CN101904880A - 山竹总氧杂蒽酮类提取物及其在制备tr3受体诱导剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山竹总氧杂蒽酮提取物及其制备方法以及作为制备TR3受体诱导剂的用途，属于医药品和食品领域。所述山竹总氧杂蒽酮提取物作为TR3受体诱导剂应用于制备预防或治疗癌症、肝炎或动脉粥样硬化的食品或药物。所述TR3受体诱导剂和药学上可接受的载体混合制成散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、滴丸剂、肠溶剂、注射剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、酊剂、膏剂或喷雾剂。本发明基于机理：TR3可能是筛选抗肿瘤及心脑血管药物的一个理想的分子靶点，发现并发展具有选择性调控TR3表达途径的化合物或有此先进治疗特点的药物组合具有现实的意义。

Description

山竹总氧杂蒽酮类提取物及其在制备TR3受体诱导剂中的用途

技术领域

本发明属于医药品和食品领域，特别涉及一种山竹总氧杂蒽酮提取物及其制备方法以及在制备TR3受体诱导剂中的用途。

背景技术

山竹(Garcinia mangostana L.)又称莽吉柿、罗汉果、倒捻子、凤果，其幽香气爽，滑润而不腻滞，与榴莲齐名，号称“果中皇后”。原产于马来西亚群岛，中国南方大部分地区已有引种。其主要成分是以α-倒捻子素、β-倒捻子素和γ-倒捻子素为代表的氧杂蒽酮类(xanthones)化合物(Journal ofNatural Products，1997，60：519-524，Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2006，54，301-305)。在东南亚，山竹果皮作为传统药物用于治疗皮肤感染、创伤和腹泻已有多年历史。山竹的药用价值已引起各国科学家的关注：Nakatani K等研究表明，莽吉柿果皮中含有的倒捻子素有抑制环氧化酶活性的作用(Biochemical pharmacology，2002，63(1)：73-79)；Chanarat P等发现山竹中的多糖能激发吞噬细胞的吞噬功能(Journal of the Medical Associationof Thailand，1997，80(1)：149-154)；Iinuma M等研究表明山竹中的黄酮衍生物对敏感性金黄色葡萄球菌及耐药金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用，为山竹果皮治疗感染提供了科学依据(Journal of Pharmacy and Pharmacology，1996，48(8)：861-865)；Chen S-X等研究发现山竹提取物具有抗HIV-1蛋白酶的活性(Planta Medica，1996，62(4)：381-382)。以上研究结果显示山竹具有广泛的药用价值，对其进行深入研究是非常有意义的。

TR3(Nur77)是由立早基因NR4A1编码的核受体。其在细胞浆合成后，进入核内作为转录因子，通过其中央的DNA结合域与特定的DNA八聚体序列——Nur77/NGFI-B结合反应元件相互作用，或与视黄醇受体RXR形成异源二聚体，结合到DNA应答元件上，调控靶基因的转录活性，在细胞生长、分化和凋亡过程发挥重要作用。TR3家族成员的结构都具有核受体的典型特征：N端的转录激活区AF1，高度保守的DNA结合区，C端配体结合区。许多外界信号，包括各种生长因子(如神经生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、血清生长因子)、钙离子载体、KCl、佛波酯、视黄酸家族、Tax蛋白等都能够刺激细胞，诱导或抑制TR3的表达。TR3不但可以介导多种人肿瘤细胞的凋亡，并与多种癌症相关。TR3也是肝炎病毒蛋白作用的靶分子之一，肝炎病毒蛋白对于TR3转录因子蛋白正常调节功能的干扰，与慢性病毒性肝炎、肝纤维化、肝细胞癌的发生发展有密切关系。另外，TR3亚家族成员在血管壁高表达可能促进动脉粥样硬化发病，Nur77调控基因转录激活参与巨噬细胞炎症反应何血管平滑肌细胞增值；可以推测，Nur77位于细胞核内可能促进动脉粥样硬化，位于细胞核外时转录激活功能被抑制，可能抑制动脉粥样硬化病变进展。因此，调控核受体TR3表达的化合物，可能在核受体TR3相关的癌症、肝炎、动脉粥样硬化等疾病的预防和治疗中显示出广阔的前景。

