CN110464771A - 一种裸花紫珠药效标准提取物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种裸花紫珠药效标准提取物及其制备方法。这种裸花紫珠药效标准提取物总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分含量在92％～98％，其中苯丙烯酸类：黄酮类化合物百分含量比值为70±5％：30±10％；苯丙烯酸类：黄酮类化合物数目比值为25～35：8～16。裸花紫珠药效标准提取物的制备方法的步骤依次为用乙醇溶液回流提取、苯乙烯型非极性吸附树脂纯化、乙酸乙酯萃取、制备HPLC分离、真空干燥。本发明的有益效果：本发明解决裸花紫珠制剂质量的稳定性和一致性差的问题，制备的裸花紫珠叶药效标准提取物不仅总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分含量高，而且其中的苯丙烯酸类，黄酮类化合物的百分含量比值和化合物数目比值都较稳定。裸花紫珠叶药效标准提取物还具有显著的抗菌、消炎和止血的药效作用。

Description

一种裸花紫珠药效标准提取物及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种裸花紫珠药效标准提取物及其制备方法。
背景技术
中药标准提取物是基于改善由中药原料药材质量不稳定带来的诸多中药产品质量问题所提出的一种解决途径，将中药和天然产品的内在差异减到最低水平。中药标准提取物采用现代技术，对传统中药材进行提取加工而得到的一种具有相对明确药效物质基础、严格质量标准的中药产品，可作为中药制剂的原料药。
中药药效标准提取物明确药效物质基础，反映原中药材的特定功效持点，且制备工艺稳定、质量可控。中药药效标准提取物保证了中药/植物次生代谢化学组份的稳定和药效药理学的稳定性，更重要的是保证了临床疗效稳定一致。
中药/植物药药效标准提取物着眼于全过程的药效物质基础的特有、差异、动态变化和质量的传递性、溯源性，有利于建立中药/植物药全程质量控制及质量溯源体系，像化学原料药和中间体一样，形成中药/植物药原料标准提取物产业，通过这种专业化分工，有利于提高中药/植物药生产经营的规范化和集约化水平。中药药效标准提取物的产生和发展，是中药走向国际市场的需要，是中药现代化和培育新兴产业的需要。
裸花紫珠药材是马鞭草科紫珠属裸花紫珠的干燥叶和带叶的嫩枝，是一种常用的海南传统民族药材，因主要生长在海南黎族地区，也被称为黎药。裸花紫珠化学成分主要有苯丙素类、黄酮类、三萜类、二萜类、环烯醚萜类、酚酸类及其苷和甾醇等，具有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消肿、祛风祛湿功效、跌打肿痛、风湿肿痛、肺结核咳血、胃肠出血等症。
据文献报道，苯丙素苷类和酚苷类成分可能是裸花紫珠止血作用的主要活性成分。其中苯丙素类毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和连翘酯苷B具有抗炎、抗菌作用；毛蕊花糖苷影响RBL-2H3肥大细胞释放组胺和花生四烯酸，通过阻断AP-1激活抑制脂多糖诱导的一氧化氮合酶的表达，具有抗氧化和抗炎活性；毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷发挥抗炎作用于抑制人血管内皮细胞的ERK和JNK下调IL-1β诱导的细胞粘附分子；异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷抑制5-脂氧合酶作用，可作为抗过敏、抗炎剂；毛蕊花糖苷、连翘酯苷B抑制对环氧合酶的催化前列腺素生物合成的活性作用；连翘酯苷B通过调节炎性因子预防实验败血症。
裸花紫珠总黄酮对表皮伤口易感染菌具有抑菌作用，能明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，具有良好的抗炎作用；从裸花紫珠提取到的5-羟基-3,7,3′,4′-四甲氧基黄酮并发现其具有抗炎作用。
已知裸花紫珠中苯丙素类成分的结构均系苯丙烯酸与糖缩合的苷或游离苯丙烯酸咖啡酸与阿魏酸，此外已知裸花紫珠中环烯醚萜类成分的结构其中有半数以上为苯丙烯酸的衍生物。苯丙烯酸类是主治各种炎症、出血和抗菌活性成分，黄酮类为抗炎和抗菌活性成分。
