CN109464438B - 粗毛甘草素a在用于抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种粗毛甘草素A在用于抗肿瘤药物中的用途，特别是在治疗肝癌药物、肺癌药物中的用途。粗毛甘草素A（CAS:142474‑52‑0）化合物结构为式（Ⅰ）所示：粗毛甘草素A或其药学上可接受的酯、醚、盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体及前药中的任一种与其他药物配合制备抗肿瘤药物中的用途。
式（Ⅰ）。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及粗毛甘草素A在用于抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
癌症是世界严重的公共卫生问题，是严重影响居民健康的危险因素，近十年来全球范围内癌症负担呈持续增长态势， 据国际癌症研究机构公布的数据显示，每年全世界约800万人死于癌症。在我国因癌症死亡的患者占全部死因的1/4，位居死亡第一位。严重威胁我国居民健康的癌症主要有肺癌、肝癌、乳腺癌和胃癌等。由于多种因素如环境污染、人口老龄化，及不良生活方式如不健康饮食、身体活动不足、吸烟、酗酒及肥胖等广泛存在，我国癌症发病近十年来呈上升趋势。因此，对癌症的防治任务异常艰巨。
与传统化学药物相比，中药具有多靶点，毒副作用小的优势，从而引起人们的广泛关注。近年来大量临床研究证实，中药在抗肺癌方面具有一定的治疗效果，不但可以改善临床症状，还能提高生活质量，延长患者的带瘤生存期。多种中药提取物或其单体成分对肺癌细胞的生长和转移具有较好的抑制作用。甘草为豆科甘草属多年生草本植物，是药食两用的中药，以干燥根及根茎入药，具有健脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功能。文献报道，甘草富含黄酮、香豆素、萜类及其苷类化合物等，其在保肝、抗炎、抗氧化和抗癌等方面都有较强的药理活性。粗毛甘草素是甘草中的一个主要黄酮成分之一，目前暂无对其活性研究的报道。本发明首次发现粗毛甘草素A能有效抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞发生凋亡。
发明内容
本发明的目的在于提供粗毛甘草素A在用于抗肿瘤药物中的用途。
粗毛甘草素A（CAS: 142474-52-0）化合物结构为式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）
为粗毛甘草素A或其药学上可接受的酯、醚、盐、溶剂化物、立体异构体、互变异构体及前药中的任一种。
上述的粗毛甘草素A在治疗肝癌药物中的用途。
上述的粗毛甘草素A在治疗肺癌药物中的用途。
在抗肿瘤药物的制备中，以粗毛甘草素A经常规的制剂工艺，单独或与其他药物配伍制备可在临床上使用的各种不同剂型的药物，包括注射剂、片剂、胶囊、软胶囊、微囊、纳米制剂、颗粒剂、膜剂、栓剂、气雾剂等多种剂型。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明对甘草化学成分的系统分离、纯化和结构鉴定，并进行活性筛选，发现多个具有显著生物活性的化合物。粗毛甘草素A具有显著抑制肺癌细胞A549和肝癌HepG2增殖的活性，和具有诱导癌细胞凋亡的作用；提示其可以用于肿瘤的治疗。本发明为研制以粗毛甘草素A组分为物质基础的抗肿瘤药物提供了科学依据，具有重大的应用价值。
附图说明
图1为粗毛甘草素A的化学结构式。
图2为结晶紫染色法测定不同浓度粗毛甘草素A对HepG2和A4549细胞增殖的抑制率。
图3为流式细胞仪检测粗毛甘草素 A诱导HepG2细胞凋亡。
图4为Western blot检测粗毛甘草素 A对HepG2细胞中C-PARP、Caspase-8、Bid和Bax的蛋白表达的影响。
具体实施方式
以下的实例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明化合物的用途。下述实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均自常规生化试剂商店购买所得。
一种粗毛甘草素A的制备方法，包括以下步骤：
试验例1：粗毛甘草素A的制备
乌拉尔甘草药材20 kg粉碎成粗粉，经90%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，滤过，合并提取液，减压浓缩，得浸膏6.9 kg。将所得以适量水混悬后，经醋酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得醋酸乙酯萃取物760 g。将浸膏溶解于有机溶剂后，80目硅胶拌样，经常压硅胶柱色谱分离，使用二氯甲烷-甲醇等进行梯度洗脱，经薄层色谱检测后合并洗脱液得到5个部分。其中第3部分经MCI柱层析脱色后，再进行硅胶柱色谱反复分离，得到粗毛甘草素A（结构式见图1）。
粗毛甘草素A波谱数据见参考文献：Zeng L, Fikau T, Nomura T, et al. Fournew prenylated flavonoids, glyasperins A, B, C, and D from the roots ofGlycyrrhiza aspera [J]. Heterocycles, 1992, 34(3): 575-587. 王青, 苗文娟, 向诚, 等. 乌拉尔甘草中黄酮类化学成分的研究 [J]. 中草药, 2014, 45(1): 31-36.