经过专利检索发现，申请号为200610016501.4的中国专利申请《山竹果皮提取物及其提取方法及其药物用途》公开了一种山竹果皮提取物及其提取方法，该方法将山竹果皮粉碎后用30％～95％乙醇提取，回收乙醇可得到用于中药新药研究的原料药；申请号为200710090207.2的中国专利申请《一种山竹提取物及其制备方法及其应用》公开了一种提取纯化的山竹果皮提取物，及其在高血脂症、冠心病、心绞痛、抗心肌缺血等疾病的作用。上述发明都只是通过简单的乙醇提取及纯化得到的山竹提取物，技术含量低，活性物质不明。本发明提供了一种山竹中总氧杂蒽酮部位及其制备方法，以及该总氧杂蒽酮部位在制备TR3受体诱导剂中的用途。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种山竹总氧杂蒽酮提取物。

本发明的另一目的在于提供上述山竹总氧杂蒽酮提取物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述山竹总氧杂蒽酮提取物在制备TR3受体诱导剂中的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种山竹总氧杂蒽酮提取物，其所述山竹总氧杂蒽酮提取物中含有如下化合物：倒捻子醇(mangostanol)、3-异倒捻子素(3-isomangostin)、8-去氧藤黄苷(8-desoxygartanin)、藤黄苷(gartanin)、α-倒捻子素(α-mangostin)、藤黄酮E(garcinone E)、9-羟基印度藤黄酮(9-hydroxycalabaxanthone)和β-倒捻子素(β-mangostin)。

所述α-倒捻子素的质量百分含量不低于40％。

所述的山竹总氧杂蒽酮提取物中，倒捻子醇的质量百分含量为0.24～1.24％，3-异倒捻子素的质量百分含量为0.99～2.01％，8-去氧藤黄苷的质量百分含量为10.06～30.30％，藤黄苷的质量百分含量为0.98～3.88％，α-倒捻子素的质量百分含量为40.15～80.21％，藤黄酮E的质量百分含量为0.71～1.57％，9-羟基印度藤黄酮的质量百分含量为0.75～5.13％，β-倒捻子素的质量百分含量为1.83～8.09％。

上述山竹总氧杂蒽酮提取物的制备方法，包括以下操作步骤：将藤黄科植物山竹(Garcinia mangostana L.)的全果或果皮粉碎，浸入提取溶剂中冷提或在提取溶剂中加热回流提取，过滤或离心除去不溶物，再对所得提取溶液进行减压浓缩，干燥成干浸膏，得到山竹提取物；将山竹提取物经过溶剂萃取分离或大孔吸附树脂分离，得到山竹总氧杂蒽酮提取物；

所述溶剂萃取分离是将山竹提取物分散于水中，依次用乙酸乙酯和正丁醇进行等体积萃取3次，分别真空减压干燥，乙酸乙酯萃取部位，即为山竹总氧杂蒽酮提取物。

所述大孔吸附树脂分离是将山竹提取物溶于水中，过滤，取滤液经大孔树脂HP-20开放柱色谱，依次采用水、体积百分比浓度为30％的乙醇-水溶液、体积百分比浓度为50％的乙醇-水溶液和体积百分比浓度为90％的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，体积百分比浓度为90％的乙醇-水溶液的洗脱部位即为山竹总氧杂蒽酮提取物。

所述提取溶剂为水、甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种以上；所述提取的温度为20～100℃，提取的时间为1～48小时；所述分离是采用层析分离法和/或萃取法进行分离。

所述提取的温度为40～80℃，提取的时间为4～16小时。

上述的一种山竹总氧杂蒽酮提取物在制备TR3受体诱导剂中的用途。

如上锁述的山竹总氧杂蒽酮提取物作为TR3受体诱导剂应用于制备预防或治疗癌症、肝炎或动脉粥样硬化的食品或药物。

所述山竹总氧杂蒽酮提取物在食品或药物中的质量含量以干品计为0.1～50％。

所述TR3受体诱导剂和药学上可接受的载体混合制成散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、滴丸剂、肠溶剂、注射剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、酊剂、膏剂或喷雾剂。当将山竹总氧杂蒽酮提取物制备成饮料时，添加浓度一般在0.01％-10％(W/W)范围较为适宜。当山竹总氧杂蒽酮部位的加入量增大，可能会出现苦涩感觉。其解决方法可以根据市场需要及消费者的要求改换剂型，如用片剂、颗粒剂、胶囊剂等。