裸花紫珠颗粒、裸花紫珠片、裸花紫珠栓、裸花紫珠软胶囊、裸花紫珠分散片五个剂型现有12个药业企业在生产，质量的稳定性和一致性堪忧，本领域亟需一种裸花紫珠药效标准提取物来改善由中药原料药材质量不稳定带来的诸多中药产品质量问题，以保证临床疗效稳定一致。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了解决裸花紫珠制剂质量的稳定性和一致性差，而提供了一种裸花紫珠药效标准提取物及其制备方法。
本发明提供了一种裸花紫珠药效标准提取物，所述的裸花紫珠药效标准提取物主要由苯丙烯酸衍生物和黄酮类法成分组成，其中总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分含量在92％～98％，苯丙烯酸类：黄酮类化合物百分含量比值为70±5％：30±10％；苯丙烯酸类：黄酮类化合物数目比值为25～35：8～16。
一种裸花紫珠药效标准提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将裸花紫珠药材粉末，用8～20倍量的10％～90％的乙醇水溶液混合，热回流提取次数1～4次，每次提取0.5h～2h，所得提取液合并；
(2)合并后的提取液用苯乙烯型非极性吸附树脂纯化，上样量为总苯丙烯酸类、黄酮类5～15mg/g(干树脂)，上样浓度总苯丙烯酸类、黄酮类1～4mg/ml，吸附流速为2～5bv/h，洗脱量为2～5bv/h，洗脱浓度5～95％乙醇，得大孔树脂分离纯化提取物，其中总苯丙烯酸类，黄酮类纯度大于60％；
(3)大孔树脂分离纯化后提取物再经水饱和乙酸乙酯萃取1～3次，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取物，其中总苯丙烯酸类，黄酮类纯度达到80％以上；
(4)乙酸乙酯萃取物再经制备HPLC分离，除去小分子量的大极性成分和极性小的萜类成分，制备HPLC色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，其规格为外径10mm～300mm×柱长250mm～1500mm，填料粒径5μm～50μm，流动相体系甲醇～甲酸水溶液、甲醇～乙酸水溶液、甲醇～磷酸水溶液、乙腈～甲酸水溶液、乙腈～乙酸水溶液、乙腈～磷酸水溶液，梯度洗脱，采用DAD检测器检测，210nm和250～350nm双波长检测，收集总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分洗脱液；
(5)总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分洗脱液，减压回收溶剂，65℃真空干燥，得到裸花紫珠叶药效标准提取物，总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分含量在92％～98％。
优选的，一种裸花紫珠药效标准提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将裸花紫珠药材粉末，用10～12倍量的60％～90％的乙醇水溶液混合，热回流提取次数3次，每次提取1h，所得提取液合并；
(2)合并后的提取液用AB-8树脂纯化，上样量为总苯丙烯酸类、黄酮类10mg/g(干树脂)，上样浓度总苯丙烯酸类、黄酮类2.942mg/ml，吸附流速为3bv/h，洗脱量为3bv/h，洗脱浓度80％乙醇，得大孔树脂分离纯化提取物，其中总苯丙烯酸类，黄酮类纯度大于60％；
(3)大孔树脂分离纯化后提取物再经水饱和乙酸乙酯萃取1～3次，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取物中总苯丙烯酸类，黄酮类纯度达到80％以上；
(4)乙酸乙酯萃取物再经制备HPLC分离，除去小分子量的大极性成分和极性小的萜类成分，制备HPLC色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，其规格为外径10mm～300mm×柱长250mm～1500mm，填料粒径5μm～50μm，流动相体系甲醇～甲酸水溶液、甲醇～乙酸水溶液、甲醇～磷酸水溶液、乙腈～甲酸水溶液、乙腈～乙酸水溶液、乙腈～磷酸水溶液，梯度洗脱，采用DAD检测器检测，210nm和250～350nm双波长检测，收集总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分洗脱液；