试验例2：粗毛甘草素A对HepG2细胞、A549细胞的抑制作用
HepG2细胞培养于含10% FBS的DMEM培养基中，A549细胞培养于含10% FBS的RPMI1640培养基中，37℃、5%二氧化碳培养，贴壁生长。将细胞接种于6孔培养板中，经过12~24 h后，待细胞融合度达到约50%时可进行药物处理。将粗毛甘草素A或者其他药物稀释于新鲜培养基中，用新鲜培养基替代原先培养基继续进行培养至实验设计时间。去除培养基，每孔加入2 mL 1%的戊二醛溶液，室温下固定15 min。去除戊二醛，PBS润洗两次后每孔加入2 mL 0.02%的结晶紫溶液染色30 min，蒸馏水冲洗去掉残留的结晶紫，每孔加8 mL 75%的乙醇，置于脱色摇床上摇动至细胞中结晶紫全部溶出，最后用酶标仪在590 nm波长下测定吸光值，不含细胞的孔作为空白对照，以对照组细胞存活率为100%。
HepG2细胞和A549细胞对粗毛甘草素A都比较敏感，粗毛甘草素A对癌细胞的生长抑制作用具有浓度依赖性，随着粗毛甘草素A的浓度增加，癌细胞的存活率明显下降（见图2所示）。
试验例3：粗毛甘草素A诱导HepG2细胞凋亡
HepG2细胞培养于含10% FBS的DMEM培养基中， 37℃、5%二氧化碳培养，贴壁生长。将细胞接种于6孔培养板中，经过12~24 h后，待细胞融合度达到约50%时可进行药物处理。将粗毛甘草素A稀释于新鲜培养基中，用新鲜培养基替代原来的培养基继续进行培养至实验设计时间。
消化贴壁细胞并和悬浮细胞共同收集于离心管中，4 ℃下1000 × g 离心5 min，去除培养基，PBS润洗细胞并在相同条件下再次离心，去除PBS获得细胞。每个样品各加入85μL 固定液、10 μL PI和5 μL AnnexinV-FITC，室温下孵育15 min后再加入固定液400 μL，1h内采用流式细胞仪FL1和FL2通道进行检测。直方图中十字象限左下角为Annexin V-PI双阴性细胞，代表正常细胞，右下角为Annexin V单阳性细胞，代表凋亡早期细胞，右上角为Annexin V-PI双阳性细胞，代表凋亡晚期细胞，左上角为PI单阳性细胞，代表坏死细胞（见图3）。
试验例4：粗毛甘草素A通过上调C-parp作用于内源性凋亡通路
HepG2细胞培养于含10% FBS的DMEM培养基中， 37℃、5%二氧化碳培养，贴壁生长。将细胞接种于6孔培养板中，经过12~24 h后，待细胞融合度达到约50%时可进行药物处理。将粗毛甘草素A稀释于新鲜培养基中，用新鲜培养基替代原来的培养基继续进行培养至实验设计时间。
收集贴壁及悬浮细胞，加入适量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），于冰上裂解15~30min后超声破碎，15000 rpm转速、4℃下离心30 min。离心后的样品取上清测BCA法测总蛋白浓度。用裂解液调整各样品的总蛋白浓度至相同，并按比例加入上样缓冲液，混匀后沸水浴中加热5~10 min变性处理。
根据要检测的蛋白的分子量选取分离胶的浓度，配置分离胶和积成胶，加入蛋白样品和蛋白Marker进行电泳。样品在积成胶中于80 V的电压下进行电泳，待样品进入分离胶中后，电压调整至100 V直至溴酚蓝指示剂前端至分离胶底端，终止电泳。采用湿转的方法将分离胶上蛋白样品电转至PVDF膜上，于100 V下转膜120 min或者30V下转膜过夜，转膜时要保持在低温环境下进行。
转膜完成后，用含5%~10%的脱脂奶粉的PBS在室温下封闭PVDF膜1 h。封闭完成后用目标蛋白的抗体孵育1~2 h（或者在4 ℃下封闭过夜），一抗孵育结束后用PBS润洗PVDF膜3次，每次5 min，然后用二抗孵育1~2 h，用PBS润洗3次，每次10 min。在暗室中，ECL发光显色，X光片进行曝光、显影、定影即可在X光片上出现条带印迹，条带丰度即为样品中相应蛋白表达的水平高低。
通过Western blot检测细胞凋亡通路相关分子的表达水平（见图4）。与对照相比较，10 μM的粗毛甘草素A处理HepG2细胞24 h后，粗毛甘草素A可以显著增加C-PARP的表达（p＜0.05）；在粗毛甘草素A浓度达到20 μM时，C-PARP的表达增加更为显著（p＜0.01）。而Caspase8、Bid和Bax等蛋白的表达无明显变化（p＞0.05）。
综上所述，粗毛甘草素A具有显著抗肿瘤作用，具有良好的开发应用前景。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (1)
1.粗毛甘草素A在用于制备治疗肺癌药物中的用途，
粗毛甘草素A化合物结构为式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）
所述肺癌细胞为A549细胞；
所述粗毛甘草素A的制备方法如下：
1）乌拉尔甘草药材20kg粉碎成粗粉，经90%乙醇加热回流提取3次，每次2h，滤过，合并提取液，减压浓缩，得浸膏6.9kg；
2）将上述所得浸膏以适量水混悬后，经醋酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得醋酸乙酯萃取物760g；
3）将上述醋酸乙酯萃取物，80目硅胶拌样，经常压硅胶柱色谱分离，使用二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，经薄层色谱检测后合并洗脱液得到5个部分；其中第3部分经MCI柱层析脱色后，再进行硅胶柱色谱反复分离，得到粗毛甘草素A。
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