口服给药制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等常用剂型时，可以选择淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羟甲基纤维素等作为赋形剂。除赋形剂外，还可以使用月桂醇硫酸钠、硬脂酸镁、滑石粉等作为润滑剂，糊精、结晶纤维素、玉米淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶等作为粘合剂，马铃薯淀粉、羟己基纤维素作为崩解剂。此外，还可以制成糖浆剂、乳剂、混悬剂等。对于这些剂型，可加入矫味剂。

外用剂型包括栓剂、软膏剂、外用散剂、喷雾剂、灌肠剂、乳剂等。这里所使用的固体或液体添加剂是在本技术领域内经常使用的。对于软膏剂，选用由水、脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、石蜡、树脂、高级醇、表面活性剂组成的疏水性基质或亲水性基质等在内的添加剂。

制成注射剂时，一般是用注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、丙二醇、聚乙二醇等。必要时，可以加入适宜的等张剂、助溶剂、抗氧化剂、防腐剂等。

本发明基于机理：TR3可能是筛选抗肿瘤及心脑血管药物的一个理想的分子靶点，发现并发展具有选择性调控TR3表达途径的化合物或有此先进治疗特点的药物组合具有现实的意义。

本发明相对现有技术，具有如下的优点及有益效果：本发明提供了一种具有TR3受体诱导作用的山竹总氧杂蒽酮部位，该部位可作为TR3受体转录的诱导剂，并可用于制备预防或治疗癌症、肝炎或动脉粥样硬化等疾病的食品或医药品，或将上述山竹总氧杂蒽酮部位与其他确有相关用途的化合物、提取物混合，用于制备预防或治疗癌症、肝炎或动脉粥样硬化等疾病的食品或医药品。

附图说明

图1是山竹总氧杂蒽酮部位的HPLC特征图谱及主要色谱峰的指认图谱，其中a为山竹总氧杂蒽酮部位的HPLC特征图谱，b为主要色谱峰的指认图谱。

图2是山竹提取物及部分化合物(1，10μM)的TR3转录活性图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细的描述，但本发明实施方式不限于此。

实施例1：山竹总氧杂蒽酮部位的制备

山竹果皮3kg，粉碎后，加入90％(v/v)乙醇-水25L加热回流提取2次，每次2小时，合并二次的提取液经纱布过滤后，经1000rpm离心5分钟，取上清液浓缩，冷冻干燥成干浸膏即得山竹提取物GM(360g)。取山竹提取物290g，溶解于适量水中，过滤，取滤液经大孔树脂HP-20开放柱色谱，乙醇-水梯度洗脱。分别减压回收，得水洗脱部分(109.0g)，30％(v/v)乙醇-水洗脱部分(69.0g)，50％(v/v)乙醇-水洗脱部分(16.0g)，以及90％(v/v)乙醇-水洗脱部分(88.0g)。其中，90％(v/v)乙醇-水洗脱部分即为山竹总氧杂蒽酮部位GMD。

实施例2：山竹总氧杂蒽酮部位HPLC特征图谱的建立

取实施例1中所得的山竹总氧杂蒽酮部位以适量甲醇溶解，制成5.0mg/mL的溶液，过0.45μm滤膜后，即得山竹总氧杂蒽酮部位的供试品溶液。

精密取上述供试品10μL，参考国家药典附录中规定的高效液相分析方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图(图1)。液相色谱条件为：采用十八烷基硅氧键合硅胶为固定相；以含有0.1％甲酸的甲醇-水溶液作用流动相，梯度洗脱；流速为1mL/min；检测波长为360nm；色谱柱温度为35℃。获得的山竹总氧杂蒽酮部位的HPLC特征图谱中共有八个色谱峰。将实施例3中分离得到的化合物分别采用相同的色谱条件分析，记录色谱图并与HPLC特征图谱比对得知，八个色谱峰依次为：倒捻子醇(mangostanol)，3-异倒捻子素(3-isomangostin)，8-去氧藤黄苷(8-desoxygartanin)，藤黄苷(gartanin)，α-倒捻子素(α-mangostin)，藤黄酮E(garcinone E)，9-羟基印度藤黄酮(9-hydroxycalabaxanthone)，β-倒捻子素(β-mangostin)。它们的保留时间及峰面积如表1所示：

