉,采用大孔树脂AB-8柱住层析,按顺序分别用水、30%、50%、70%和90%乙醇梯度洗脱,收集洗脱液,浓缩干燥得所需提取物。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20091007 |