CN111170981B - 一种从山竹中提取的藤黄提取物、制备方法及其应用 - Google Patents

一种从山竹中提取的藤黄提取物、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从山竹中提取的藤黄提取物、制备方法及其应用,属于医药技术领域,所述制备方法为将山竹果皮进行预处理；加入乙醇浸提预处理的山竹果皮，得到浸提液；浓缩浸提液，得到乙醇浸膏；层析分离，得到层析液；浓缩所述层析液，即得所述抗癌药物。本发明将山竹果皮提取物用于制备治疗胶质瘤的药物，以此为胶质瘤的治疗提供了参考，并开发出更为有效的药物提取方法，得到了治疗效果显著的山竹提取物。

Description

一种从山竹中提取的藤黄提取物、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种从山竹中提取的藤黄提取物、制备方法及其应用。
背景技术
山竹，原名莽吉柿，又名山竺、山竹子、倒捻子、凤果，为藤黄科藤黄属植物，山竹的外果皮中含有大量的多酚类物质，包括氧杂蒽酮、单宁酸和呫吨酮类化合物等。现已发现山竹果皮提取物具有抗癌、抗氧化、抗炎、酶活性抑制作用，在众多研究中已证实在体外对不同肿瘤细胞的生长抑制作用尤为显著。
但是目前对于用山竹果皮提取物应用于胶质瘤治疗的研究还未有报道。在中国脑及中枢神经系统恶性肿瘤病死率为3.87/10万，其中胶质瘤占中枢神经系统(CNS)恶性肿瘤81％，其严重危害人的健康，无法通过手术、放射治疗、化疗等方法临床治愈。因此，提供一种用于治疗胶质瘤的山竹果皮提取物尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种结构清晰，抗癌机制明确的从山竹中提取的藤黄提取物、制备方法及其应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种从山竹中提取的藤黄提取物，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002376610460000021
本发明还提供一种所述的从山竹中提取的藤黄提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)山竹果皮预处理；
(2)加入乙醇浸提预处理的山竹果皮，得到浸提液；
(3)浓缩浸提液，得到乙醇浸膏；
(4)层析分离，得到层析液；
(5)浓缩步骤(4)所述层析液，即得所述抗癌药物。
作为本发明的进一步改进，步骤(1)中所述山竹果皮预处理过程为将新鲜无病变果皮经过风干得到干燥果皮，然后将干燥果皮打磨至粉末状。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)所用乙醇为体积分数为95％的含水乙醇，山竹果皮与乙醇的料液比为1:4(kg：L)。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中用乙醇浸提3-5次，每次浸提12-18天，浸提温度为70-90℃。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中用乙醇浸提3次，每次浸提15天，浸提温度为80℃。
作为本发明的进一步改进，步骤(3)中收集步骤(2)浸提后的上清液，旋蒸得到提取物浸膏。
作为本发明的进一步改进，步骤(3)中用水和氯仿萃取浸膏，收集氯仿层，水层共萃取3次，将氯仿层合并，旋干，得纯化后的浸膏。
作为本发明的进一步改进，步骤(4)所述层析分离采用Dr.Flash快速层析系统，以MCI CHP20P大孔树脂作为固相吸附物质，使用石油醚/乙酸乙酯除去α倒捻子素得到前段提取物。
作为本发明的进一步改进，步骤(4)中得到前段提取物后，利用离子色谱反相RP柱分离提取物单体。
本发明还提供所述的从山竹中提取的藤黄提取物在制备抗癌药物中的应用。
作为本发明的进一步改进，步骤(3)和步骤(4)优选减压浓缩。
作为本发明的进一步改进，所述癌症包括胶质瘤。
作为本发明的进一步改进，所述抗癌药物的使用方式为静脉滴注。
作为本发明的进一步改进，所述抗癌药物的使用剂量为2ng/L。
本发明公开了以下技术效果：
本发明将山竹果皮提取物用于制备治疗胶质瘤的药物，以此为胶质瘤的治疗提供了参考，并开发出更为有效的药物提取方法，得到了治疗效果显著的山竹提取物单体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为藤黄提取物HPLC结果图，其中图1a为总提取物HPLC图谱，图1b为主要单体化合物式Ⅰ的HPLC图谱；
图2为实施例1制备的藤黄提取物对大鼠胶质瘤细胞C6细胞增殖作用图；
图3为实施例1制备的藤黄提取物对大鼠胶质瘤细胞C6细胞活性氧水平的影响；
图4为实施例1制备的藤黄提取物对大鼠胶质瘤细胞C6细胞线粒体膜电位的影响；
图5为实施例1制备的藤黄提取物对大鼠胶质瘤细胞C6细胞代谢水平的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例提供一种从山竹中提取的藤黄提取物，所述藤黄提取物的结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002376610460000051
本发明实施例所述从山竹中提取的藤黄提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)山竹果皮预处理：选用山竹果皮为新鲜无病变果皮经过自然风干所得干燥果皮，用粉碎机打磨至粉末状。
(2)加入乙醇浸提：用体积分数为95％含水乙醇浸提，山竹果皮粉末与乙醇的料液比为1kg：4L。山竹果皮粉末用95％乙醇浸提3次，每次15天，浸提时浸提装置温度设置为80℃。
(3)浓缩：将所述3次浸提所得到的提取液混合，采用减压浓缩方法，得到乙醇浸膏。
