CN107739360A - 小叶莲中酚类化合物graphislactoneA的制备方法及其应用 - Google Patents

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付露
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Abstract

本发明涉及小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法及其应用，可有效解决快速从小叶莲中制备酚类化合物graphislactone A和实现在制备抗乳腺癌和耐药性乳腺癌药物中的应用问题，方法是，将小叶莲粉碎，用乙酸乙酯超声提取，提取液减压浓缩至相当于含生药量1g/mL的浓缩物，所得小叶莲粗提取物上硅胶柱色谱，用石油醚‑丙酮进行梯度洗脱，收集石油醚‑丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置12‑24h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。本发明方法稳定可靠，效率高，并经活性试验表明对乳腺癌细胞MCF‑7和耐药性乳腺癌细胞MCF‑7/ADR具有细胞毒活性，有效用于制备治疗乳腺癌的药物，开拓了小叶莲的药用价值和商业价值，经济和社会效益显著。

Description

小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康和生命的常见病、多发病。现今，癌症已成为全世界首要的致死病因。乳腺癌通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，已经成为严重威胁中青年妇女健康和生命的主要疾病之一，发病率较高，多见于40-60岁之间绝经期前后的妇女，全国每年新发乳腺癌的人数约100万以上。在肿瘤治疗中，手术治疗、放疗、化疗是最传统的 3种治疗方案，其中化疗占据着不可替代的重要地位。有些肿瘤在经历了最初有效化疗后，仍难免复发，这其中一个很重要的原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生了多药耐药性。肿瘤多药耐药是肿瘤细胞免受药物攻击的重要的细胞防御机理，是指肿瘤细胞对一种化疗药物耐药的同时也对与其结构无关、作用机制不同的其它药物产生交叉耐药的现象。由于肿瘤耐药性的产生，各种新的化疗药物和新的治疗方案连续不断地推出，但效果却总是不太令人满意。在临床上，许多肿瘤的初次化疗一般可取得较好的结果，然而最终仍难免要复发，且复发后的治疗效果往往较差，其主要原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生了耐受性。据统计，癌症死亡中有90％以上存在着耐药这一现象，肿瘤耐药是当今肿瘤治疗的一大难题，尤其是多药耐药性的产生，使肿瘤患者的治愈率仍很低。目前在临床上还没有彻底治愈耐药性乳腺癌的药物。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，从中草药中寻找高效低毒的抗耐药性乳腺癌活性物质，研制选择性强、毒副作用低的抗耐药性乳腺癌药物是药学科研工作者迫切解决的首要问题。
小叶莲是小檗科桃儿七属植物鬼臼Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying.的干燥成熟果实。鬼臼是一种具有悠久历史的药用植物，古代《神农本草经》中就有记载：杀大毒，疗咳嗽喉疾，风邪烦感，失魄妄见。不入汤。以后的历代本草亦多有记载，主要用于活血散结、祛风除湿、虫蛇咬伤、跌打、心胃痛、风寒咳嗽、月经不调、铁棒锤中毒、风湿筋骨痛及气管炎等症。鬼臼分布比较广泛，我国主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、陕西。小叶莲作为传统藏药始载于《月王药诊》，具有悠久的药用历史。前期的化学成分研究表明主要含有木脂素类化合物和黄酮类化合物。经本发明研究表明，graphislactone A为首次从高等植物桃儿七属植物中分离得到的化合物。该化合物的文献研究表明其对人结肠癌细胞SW1116具有细胞毒活性，IC50值为8.5ug/ml，同时还具有抗菌、抗氧化、清除自由基、抑制乙酰胆碱酯酶等作用。此化合物是由两个苯环通过内酯键和碳-碳键连接而成，一般与其他类天然产物共存或在植物体内含量较低，其提取分离仍旧是一项具有挑战性的工作。截止目前，该化合物仅在地衣和微生物中被发现，其的提取分离主要有以下六种，①将地衣植物Graphisprunicola 的孢子共生菌采用乙醚提取，提取液经反复的制备薄层(展开剂为氯仿-甲醇9：1、乙酸乙酯-苯-乙醇4：1：0.5)。分离过程中反复的制备薄层色谱，载样量少，展开剂中含有苯，具有致癌毒性。②将地衣植物Graphis scripta var.pulverulenta的孢子共生菌采用丙酮提取4次，收集浓缩后的白色晶体和悬浮物，采用丙酮提取4次，浓缩后加水混悬，沉淀经过反复的制备薄层色谱(展开剂为氯仿-甲醇9：1、乙酸乙酯-苯-乙醇4：1：0.5、苯-丙酮3:1)分离。不仅展开剂中含有苯，而且涉及到8次提取，操作复杂。③将络石(Trachelospermumjasminoides)的内生菌Cephalosporium acremonium采用氯仿-甲醇1:1提取，提取物经过硅胶柱色谱氯仿-甲醇梯度洗脱，含有目标物的流份再经过硅胶柱色谱氯仿-甲醇梯度洗脱和 Sephadex LH-20氯仿-甲醇1:1洗脱，得到目标化合物graphislactone A。分离过程经过两次硅胶柱色谱和一次凝胶柱色谱，操作过程复杂。④将络石(Trachelospermumjasminoides)的内生菌Cephalosporium sp.采用氯仿-甲醇1:1提取，提取物减压浓缩后加少量甲醇放置于-20℃过夜，过滤除去沉淀，甲醇溶液中滴加丙酮使其与甲醇的体积比为15:85，置于-20℃以下过夜，静置后除去无机盐和多糖等沉淀。滤液经过三次硅胶柱色谱和一次凝胶柱色谱，得到目标化合物graphislactone A。分离过程经过两次低温静置沉淀除杂，三次硅胶柱色谱和一次凝胶柱色谱，操作过程复杂。⑤将内生菌Coniothyrium sp.采用乙酸乙酯提取，提取物过硅胶柱色谱和凝胶柱色谱分离，重结晶后得到化合物graphislactone A。分离过程经过一次硅胶柱色谱、一次凝胶柱色谱、重结晶，操作过程复杂。⑥内生菌Rhizopycnis vagum Nitaf22采用乙酸乙酯提取，提取物经过两次硅胶柱色谱和一次凝胶柱色谱，再经过制备高效液相色谱进行分离，后得到化合物graphislactone A。分离过称经过四次柱色谱，耗时长。那么如何从小叶莲中制备酚类化合物graphislactoneA及其在抗乳腺癌药物中的应用，至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现在技术缺陷，本发明之目的就是提供一种小叶莲中酚类化合物 graphislactone A的制备方法及其应用，可有效解决快速从小叶莲中制备酚类化合物 graphislactone A和实现在制备抗乳腺癌和耐药性乳腺癌药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，所述的酚类化合物graphislactone A分子结构式(化学结构式) 为：