(5)总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分洗脱液，减压回收溶剂，65℃真空干燥，得到裸花紫珠叶药效标准提取物。
本发明中样品检测采用的色谱条件为：
Agilent1200型高效液相色谱仪，色谱柱Xtimate C18，其规格为外径4.6mm×柱长250mm，填料直径5μm。所用到的流动相A相为纯乙腈，B相为0.1％磷酸水溶液。梯度洗脱，流速为0.8ml/min，检测波长为254nm，柱温为室温，进样量5μL。
梯度洗脱程序如下所示：
本发明的积极进步效果在于：本发明解决裸花紫珠制剂质量的稳定性和一致性差的问题，制备的裸花紫珠叶药效标准提取物不仅总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分含量高，而且其中的苯丙烯酸类，黄酮类化合物的百分含量比值和化合物数目比值都较稳定。裸花紫珠叶药效标准提取物还具有显著的抗菌、消炎和止血的药效作用。
附图说明
图1为实施例6中AB-8动态吸附曲线图
图2为实施例6中AB-8动态洗脱曲线图
图3为实施例6中不同上样速度转移率变化图
图4为实施例6中随着洗脱剂浓度降低苯丙烯酸类,黄酮类纯度和转移率变化
图5为实施例8中裸花紫珠药效标准提取物超高效液相色谱(UPLC)色谱
图6为实施例8中裸花紫珠药效标准提取物在线DAD紫外可见光谱图
图7为实施例8中LC/MS空白总离子流色谱图
图8为实施例8中裸花紫珠药效标准提取物LC/MS正模式总离子流色谱图
图9为实施例8中裸花紫珠药效标准提取物LC/MS负模式总离子流色谱图
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下述实施例中的药材粉末由下列制备方法制得：将2016年9月30的白沙裸花紫珠叶用粉碎机粉碎，过40目筛，密闭封存，备用。
实施例1
(1)提取时间考察
称取4份裸花紫珠粉末4.99g、5.00g、5.01g、5.02g，分置于250ml的圆底烧瓶中，各加入浓度为60％的乙醇溶液50ml，分别加热回流0.5h、1h、1.5h、2h，提取次数为1次，冷却抽滤，滤液用超纯水稀释一倍，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。检测结果见表1
表1裸花紫珠各成分不同提取时间得率(％)比较
结果显示1h为好。
(2)乙醇浓度考察
称取4份裸花紫珠粉末5.02g、4.99g、4.99g、5.01g，分置于250ml的圆底烧瓶中，分别加入浓度为10％、30％、60％、90％的乙醇溶液50ml，加热回流1h，提取次数为1次，冷却提取液，抽滤，滤液用超纯水稀释一倍，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。检测结果见表2。
表2裸花紫珠各成分不同乙醇浓度得率(％)比较
结果显示除毛蕊花糖苷90％乙醇浓度为最佳外，其他成分为60％为最佳乙醇浓度。
(3)料液比考察
称取裸花紫珠粉末5.01g、5.01g、5.01g、5.01g，分置于250ml的圆底烧瓶中，分别加入8倍量、12倍量、16倍量和20倍量的浓度为60％的乙醇，加热回流1h，提取次数为1次，冷却提取液，抽滤，滤液用超纯水稀释一倍，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。检测结果见表3。
表3裸花紫珠各成分不同料液比得率(％)比较
结果显示料液比1:12为佳。
(4)提取次数考察
称取裸花紫珠粉末5.00g、4.99g、5.01g、4.98g，分置于250ml的圆底烧瓶中，分别加入浓度为60％的乙醇溶液50ml，加热回流1h，提取次数分别为1、2、3、4次，冷却提取液，每次提取后抽滤，合并滤液，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。检测结果见表4。
表4裸花紫珠各成分不同提取次数得率(％)比较
结果显示金石蚕苷、毛蕊花糖苷、木犀草苷提取4次数为佳，而咖啡酸和连翘酯苷B提取1次数为佳。
实施例2
(1)正交实验设计
采用正交实验为4因素3水平9次实验，实验设计L9(34)正交实验因素水平表见5和L9(34)正交实验表6。
表5 L9(34)正交实验因素水平表
表6 L9(34)正交实验表
