CN111617165A - 一种三叶青的粗提物在抑制胰腺癌方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种三叶青的粗提物在制备抑制胰腺癌的化疗药物中的应用。本发明还公开了一种用于抑制胰腺癌的药物，所述药物包括四种组分：组分‑1(10％(1‑2)EtOH提取物)、组分‑2(10％(‑3)‑30％(1‑2)EtOH提取物)、组分‑3(30％(‑1)‑50％(‑1)EtOH提取物)、组分‑4(50％(‑2)‑95％(‑2)EtOH提取物)中的一种或多种。本发明还公开一种三叶青的粗提物在抑制胰腺癌方面的应用，包括以下过程：在96孔板中分别种入四种PDAC细胞；细胞贴壁，分别加入三叶青粗提物的四种组分；荧光显微镜下拍照；用CCK‑8测定细胞存活率。本发明另外还提供一种三叶青粗提物的获取方法，本发明的三叶青的应用为胰腺癌的化疗药物、治疗药物提供了新的治疗靶点。

Description

一种三叶青的粗提物在抑制胰腺癌方面的应用
技术领域
本发明属于药物制备领域，具体涉及一种三叶青的粗提物在制备抑制胰腺癌的化疗药物中的应用、一种用于抑制胰腺癌的药物、一种三叶青的粗提物在抑制胰腺癌方面的应用及一种三叶青粗提物的获取方法。
背景技术
胰腺癌是恶性度极高的实体肿瘤之一。近年来，胰腺癌的发病在全世界范围内均呈现逐年升高的趋势。其中95％的胰腺癌为胰腺导管细胞癌(pancreatic ductaladenocarcinoma，PDAC)。PDAC具有高侵袭转移的特性，早期缺乏明显的临床症状和体征，约60％的患者在确诊时已经出现了远处转移，25％的患者处于晚期，无法进行根治性切除手术，而根治术后早期的转移和复发也是导致其预后不良的重要原因。在美国，PDAC的五年生存率为8％左右，而英国只有3％，故PDAC可以被认为是一种致死性的癌症。由于胰腺癌早期诊断困难，手术切除率低，放化疗联合的多学科治疗是目前临床上治疗胰腺癌的主要手段。随着吉西他滨等化疗药物的研发和应用，如吉西他滨联合卡培他滨的辅助化疗方案是欧美胰腺癌切除术后的标准治疗，但是化疗药物的不良反应、低应答率及其在亚洲人群的治疗效果仍在进一步研究中，需要新的循证医学证据。因此，寻找新的胰腺癌的化疗药物治疗靶点具有重要意义。
发明内容
本发明是提供一种三叶青的粗提物在制备抑制胰腺癌的化疗药物中的应用、一种用于抑制胰腺癌的药物、一种三叶青的粗提物在抑制胰腺癌方面的应用及一种三叶青粗提物的获取方法，以解决背景技术中所提出的问题。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种三叶青的粗提物在制备抑制胰腺癌的化疗药物中的应用。
进一步的，所述粗提物包括三叶青的粗提物四种组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)中的一种或多种。
本发明的实施例还提供一种用于抑制胰腺癌的药物，其特征在于，所述药物包括三叶青的粗提物四种组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)中的一种或多种。
进一步的，所述药物还包括所述药物中还包括一种或多种药学上可接受的载体。
其中，所述载体包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂、表面活性剂和增效剂。
本发明的实施例还提出一种三叶青的粗提物在抑制胰腺癌方面的应用，其特征在于，包括以下过程：
(1)在96孔板中分别种入四种PDAC细胞，每孔5×103个细胞；
(2)24小时后细胞贴壁，分别加入三叶青粗提物的四种组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)，设置浓度梯度为0、100、250mg/L；
(3)三叶青粗提物诱导PDAC细胞死亡：用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定在规定浓度下处理后的细胞存活率；
(4)将野生型PDAC细胞接种到96孔板中，每孔培养基200μl，每孔接种细胞数量为5×103。孵育24小时后，用DMSO及组分50％-2～95％-2分别处理细胞。继续孵育48小时后，每孔加入PI，PI浓度为0.05mg/ml。置入37℃二氧化碳培养箱中继续孵育15分钟后，用荧光显微镜观察并拍照。
本发明的实施例另外还一种三叶青粗提物的获取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、取三叶青根茎药材粉末155g，加入70％乙醇进行回流提取3次，回流温度为80摄氏度，每次提取1.5h；
S2、将步骤S1中每次提取后溶液采用5μm滤膜过滤，分离得到提取液和滤渣，将提取液合并，滤液50℃浓缩干燥，获得固体粗提物；
S3、柱层析分部位
S3-1、大孔吸附树脂：取HP-20树脂600ml，用95％乙醇浸泡过夜；混悬后，装玻璃层析柱；先用1.8L95％乙醇洗脱，然后用水平衡；
S3-2、取步骤S2的固体粗提物13.5g，用120mL左右的10％乙醇溶解，上HP-20层析柱；上样流速为600ml/h，然后依次采用10％，30％，50％和95％乙醇洗脱，各洗脱3个柱体积，流速1.8L/h，在线监测；
S3-3、根据在线监测谱图，将HPLC谱图接近的部位合并，具体合并方式如下：