其制备方法包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量5–10倍的乙酸乙酯在40–55℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL 的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上硅胶柱色谱，用体积比为100:10、100:20 的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用2–3L洗脱液，流速为3–7mLmin-1，收集石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置12-24h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
本发明方法稳定可靠，效率高，可快速从小叶莲中分离得到一个酚类化合物graphislactone A，并经活性试验表明对乳腺癌细胞MCF-7和耐药性乳腺癌细胞MCF-7/ADR具有细胞毒活性，有效用于制备治疗乳腺癌的药物，开拓了小叶莲的药用价值和商业价值，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明的分子结构式图。
具体实施方式
以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，一种小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法，包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量6–9倍的乙酸乙酯在42–54℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL 的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上硅胶柱色谱，用体积比为100:10、100:20 的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用2.2–2.9L洗脱液，流速为3.5-6mLmin-1，收集石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置15-22h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
实施例2
本发明在具体实施中，一种小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法，包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量5倍的乙酸乙酯在 40℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上80×8cm硅胶柱色谱，用体积比为100:10、 100:20的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用3L洗脱液，流速为7mLmin-1，收集石油醚 -丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置24h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
实施例3
本发明在具体实施中，一种小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法，包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量8倍的乙酸乙酯在 45℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上80×7cm硅胶柱色谱，用体积比为100:10、 100:20的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用2.8L洗脱液，流速为6mLmin-1，收集石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置20h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
实施例4
本发明在具体实施中，一种小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法，包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量6倍的乙酸乙酯在50℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上硅胶柱色谱，用体积比为100:10、100:20 的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用2.5L洗脱液，流速为5mLmin-1，收集石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置18h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
实施例5
本发明在具体实施中，一种小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法，包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量10倍的乙酸乙酯在55℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上硅胶柱色谱，用体积比为100:10、100:20 的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用2L洗脱液，流速为4mLmin-1，收集石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置15h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