表7总黄酮类方差分析表
表8苯丙烯酸类方差分析表
表9总量方差分析表
(2)正交实验结果
由表6、7可以看出黄酮类成分提取条件的主次因素为：乙醇浓度A>提取次数C>料液比B>提取时间D。通过对比，确定黄酮类最佳提取条件为：热回流提取，乙醇浓度为60％，料液比为1:12，提取次数3次，提取时间为1h。
由表6、8可以看出苯丙烯酸类成分提取条件的主次因素为：乙醇浓度A>提取次数C>料液比B>提取时间D。通过对比，确定苯丙烯酸类最佳提取条件为：热回流提取，乙醇浓度为90％，料液比1:12，提取次数3次，提取时间为1h。
苯丙烯酸类和黄酮类总量提取的主次因素乙醇浓度A>提取次数C>提取时间D>料液比B。最佳组合A3B2C3D2，即最佳提取条件为：热回流提取，乙醇浓度为90％，料液比1:12，提取次数3次，提取时间为1h。
(3)验证试验
称取裸花紫珠粉末5.01g、4.98g和4.97g，分置于250ml的圆底烧瓶中，分别加入浓度为90％的乙醇溶液60ml，加热回流1h，提取3次，抽滤，合并滤液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。检测结果见表10、11。
表10各成分提取验证实验表
表11总成分提取验证实验表
结果显示它们的得率均大于它们在各自正交提取实验设计表中的任何一种提取方式下的得率，该工艺重现性好，稳定可行。
实施例3
称取裸花紫珠粉末40g置1000ml圆底烧瓶中，加10倍量60％乙醇加热回流提取三次，每次1h，抽滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，为裸花紫珠浓缩液，记录滤液体积，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。测得总苯丙烯酸类，黄酮类浓度为0.981mg/ml。
取预处理过的AB-8、HZ-816、HZ-818、聚酰胺、Amberlite XAD-4(美国)、Daion HP-20、D101、DM130树脂1g(干树脂)，分别置于250ml锥形瓶中，各加入总苯丙烯酸类、黄酮类浓度为0.981mg/ml的裸花紫珠浓缩液15ml，持续振摇2h，静置12h滤过，测定滤液中总苯丙烯酸类、黄酮类的浓度，吸附后的树脂加入30ml 60％的乙醇解吸，持续振摇2h，静置12h，测定滤液中总苯丙烯酸类，黄酮类的浓度，计算静态吸附量，吸附率，解析量，解析率，结果见表12。
表12不同树脂对总苯丙烯酸类，黄酮类吸附和解析的情况
实施例6
(1)上样量考察
取经过预处理的AB-8树脂15ml(相当干树脂10g)，湿法装入内径1.7cm的层析柱，加入足量浓度为0.981mg/ml的裸花紫珠提取浓缩液，吸附速率为2BV/h，20ml/份收集流出液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。测定流出液中总苯丙烯酸类、黄酮类浓度，结果见表13，并绘制动态吸附曲线图(见图1)，并确定上样量，。
表13 AB-8树脂动态吸附实验流出液浓度随上样体积变化表
当加入100ml 0.981mg/ml的裸花紫珠提取液时发生泄漏，确定树脂上样量为10ml/g。
(2)动态洗脱实验
吸附饱和后的树脂用纯水洗涤至洗脱液无色透明，加入60％的乙醇解吸附，控制流速2BV/h分布收集解析液，解析液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。测定洗脱液总苯丙烯酸类，黄酮类浓度，结果见表14，并绘制动态解析曲线图(见图2)。
表14 AB-8树脂动态洗脱实验洗脱液浓度随洗脱体积变化表
使用60％乙醇，3bv左右可基本洗脱完全。
(3)上样浓度考察
取经过预处理的AB-8树脂各15ml(相当干树脂10g)湿法装入层析柱，分别按树脂最大上样量(上样量为98.1mg)加入0.49，0.98，1.962，2.942，3.924mg/ml 5种不同浓度的裸花紫珠提取液，控制流速为2bv/h吸附完全后用纯水洗涤至流出液无色透明，然后用3BV60％乙醇解析，控制洗脱流速为2bv/h收集洗脱液，洗脱液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。测定洗脱液总苯丙烯酸类、黄酮类浓度，结果见表15。
表15上样浓度变化表