(4)层析分离：所述层析分离采用Dr.Flash快速层析系统，以MCI CHP20P大孔树脂作为固相吸附物质。石油醚：乙酸乙酯＝5：1洗脱2.5个柱体积，换石油醚：乙酸乙酯＝3：1洗脱至α-倒捻子素全部分出，再用纯甲醇冲柱，得到前段提取物。再使用石油醚乙酸乙酯梯度洗脱，初始石油醚：乙酸乙酯＝8：1，洗脱约3个柱体积，石油醚：乙酸乙酯＝5：1，洗脱至无点，甲醇冲柱，得到山竹提取物。使用离子色谱反相RP柱，柱体积约240ml，取山竹提取物，用2.5倍重量的RP粉末湿法拌样，流动性选用甲醇：水＝7：3至100％甲醇梯度洗脱(70％、80％、90％、100％甲醇)，合并相同单体组分。
(5)浓缩：将所述层析分离所得到的各种层析液采用减压浓缩进行浓缩。
(6)采用核磁共振波谱法进行结构鉴定。
实施例1单体化合物的制备及结构鉴定
(1)藤黄提取物的制备
将2.0kg山竹果壳粉碎，95％乙醇常温浸泡提取三次，每次15天，减压蒸馏得到847g醇提物，将浓缩的醇提物用1L水溶解，再用相同体积的氯仿萃取三次，减压蒸馏得到氯仿浸膏159g。氯仿浸膏经硅胶柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯＝10:1→1:1梯度洗脱，得三个洗脱部位Fr.1→Fr.3。Fr.3经ODS C-18柱层析纯化，以甲醇/水＝85:15→95:5梯度洗脱，得藤黄提取物(13.4mg)，藤黄提取物的结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002376610460000071
(2)藤黄提取物的结构鉴定
综合运用现代波谱学方法(主要包括核磁共振与质谱法)，结合文献数据比对鉴定化合物结构(参考文献：Molecules,2013,18,10599-10608.)。测试结果见表1。
通过制备高效液相色谱法(HPLC)从藤黄中分离得到藤黄提取物，其HPLC结果如图1所示，图1a为总提取物HPLC图谱，图1b为主要单体化合物式Ⅰ的HPLC图谱。
表1藤黄提取物的核磁共振数据(氘代氯仿，氢谱和碳谱分别在600MHz和150MHz测定)
Figure BDA0002376610460000072
Figure BDA0002376610460000081
实施例2实施例1制备的藤黄提取物对C6细胞增殖的作用
实验方法：采用MTS法测定细胞存活率。将C6细胞以8×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中，然后用浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10和20ng/L的实施例1制备的藤黄提取物处理24小时(每个浓度设置3个平行组)，然后按照1:5的比例加入MTS，于37℃孵育2小时后，测定490nm波长下的吸光度。
实验结果：如图2所示，与空白组相比，用不同浓度所述实施例1制备的藤黄提取物处理24小时的实验组中，C6细胞的增殖均显著减少，对胶质瘤细胞表现出了剂量依赖型的抑制作用，IC50为2.13ng/L。实施例1制备的藤黄提取物组与对照组比具有显著性差异(P<0.05)。
图2中数据以对照细胞的百分比表示为平均值±SD，实验重复至少三次；统计学有显著差异(*p<0.05)。
实施例3实施例1制备的藤黄提取物对C6细胞活性氧水平的影响
实验方法：将处于对数生长期的C6细胞接种到12孔培养板中，孵育24小时，随后以不同浓度(12ng/L和2ng/L)所述单体化合物处理；处理后24小时加入1：5×103无血清培养液稀释的DCFH-DA 450μl，37℃细胞培养箱内避光孵育20min，无血清培养液洗涤3次，用荧光共聚焦显微镜观察。收集细胞，无血清培养基洗涤细胞后，进行流式细胞术分析。
实验结果：如图3所示，藤黄提取物能够诱导C6细胞氧化损伤。分别以浓度为1ng/L和2ng/L所述实施例1制备的藤黄提取物处理后，实施例1制备的藤黄提取物组与对照组相比，C6细胞中活性氧表达水平显著提高。
实施例4实施例1制备的藤黄提取物对C6细胞线粒体损伤的影响
实验方法：将处于对数生长期的C6细胞接种到12孔培养板中，孵育24小时，随后以不同浓度(1和2ng/L)所述实施例1制备的藤黄提取物处理；处理后24小时加入JC-1工作液(JC-1染料：染色缓冲液为1：200)，37℃细胞培养箱内避光孵育20min，无血清培养液洗涤3次，收集细胞进行流式细胞术分析。
实验结果：如图4所示,实施例1制备的藤黄提取物能够诱导C6细胞线粒体氧化损伤。分别以1ng/L和2ng/L所述实施例1制备的藤黄提取物处理后，实施例1制备的藤黄提取物组与对照组相比，C6细胞中绿色荧光(DCFH-DA)显著增高，红色荧光(Mito-SOX)显著下降。
实施例5实施例1制备的藤黄提取物对C6细胞代谢的影响
实验方法：将处于对数生长期的C6细胞接种到12孔培养板中，孵育24小时，随后以不同浓度(1和2ng/L)实施例1制备的藤黄提取物处理；处理后24小时收集上清液，进行葡萄糖测定；使用ATP裂解液收集细胞后进行细胞的ATP、乳糖和丙酮酸的检测。
实验结果：如图5所示,实施例1制备的藤黄提取物能够抑制C6细胞的整体代谢水平。以2ng/L实施例1制备的藤黄提取物处理后，实施例1制备的藤黄提取物组与对照组相比，C6细胞葡萄糖的消耗水平显著降低，丙酮酸的产生无显著差异，乳酸的产生显著降低，ATP的产生显著降低。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种从山竹中提取的藤黄提取物在制备抗胶质瘤药物中的应用，其特征在于，所述胶质瘤为胶质瘤C6细胞，对所述胶质瘤C6细胞的IC50为2.13ng/L，所述藤黄提取物的结构式如式Ⅰ所示：
Figure FDF0000016296350000011
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