表1  山竹总氧杂蒽酮部位HPLC图谱中八个色谱峰的信息

实施例3：山竹总氧杂蒽酮部位HPLC特征图谱重现性考察

取四批购自不同时间(2007-05-05，2008-05-15)，不同产地(广东，泰国)的山竹，按照实施例1中的制备方法依次处理，得到四批山竹总氧杂蒽酮部位(GD2007，TG2007，GD2008，TG2008)，按照实施例2中的处理方法和液相条件，分别进行HPLC分析，得到四批山竹总氧杂蒽酮部位的HPLC特征图谱，以其中α-倒捻子素的色谱保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间及各色谱峰对应的化学物质依次为：

1号峰：0.57±0.01(倒捻子醇)

2号峰：0.66±0.01(3-异倒捻子素)

3号峰：0.81±0.01(8-去氧藤黄苷)

4号峰：0.97±0.01(藤黄苷)

5号峰：1.00(α-倒捻子素)

6号峰：1.05±0.01(藤黄酮E)

7号峰：1.13±0.01(9-羟基印度藤黄酮)

8号峰：1.14±0.01(β-倒捻子素)

表2  四批山竹总氧杂蒽酮部位HPLC图谱中八个色谱峰的信息

由表2可见，采用峰面积归一化法，倒捻子醇所对应的峰面积占0.24～1.24％，3-异倒捻子素所对应的峰面积占0.99～2.01％，8-去氧藤黄苷所对应的峰面积占10.06～30.30％，藤黄苷所对应的峰面积占0.98～3.88％，α-倒捻子素所对应的峰面积占40.15～80.21％，藤黄酮E所对应的峰面积占0.71～1.57％，9-羟基印度藤黄酮所对应的峰面积占0.75～5.13％，β-倒捻子素所对应的峰面积占1.83～8.09％。

实施例4：山竹总氧杂蒽酮部位HPLC特征图谱中主要色谱峰的富集和结构鉴定

取实施例1中的山竹总氧杂蒽酮部位62.0g，采用硅胶开放柱色谱，氯仿-甲醇梯度洗脱，得到8个馏分。馏分Fr.2(氯仿-甲醇，98∶2v/v洗脱部分，10.0g)，经硅胶开放柱色谱，环己烷-丙酮(9∶1v/v)洗脱后，得到化合物GMD-5(9.7g)。馏分Fr.4(氯仿-甲醇，95∶5v/v洗脱部分，1.1g)，经SephadexLH-20柱色谱，环己烷-二氯甲烷(1∶1)洗脱，及硅胶开放柱色谱，氯仿-甲醇洗脱得到化合物GMD-8(22.6mg)和GMD-6(12.6mg)。馏分Fr.5(氯仿-甲醇，95∶5v/v洗脱部分，2.5g)经硅胶开放柱色谱，环己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，得到8个子馏分(Fr.5-1～Fr.5-8)。子馏分Fr.5-3(98∶2洗脱部分)经Sephadex LH-20柱色谱，氯仿-甲醇(3∶2)洗脱，得到化合物GMD-7(9.6mg)。子馏分Fr.5-6(95∶5洗脱部分)在氯仿-甲醇中析出结晶，过滤得到化合物GMD-3(25.2mg)。馏分Fr.6(9∶1洗脱部分，1.5g)经硅胶开放柱色谱，环己烷-乙酸乙酯(8∶2)洗脱得到化合物GMD-2(14.5mg)和GMD-4(10.4mg)。馏分Fr.7(8∶2洗脱部分，0.8g)经Sephadex LH-20柱色谱，氯仿-甲醇(1∶1)洗脱及反复硅胶柱色谱，氯仿-甲醇洗脱，得到化合物GMD-1(8.8mg)。

通过理化常数和现代波谱学手段(MS、NMR)，结合文献相关数据，鉴定了它们的结构，如下所示。

化合物GMD-1，黄色固体，ESI-MS(positive)给出m/z 449[M+Na]⁺，ESI-MS(negative)给出m/z 425[M-H]^-，推出化合物分子量为426。结合¹HNMR和¹³C NMR数据确定化合物分子式为C₂₄H₂₆O₇，计算其不饱和度为12。与文献(Phytochemistry，1996，43，1099-1102)报道的数据比较，基本一致，故该化合物被鉴定为倒捻子醇(mangostanol)，¹H NMR和¹³C NMR数据见表3，其结构式如下：