本发明制备的酚类化合物graphislactone A经鉴定与文献中graphislactone A的氢谱和碳谱数据对照，基本一致，确定该化合物为graphislactone A，分子结构式见图1所示。并经试验，对乳腺癌细胞MCF-7和耐药性乳腺癌细胞MCF-7/ADR具有细胞毒活性，下调耐药性乳腺癌细胞中P-gp的表达。有关资料如下：
一、化合物的鉴定
经核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)和高分辨质谱(HR-ESI-MS)鉴定：
无色方晶(甲醇)，熔点236-237℃。在紫外灯254nm下呈暗斑，10％硫酸乙醇不显色。三氯化铁-铁氰化钾试剂显阳性，表明结构中含有酚羟基。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 303.0872[M+H]+(calcd for C16H15O6,303.0869)，确定分子式为C16H14O6，不饱和度为10。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示2个甲氧基质子信号δ3.89(3H,s)、3.90(3H,s)；1个与烯碳相连的甲基质子信号δ2.69(3H,s)；苯环上三个质子信号δ6.60(1H,d,J＝2.0Hz)、7.20(1H,d,J＝2.0Hz)、6.91(1H,s)；两个酚羟基质子信号δ11.85(1H,s)，9.20(1H,s)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)显示16个碳信号，除了两个甲氧基碳信号δ55.7、55.9和一个与烯碳相连的甲基碳信号δ24.6之外，包括12个芳香碳信号和1个内酯羰基碳信号δ164.4。由芳香质子δ7.20(1H,d,J＝2.0Hz,H-10)与δ132.2(C-10a)、98.4(C-6a)、110.4(C-10b)的HMBC相关，表明两个苯环通过碳-碳键连接。由该化合物的不饱和度为10，其中两个苯环(8个不饱和度)、1个内酯羰基(1个不饱和度)、结构中还有应存在1个环。由两个甲氧基δ3.89(3H,s)、3.90(3H,s)与δ148.1(C-3)、165.9(C-9)的HMBC相关，表明两个甲氧基分别与3位和9位碳相连。由甲基质子δ2.69(3H,s)与δ126.1(C-1)的HMBC相关，表明甲基与1位碳相连。将该化合物的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见Table 1)。与文献中 graphislactoneA的氢谱和碳谱数据对照，基本一致，确定该化合物为graphislactone A(分子结构式见图1)。
Table 1.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments.
二、本发明制备的酚类化合物graphislactone A经试验，对乳腺癌细胞MCF-7和耐药性乳腺癌细胞MCF-7/ADR具有细胞毒活性，下调耐药性乳腺癌细胞中P-gp的表达。有关实验资料如下：
1.实验材料
人乳腺癌细胞株(MCF-7)和耐药性乳腺癌细胞株(MCF-7/ADR)由中国医学科学院药物研究所提供，胎牛血清购自Gibco公司。
2.细胞培养
乳腺癌细胞MCF-7培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每1～2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。耐药性乳腺癌细胞MCF-7/ADR在含1.0μg/ml阿霉素的RPMI1640培养基中连续传代培养。实验前两周换为无阿霉素的RPMI1640培养基培养。
3.检测细胞存活和生长
采用MTT法，检测细胞存活和生长，对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL (含4000个肿瘤细胞)，置37℃、5％CO2温箱中培养。次日，给药组分别为40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM的graphislactone A稀释液，每组设五个平行孔。对照组加入与给药组等体积的培养基。置37℃、5％CO2培养箱中培养。2天后弃培养液，每孔加50μL (1mg/mL)MTT溶液(培养基配置)。37℃孵育4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 200μL 溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在检测波长490nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过SPSS 13.0软件处理得到半数抑制浓度(IC50)，重复测试3次，取平均值为最终结果。
对照组：不加graphislactone A的细胞培养组
给药组：加graphislactone A的细胞培养组
空白组：不加graphislactone A且没有细胞的溶剂组
4.Western-blot法检测graphislactone A对P-gp蛋白表达的影响
Western-blot法检测graphislactone A对P-gp蛋白表达的影响，取不同浓度的graphislactone A(1、5、10μM)作用于MCF-7/ADR细胞，24小时后收集细胞及培养基，离心后得到细胞沉淀，弃去上清，用冰PBS清洗两次，加入细胞裂解液，冰上裂解30min(每8min重悬混匀一次)，12000r离心20min，取上清，BCA法定量总蛋白，SDS-PAGE电泳蛋白样品后，转膜，蛋白封闭后，封一抗过夜，二抗两小时后曝光显影。
5.实验结果
通过MTT法采用人乳腺癌细胞(MCF-7)和耐药性乳腺癌细胞(MCF-7/ADR)对graphislactone A进行细胞毒活性测试，IC50值分别为2.38和9.35μM。
Graphislactone A有降低P-gp蛋白表达水平的趋势，如Table 2所示。说明graphislactone A 可能通过抑制P-gp蛋白表达来逆转乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的多药耐药。