S4、将步骤S3所获得的各合并部位分别浓缩干燥，得到三叶青的粗提物四种组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明的三青叶粗提物的获取方法，采用70％乙醇提取三叶青粉末，提取率为9.09％；通过HP-20分段后，获得四个部位，各部位在液相色谱图中差异比较明显，得到了很好的分离。本发明的实施例中通过三叶青的粗提物在抑制胰腺癌方面的实验验证了一种三叶青的粗提物能够抑制胰腺癌，为制备抑制胰腺癌的化疗药物、用于抑制胰腺癌的药物为胰腺癌的化疗药物、治疗药物提供了新的治疗靶点。
附图说明
图1为本发明的四种组分处理PDAC细胞系后的存活率；
图2为三叶青粗提物(组分-4)处理PDAC细胞系后进行光学显微镜显像图；
图3为三叶青粗提物(组分-4)处理PDAC细胞系后进行PI染色，所得的荧光显微镜显像图。
图4为本发明所提取的三叶青粗提物组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)的HPLC图谱。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例1
一种三叶青粗提物的获取方法，具体包括以下步骤：
S1、取三叶青根茎药材粉末155g，加入70％乙醇进行回流提取3次，回流温度为80摄氏度，每次提取1.5h；
S2、将步骤S1中每次提取后溶液采用5μm滤膜过滤，分离得到提取液和滤渣，将提取液合并，滤液50℃浓缩干燥，获得固体粗提物，固体粗提物的重量为14.17g；
S3、柱层析分部位
S3-1、大孔吸附树脂：取HP-20树脂600ml，用95％乙醇浸泡过夜；混悬后，装玻璃层析柱；先用1.8L95％乙醇洗脱，然后用水平衡；
S3-2、取步骤S2的固体粗提物13.5g，用120mL左右的10％乙醇溶解，上HP-20层析柱；上样流速为600ml/h，然后依次采用10％，30％，50％和95％乙醇洗脱，各洗脱3个柱体积，流速1.8L/h，在线监测；
S3-3、根据在线监测谱图，将HPLC谱图接近的部位合并，具体合并方式如下：
Figure BDA0002581829350000041
HPLC谱图如图4所示。
S4、将步骤S3所获得的各合并部位分别浓缩干燥，得到三叶青的粗提物四种组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)。
本发明中的HPLC条件：
仪器：安捷伦1290DAD
色谱柱：ZORBAX XDB-C18
流速：0.8mL/min
柱温：30℃
波长：254nm(全波长)
流动相：甲醇-水
HPLC洗脱梯度：
TIME/min 水 甲醇
0 95 5
3 95 5
20 10 90
21 10 90
21.5 95 5
25 95 5
在本发明中的柱层析分离结果如表2所示。
表2柱层析分离结果
Figure BDA0002581829350000051
本发明的三青叶的提取方法，采用70％乙醇提取三叶青粉末，获得14.17g粗提物，提取率为9.09％。通过HP-20分段后，获得四个部位，各部位在液相色谱图中差异比较明显，得到了很好的分离。在本发明中的HPLC谱图(中间部位分离度不高，HPLC分析方法需要进行特定优化。
实施例2
采用实施例1所获得的三叶青粗提物诱导胰腺导管腺癌(PDAC)细胞死亡，具体包括以下步骤：(1)在96孔板中分别种入四种PDAC细胞，每孔5×103个细胞；(2)24小时后细胞贴壁，分别加入三叶青粗提物的四种组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)，设置浓度梯度为0、100、250mg/L；(3)48小时后每孔加入0.05mg/ml的PI染料10ul，每孔培养基为200ul体系，用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定在规定浓度下处理后的细胞存活率。
富集并分离后，分为四个组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)；用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定在规定浓度下处理后的细胞存活率。
结果如图1所示，在规定浓度下，四种组分处理后PDAC细胞系存活率。可见，经过三叶青EtOH提取物处理48小时后，可不同程度地抑制PANC-1、BxPC-3和CFPAC-1的生长，组分-3及组分-4对于PDAC细胞系的抑制效果较组分-1及组分-2为好，其中BxPC-3对于三叶青EtOH提取物最为敏感，抑制效果最为明显：四种组分分别处理PANC-1，在100μg/ml浓度下的抑制率分别是：1.38％±8.97％(t＝0.1536，P＝0.8853)、0、0、3.14％±3.2％(t＝0.9796，P＝0.3827)；在250μg/ml浓度下的抑制率分别是：0、0、32.75％±7.849％(t＝4.173，P＝0.0140)、21.41％±8.856％(t＝2.417，P＝0.0730)；四种组分分别处理BxPC-3，在100μg/ml浓度下的抑制率分别是：22.21％±5.43％(t＝4.09，P＝0.0150)、34.69％±9.89％(t＝3.508，P＝0.0247)、47.92％±11.71％(t＝4