化合物GMD-2，黄色粉末，ESI-MS(negative)给出m/z 409[M-H]^-，提示分子量为410。结合¹H NMR和¹³C NMR数据，推测其分子式为C₂₄H₂₆O₆，计算不饱和度为12。与文献(赵岩，莽吉柿果皮化学成分及其生物活性研究，吉林大学博士学位论文，p 103-106)报道的数据比较，基本一致，故该化合物被鉴定为3-异倒捻子素(3-isomangostin)，¹H NMR和¹³CNMR数据见表3，其结构式如下：

化合物GMD-3，黄色粉末，ESI-MS(positive)给出m/z 403[M+Na]⁺，ESI-MS(negative)给出m/z 379[M-H]^-，推出化合物分子量为380。结合¹HNMR和¹³C NMR数据确定化合物分子式为C₂₃H₂₄O₅，计算其不饱和度为12。与文献(Phytochemistry，2003，63，467-470)报道的数据比较，基本一致，故该化合物被鉴定为8-去氧藤黄苷(8-desoxygartanin)，¹H NMR和¹³C NMR数据见表3，其结构式如下：

化合物GMD-4，黄色粉末，ESI-MS(positive)给出m/z 419[M+Na]⁺，推出化合物分子量为396。结合¹H NMR和¹³C NMR数据确定化合物分子式为C₂₃H₂₄O₆，计算其不饱和度为12。与文献(特产研究，2009，1，37-39)报道的数据比较，基本一致，故该化合物被鉴定为藤黄苷(gartanin)，¹H NMR和¹³C NMR数据见表3，其结构式如下：

化合物GMD-5，黄色粉末，三氯化铁显示呈阳性，提示有酚羟基存在。ESI-MS(negative)给出m/z 409[M-H]^-，提示分子量为410。结合¹H NMR和¹³C NMR数据，推测其分子式为C₂₄H₂₆O₆，计算不饱和度为12。与文献(Food and Chemical Toxicology，2008，46：688-693)报道的数据比较，基本一致，故该化合物被鉴定为α-倒捻子素(α-mangostin)，¹H NMR和¹³C NMR数据见表4，其结构式如下：

化合物GMD-6，黄色粉末，ESI-MS(positive)给出m/z 501[M+Na]⁺，推出化合物分子量为478。结合¹H NMR和¹³C NMR数据确定化合物分子式为C₂₉H₃₄O₅，计算其不饱和度为13。与文献(Chemical and PharmaceuticalBulletin，1993，41，958-960)报道的数据比较，基本一致，故该化合物被鉴定为藤黄酮E(garcinone E)，¹H NMR和¹³C NMR数据见表4，其结构式如下：

化合物GMD-7，黄色粉末，三氯化铁显示呈阳性，提示有酚羟基存在。ESI-MS(negative)给出m/z 407[M-H]^-，提示分子量为408。结合¹H NMR和¹³C NMR数据，推测其分子式为C₂₄H₂₄O₆，计算不饱和度为13。与文献(Natural Product Research，2006，20，1067-1073)报道的数据比较，基本一致，故该化合物被鉴定为9-羟基印度藤黄酮(9-hydroxycalabaxanthone)，¹H NMR和¹³C NMR数据见表4，其结构式如下：

化合物GMD-8，棕黄色粉末，UV(CH₃OH)nm：314，258，243，204；IR(KBr)V_max3402cm^-1提示结构中有羟基存在，1600cm^-1提示结构中有羰基存在。ESI-MS(positive)给出m/z 447[M+Na]⁺，ESI-MS(negative)给出m/z 423[M-H]^-，推出化合物分子量为424。结合¹H NMR和¹³C NMR数据确定化合物分子式为C₂₅H₂₈O₆，计算其不饱和度为12。与文献(靳三林，黄牛木抗癌活性成分研究，沈阳药科大学博士学位论文，p 77-78)报道的数据比较，基本一致，故该化合物被鉴定为β-倒捻子素(β-mangostin)，¹H NMR和¹³C NMR数据见表4，其结构式如下：

表3 NMR data of GMD-1～GMD-4(400MHz for¹H NMR)

^a：Measured in CD₃OD，^b：Measured in CDCl₃，^c：Measured in Acetone-d₆.