Table 2Effect of graphislactone A on P-gp expression in MCF-7/ADRcells(％)
肿瘤耐药分为多药耐药和原药耐药两种类型。肿瘤多药耐药是肿瘤细胞免受药物攻击的重要的细胞防御机理，是指肿瘤细胞对一种化疗药物耐药的同时也对与其结构无关、作用机制不同的其它药物产生交叉耐药的现象。肿瘤细胞的多药耐药是多因素共同作用的结果，其中P-gp介导的多药耐药是经典的耐药途径，P-gp是一种ATP依赖性的跨膜外流泵，可将细胞内化疗药物排出细胞，使肿瘤细胞内化疗药物的蓄积浓度降低而不能有效杀死肿瘤细胞，从而导致肿瘤细胞耐药。本发明通过多次反复实验表明，确定的小叶莲中酚类化合物 graphislactone A的制备方法稳定可靠、效率高。同时发现graphislactone A对人敏感乳腺癌细胞株(MCF-7)和耐药性乳腺癌细胞(MCF-7/ADR)具有细胞毒活性，下调耐药性乳腺癌细胞 (MCF-7/ADR)中P-gp的表达，具有制备临床上抗耐药性乳腺癌药物的应用前景。本发明为小叶莲药材的深入开发和利用开拓了广阔前景，提高了药用价值和商业价值，经济和社会效益显著。

Claims (7)

1.一种小叶莲中酚类化合物graphislactone A，其特征在于，所述的酚类化合物graphislactone A分子结构式为：
其制备方法包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量5–10倍的乙酸乙酯在40–55℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上硅胶柱色谱，用体积比为100:10、100:20的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用2–3L洗脱液，流速为3–7mLmin-1，收集石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置12-24h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
2.根据权利要求1所述的小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量6–9倍的乙酸乙酯在42–54℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上硅胶柱色谱，用体积比为100:10、100:20的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用2.2–2.9L洗脱液，流速为3.5-6mLmin-1，收集石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置15-22h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
3.根据权利要求1所述的小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量5倍的乙酸乙酯在40℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上80×8cm硅胶柱色谱，用体积比为100:10、100:20的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用3L洗脱液，流速为7mLmin-1，收集石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置24h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
4.根据权利要求1所述的小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量8倍的乙酸乙酯在45℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上80×7cm硅胶柱色谱，用体积比为100:10、100:20的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用2.8L洗脱液，流速为6mLmin-1，收集石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置20h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
5.根据权利要求1所述的小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量6倍的乙酸乙酯在50℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上硅胶柱色谱，用体积比为100:10、100:20的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用2.5L洗脱液，流速为5mLmin-1，收集石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置18h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
6.根据权利要求1所述的小叶莲中酚类化合物graphislactone A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粗提取物的制备：将小叶莲粉碎过40目筛，每次用小叶莲重量10倍的乙酸乙酯在55℃下超声提取3次，每次1小时，合并3次提取液，减压浓缩至相当于含生药量1g/mL的浓缩物，成小叶莲粗提取物；
(2)硅胶柱色谱分离：将小叶莲粗提取物上硅胶柱色谱，用体积比为100:10、100:20的石油醚-丙酮进行梯度洗脱，每一梯度用2L洗脱液，流速为4mLmin-1，收集石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份；
(3)重结晶纯化：取所收集的石油醚-丙酮体积比为100:20洗脱流份，加丙酮超声溶解，过滤，滤液放置15h，产生无色方晶，即酚类化合物graphislactone A。
7.权利要求1或2-6任一项所述方法制备的酚类化合物graphislactone A在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
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