.09，P＝0.0150)、55.39％±22.8％(t＝2.43，P＝0.0720)；在250μg/ml浓度下的抑制率分别是：19.47％±6.30％(t＝3.089，P＝0.0366)、64.95％±％(t＝10.42，P＝0.0005)、89.22％±9.14％(t＝9.763，P＝0.0006)、80.76％±21.02％(t＝3.842，P＝0.0184)；四种组分分别处理CFPAC-1，在100μg/ml浓度下的抑制率分别是：0、23.69％±8.66％(t＝2.735，P＝0.0522)、18.14％±9.38％(t＝1.935，P＝0.1251)、35.39％±7.70％(t＝4.594，P＝0.0101)；在250μg/ml浓度下的抑制率分别是：9.41％±8.09％(t＝1.162，P＝0.3097)、26.55％±6.46％(t＝4.112，P＝0.0147)、34.49％±8.21％(t＝4.203，P＝0.0137)、48.26％±2.70％(t＝17.89，P＜0.0001)。
如图2所示，在规定浓度下，三叶青乙醇提取物处理胰腺癌细胞系48h后的光学显微镜图像所示，BxPC-3、CFPAC-1和PANC-1细胞对三叶青乙醇提取物的部分组分(组分-4)极为敏感；
如图3所示，碘化丙啶(PI)染料只进入死亡细胞而不进入活细胞，PI染色后发现与形态学变化一致，显示BxPC-3、CFPAC-1和PANC-1经过三叶青乙醇提取物的部分组分(组分-4)处理48h后细胞死亡。PI染色用于评估细胞凋亡情况。将野生型PDAC细胞接种到96孔板中，在含有5％CO 2的37℃二氧化碳培养箱中培养，每孔培养基200μl，每孔接种细胞数量为5×103。孵育24小时后，用DMSO及组分-4分别处理细胞。继续孵育48小时后，每孔加入PI，PI浓度为0.05mg/ml。置入37℃二氧化碳培养箱中继续孵育15分钟后，用荧光显微镜观察。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种三叶青的粗提物在制备抑制胰腺癌的化疗药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种三叶青的粗提物在制备抑制胰腺癌的化疗药物中的应用，其特征在于，所述粗提物包括三叶青的粗提物四种组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)中的一种或多种。
3.一种用于抑制胰腺癌的药物，其特征在于，所述药物包括三叶青的粗提物四种组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种三叶青的粗提物在制备抑制胰腺癌的化疗药物中的应用，其特征在于，所述药物还包括所述药物中还包括一种或多种药学上可接受的载体。
5.根据权利要求3所述的一种三叶青的粗提物在制备抑制胰腺癌的化疗药物中的应用，其特征在于，所述载体包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂、表面活性剂和增效剂。
6.一种三叶青的粗提物在抑制胰腺癌方面的应用，其特征在于，包括以下过程：
(1)在96孔板中分别种入四种PDAC细胞，每孔5×103个细胞；
(2)24小时后细胞贴壁，分别加入三叶青粗提物的四种组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)，设置浓度梯度为0、100、250mg/L；
(3)48小时后每孔加入1mM的PI染料10ul，每孔培养基为200ul体系，15分钟后荧光显微镜下拍照；
(4)三叶青粗提物诱导PDAC细胞死亡：用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定在规定浓度下处理后的细胞存活率。
7.一种三叶青的粗提物的获取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、取三叶青根茎药材粉末155g，加入70％乙醇进行回流提取3次，回流温度为80摄氏度，每次提取1.5h；
S2、将步骤S1中每次提取后溶液采用5μm滤膜过滤，分离得到提取液和滤渣，将提取液合并，滤液50℃浓缩干燥，获得固体粗提物；
S3、柱层析分部位
S3-1、大孔吸附树脂：取HP-20树脂600ml，用95％乙醇浸泡过夜；混悬后，装玻璃层析柱；先用1.8L95％乙醇洗脱，然后用水平衡；
S3-2、取步骤S2的固体粗提物13.5g，用120mL左右的10％乙醇溶解，上HP-20层析柱；上样流速为600ml/h，然后依次采用10％，30％，50％和95％乙醇洗脱，各洗脱3个柱体积，流速1.8L/h，在线监测；
S3-3、根据在线监测谱图，将HPLC谱图接近的部位合并，具体合并方式如下：
Figure FDA0002581829340000021
S4、将步骤S3所获得的各合并部位分别浓缩干燥，得到三叶青的粗提物四种组分：组分-1(10％(1-2)EtOH提取物)、组分-2(10％(-3)-30％(1-2)EtOH提取物)、组分-3(30％(-1)-50％(-1)EtOH提取物)、组分-4(50％(-2)-95％(-2)EtOH提取物)。
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