表4  NMR data of GMD-5～GMD-8(400MHz for¹H NMR)

^a：Measured in Acetone-d₆，^b：Measured in CDCl₃，^c：Measured in DMSO-d₆.

实施例5：实施例1和实施例2中所得的山竹提取物、总氧杂蒽酮部位及部分化合物对TR3mRNA表达的影响

本实施例采用RT-PCR进行分析。NIH-H460肺癌细胞接种于6孔板中(5×10⁵cells/well)，贴壁培养过夜，并且饥饿12h后，加药培养。按总RNA提取试剂盒说明提取并纯化细胞系的总RNA。并按照逆转录试剂盒说明将细胞总RNA的mRNA转录成cDNA。PCR条件：20μL体系中cDNA 4μL，10×PCR buffer，25mmol/L MgCl₂，10mmol/L dNTPs，每次加TR3引物10μmol/L，Taq酶1U，反应在PCR仪中进行。94℃4min，94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，35个循环。PCR引物序列：TR3上游5′-TCA TGGACG GCT ACA CAG-3′，下游5′-GTA GGC ATG GAA TAG CTC-3′；β-actin上游5′-CTG GAG AAG AGC TAC GAG-3′，下游5′-TGA TGG AGT TGAAGG TAG-3′。实验结果显示山竹提取物可以诱导TR3mRNA的表达，并且具有一定的量效关系。图2是实施例1及实施例3所得山竹提取物GM、总氧杂蒽酮部位GMD及其中主要的氧杂蒽酮类化合物在不同浓度下对TR3的mRNA表达的影响。其中，提取物GM，GMD，化合物GM-5、GM-8可不同程度地诱导TR3mRNA的表达，提示其为TR3的诱导剂。

实施例6：本发明山竹提取物、总氧杂蒽酮部位及部分化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用

本实施例采用MTT法测试山竹提取物、总氧杂蒽酮部位及部分化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用。选融合度在80％，对数期生长的细胞，用胰酶消化，转移，离心，去上清液，用新配制的含10％(v/v)FBS(灭活的小牛胎血清)的DMEM培养液混悬。各种细胞以1.0×10⁴/孔接种于96孔培养板均同时依次加入5个不同稀释度的待筛样品药液，每个稀释度重复3个孔，同时平行做相同浓度的溶剂对照，及不加药的阴性对照，37℃培养72小时，MTT染色，DMSO脱色，测定OD₅₇₀，计算肿瘤生长抑制率IR(％)＝(空白OD平均值-给药组OD平均值)/空白OD平均值×100。实验结果参见表5。结果显示，实施例1和实施例4中的山竹提取物、总氧杂蒽酮部位及其中主要的氧杂蒽酮类化合物对人体的4种肿瘤细胞：非小肺癌细胞H-460；乳腺癌细胞MCF-7；肝癌细胞HepG2；SMMC-7221的增殖具有不同程度的抑制作用。

表5  山竹提取物、总氧杂蒽酮部位及主含化合物对肿瘤细胞增殖的抑制活性

实施例7：山竹总氧杂蒽酮部位颗粒剂的制备

取实施例1所得山竹总氧杂蒽酮部位10g与淀粉10g混合，加水制成软材，过12目筛进行造粒，干燥后得到颗粒剂。本颗粒剂中，每200mg中含总氧杂蒽酮100mg。

实施例8：山竹总氧杂蒽酮部位泡腾片的制备

取实施例1所得山竹总氧杂蒽酮部位10g，加硼酸12g，柠檬酸8g，阿斯巴甜(苯丙氨酸)，淀粉10g，碳酸氢纳8g，微晶纤维素12g混合，混合物用单冲压片机打成直径6mm，重量600mg的片。本片剂中每片含山竹总氧杂蒽酮部位100mg。

实施例9：山竹总氧杂蒽酮部位胶囊剂的制备

取实施例1所得山竹总氧杂蒽酮部位10g与乳糖34g、硬脂酸镁6g混合，以每500mg填充胶囊。本胶囊剂中，每个胶囊含山竹总氧杂蒽酮部位100mg。

实施例10：山竹总氧杂蒽酮部位和若干中药组合物的制备

取实施例1所得的山竹总氧杂蒽酮部位20g与具有调血脂的中药生首乌10g、山楂10g、草决明10g混合，以每500mg填充胶囊。本胶囊剂中，每个胶囊含山竹总氧杂蒽酮部位200mg。

实施例11：山竹总氧杂蒽酮部位和洛伐他汀混合片剂的制备

取山竹总氧杂蒽酮部位20g与洛伐他汀2g，加入蔗糖粉40g，糊精10g，滑石粉8g混合，混合物用单冲压片机打成直径6mm，重量400mg的片。本片剂山竹总氧杂蒽酮部位100mg。

实施例12：山竹总氧杂蒽酮提取物在食品中的应用

(1)山竹草莓汁：山竹总氧杂蒽酮提取物2g，新鲜草莓2000g，去果蒂、洗净、滤干水分待用。用榨汁机将准备好的山竹和草莓榨成汁，加入适量的浓糖浆拌匀，即得。

(2)清热解毒山竹汤：山竹总氧杂蒽酮提取物20克、猪肚500克、金银花25克、胎菊10克、岗梅根20克、蜜枣10粒。将金银花、胎菊、岗梅根洗净后用纱布袋装好，同猪肚、山竹、蜜枣一起入锅，加水2500毫升，用旺火煮沸后去掉浮沫，再用小火煲煮3小时即成。

实施例13：山竹总氧杂蒽酮部位及含有该总氧杂蒽酮部位的组合物的抗大鼠动脉粥样硬化的实验研究

(1)试验动物健康清洁级雄性SD大鼠62只，8～10周龄，体重180～220g。

(2)饲料机制颗粒饲料，基础饲料配方：面粉20％(质量百分含量，下同)、米粉2％、玉米20％、麸皮25％、豆料20％、骨粉2％、鱼粉2％；高脂饲料配方：4％胆固醇、10％猪油、0.2％甲基硫氧嘧啶、86％基础饲料。

(3)仪器与试剂日本日立7060型全自动生化分析仪；德国里奥LEO-1430VP扫描电镜，胆固醇(上海山浦化工有限公司，化学纯)；甘油三酯测定试剂盒、总胆固醇测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒均购自南京建成生物制品研究所。

(4)药物  实施例7中的山竹总氧杂蒽酮部位颗粒剂和实施例11中山竹总氧杂蒽酮部位和洛伐他汀混合片。

(5)实验方法

动物分组与给药实验：从74只SD大鼠中随机取12只大鼠，饲喂基础饲料，作为正常对照组(A)。其余62只饲喂高脂饲料1个月后，随机抽样检测2只大鼠主动脉，以发现动脉粥样硬化斑块为造模成功，将其余60只饲喂高脂饲料大鼠随机分为5组，每组12只，即高脂模型组(B)、总氧杂蒽酮部位颗粒剂低剂量组，0.5g/kg(C)、总氧杂蒽酮部位颗粒剂高剂量组，2g/kg(D)、总氧杂蒽酮部位和洛伐他汀混合片低剂量组，0.5g/kg(E)、总氧杂蒽酮部位和洛伐他汀混合片高剂量组，2g/kg(F)。用药组灌胃相应剂量的药物，同时模型组与正常对照组均灌胃等量蒸馏水。灌胃量为每只大鼠0.5ml/d，共8周。

观察指标：大鼠注射2％戊巴比妥纳45mg/kg腹腔麻醉，切开颈部分离颈动脉，插管取血2.5mL，分离血清，按各检测试剂盒的操作方法，测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

主动脉组织学观察：打开胸腔分离主动脉，剥去外膜脂肪，从主动脉弓处剪5mm×8mm大小1块，用PBS缓冲液洗净表面后，立即投入2.5％戊二醛固定液中，接着用PBS缓冲液漂洗后，用1％锇酸固定，再用PBS缓冲液充分漂洗，然后分别用50％、70％、90％、100％(V/V)乙醇逐级脱水共4次，用乙酸异戊酯置换乙醇后，将样品移入临界点干燥仪用液态CO₂干燥，样品干燥后在离子溅射仪中镀膜，最后扫描电镜观察。

统计学分析：实验结果采用(x±s)表示，SPSS10.0统计软件进行方差分析。

(6)实验结果

实验第8周末，高脂饲料组(B组)血清TC、TG、LDL-C水平比正常对照组(A组)明显升高，各含有总氧杂蒽酮部位的用药组与高脂饲料组(B组)比较，均能使血清TC、TG、LDL-C含量降低，高剂量组有比较明显的改善作用，且作用优于低剂量组，在降低TC、TG、LDL-C的同时，升高HDL-C，表明有明显的调血脂的作用(P＜0.01)，结果见表6。

表6  治疗后各组大鼠血脂比较(mmol/L，x±s)

注：与A组比较，*P＜0.01，与B组比较，^△P＜0.01

各组大鼠扫描电镜结果比较，正常组见主动脉血管结构清晰，内皮细胞完整无脱落，细胞间连接紧密，表面无沉积物。模型组见主动脉内膜表面多处不光滑，病变显著，呈多样化，细胞排列变得不规则，方向性改变，内皮细胞间连接遭破坏，表面有大量沉积物，部分区域内皮细胞出现脱落。加山竹提取物高剂量组(D，F组)见主动脉内膜呈修复状态，表面较光滑，内皮细胞排列整齐，有方向性，内皮细胞隆起明显，连接尚紧密，表面可见少量黏附的小颗粒，但无大量沉积物。低剂量组(C，E组)见主动脉内膜表面不光滑，内皮细胞的纵嵴呈不规则性排列，无方向性，内皮细胞呈隆起、增生、脱落，细胞间连接较疏松，表面有沉积物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种山竹总氧杂蒽酮提取物，其特征在于：所述山竹总氧杂蒽酮提取物中含有如下化合物：倒捻子醇、3-异倒捻子素、8-去氧藤黄苷、藤黄苷、α-倒捻子素、藤黄酮E、9-羟基印度藤黄酮和β-倒捻子素。

2.根据权利要求1所述的一种山竹总氧杂蒽酮提取物，其特征在于：所述α-倒捻子素的质量百分含量不低于40％。

3.根据权利要求1所述的一种山竹总氧杂蒽酮提取物，其特征在于：所述的山竹总氧杂蒽酮提取物中，倒捻子醇的质量百分含量为0.24～1.24％，3-异倒捻子素的质量百分含量为0.99～2.01％，8-去氧藤黄苷的质量百分含量为10.06～30.30％，藤黄苷的质量百分含量为0.98～3.88％，α-倒捻子素的质量百分含量为40.15～80.21％，藤黄酮E的质量百分含量为0.71～1.57％，9-羟基印度藤黄酮的质量百分含量为0.75～5.13％，β-倒捻子素的质量百分含量为1.83～8.09％。

4.根据权利要求1所述的一种山竹总氧杂蒽酮提取物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：将藤黄科植物山竹的全果或果皮粉碎，浸入提取溶剂中冷提或在提取溶剂中加热回流提取，过滤或离心除去不溶物，再对所得提取溶液进行减压浓缩，干燥成干浸膏，得到山竹提取物；将山竹提取物经过溶剂萃取分离或大孔吸附树脂分离，得到山竹总氧杂蒽酮提取物；

所述溶剂萃取分离是将山竹提取物分散于水中，依次用乙酸乙酯和正丁醇进行等体积萃取3次，分别真空减压干燥，乙酸乙酯萃取部位，即为山竹总氧杂蒽酮提取物；

所述大孔吸附树脂分离是将山竹提取物溶于水中，过滤，取滤液经大孔树脂HP-20开放柱色谱，依次采用水、体积百分比浓度为30％的乙醇-水溶液、体积百分比浓度为50％的乙醇-水溶液和体积百分比浓度为90％的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，体积百分比浓度为90％的乙醇-水溶液的洗脱部位即为山竹总氧杂蒽酮提取物。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述提取溶剂为水、甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种以上；所述提取的温度为20～100℃，提取的时间为1～48小时；所述分离是采用层析分离法和/或萃取法进行分离。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述提取的温度为40～80℃，提取的时间为4～16小时。

7.根据权利要求1所述的一种山竹总氧杂蒽酮提取物在制备TR3受体诱导剂中的用途。

8.如权利要求1所述的山竹总氧杂蒽酮提取物作为TR3受体诱导剂应用于制备预防或治疗癌症、肝炎或动脉粥样硬化的食品或药物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述山竹总氧杂蒽酮提取物在食品或药物中的质量含量以干品计为0.1～50％。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述TR3受体诱导剂和药学上可接受的载体混合制成散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、滴丸剂、肠溶剂、注射剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、酊剂、膏剂或喷雾剂。

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