结果显示随上样浓度升高，树脂的吸附效果变好，但浓度过高上样体积减少，流速不变从而树脂吸附样品的时间会减少导致吸附不完全，总苯丙烯酸类，黄酮类转移率反而降低。最佳选择上样浓度为2.942mg/ml。
(4)吸附速率考察
取经过预处理的AB-8树脂各15ml(相当干树脂10g)湿法装入层析柱，分别按1、2、3、4、6、8、10、12bv/h速度加入相同浓度，等量的裸花紫珠提取液。吸附完全后，用纯水洗涤至流出液无色透明，然后用3BV的60％乙醇解析，控制流速为2bv/h收集洗脱液，洗脱液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。测定洗脱液总苯丙烯酸类，黄酮类浓度，结果见表16。并绘制不同上样速度转移率变化图(见图3)。
表16上样速度变化表
基于洗脱的效率的考虑，选择上样速度为3bv/h。
(5)洗脱剂浓度考察
取经过预处理的AB-8树脂各15ml(相当干重10g)湿法装入层析柱，分别按树脂最大上样量加入浓度为2.942mg/ml的总苯丙烯酸类，黄酮类提取液，控制吸附流速为3bv/h吸附完全后，用纯水洗涤至流出液无色透明，用不同浓度的乙醇洗脱，取适量洗脱液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。余下浓缩干燥称重。测定洗脱液总苯丙烯酸类、黄酮类浓度，结果见表17。并绘制随着洗脱剂浓度降低苯丙烯酸类,黄酮类纯度和转移率变化图(见图4)。
表17洗脱剂浓度变化表
由图4可见，在洗脱剂乙醇浓度为80％时，总苯丙烯酸类，黄酮类纯度，总苯丙烯酸类，黄酮类转移率皆为最高，随乙醇浓度降低，黄酮的纯度急剧下降，选择80％的乙醇作为最佳洗脱浓度。
(6)重复性考察
取经过预处理的AB-8树脂各15ml(相当干重10g)湿法装入层析柱，分别按树脂最大上样量加入浓度为2.942mg/ml的总苯丙烯酸类，黄酮类提取液34ml，控制吸附流速为3bv/h吸附完全后，用纯水洗涤至流出液无色透明，使用80％浓度的乙醇洗脱，取适量洗脱液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。余下浓缩干燥称重。重复上述试验3次。测定洗脱液总苯丙烯酸类，黄酮类浓度，结果见表18。
表18 AB-8树脂纯化重复性试验结果
表18结果显示,该纯化方法具有较好的重现性,适用于裸花紫珠叶总苯丙烯酸类，黄酮类的纯化。34ml浓度为2.942mg/ml的提取液可精制得143mg纯度为51.85％的浸膏。
实施例7
取经过预处理的AB-8树脂150ml(相当干重100g)湿法装入层析柱，按树脂最大上样量加入浓度为2.942mg/ml的总苯丙烯酸类，黄酮类提取液340ml，控制吸附流速为3bv/h吸附完全后，用纯水洗涤至流出液无色透明，使用80％浓度的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，水溶液用等量水饱乙酸乙酯萃取，分取乙酸乙酯提取液，用乙酸乙酯提取液的十分之一的水萃取，移去水层，取适量乙酸乙酯提取液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。余下乙酸乙酯提取液减压回收溶剂，并真空浓缩干燥称重。测定洗脱液总苯丙烯酸类，黄酮类浓度，计算转移率和纯度，结果见表19。
表19 AB-8树脂纯化乙酸乙酯萃取的提取物的纯度
实施例8
取经过预处理的AB-8树脂1500ml(相当干重1000g)湿法装入层析柱，按树脂最大上样量加入浓度为2.942mg/ml的总苯丙烯酸类，黄酮类提取液3400ml，控制吸附流速为3bv/h吸附完全后，用纯水洗涤至流出液无色透明，使用80％浓度的乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇，水溶液用等量水饱乙酸乙酯萃取，分取乙酸乙酯提取液，用乙酸乙酯提取液的十分之一体积的水萃取，移去水层，取适量乙酸乙酯提取液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。余下乙酸乙酯提取液减压回收溶剂，并真空浓缩干燥称重。将乙酸乙酯提取干膏溶于70ml甲醇中，过0.45μm微孔滤膜过滤，滤液进样制备高效液相仪(北京创新通恒，1000ml Pump)制备，北京创新通恒制备柱，其规格为外径150mm×柱长600mm，填料C18,迪马科技有限公司，填料直径10μm 3kg，填装400mm。所用到的流动相A相为甲醇，B相为0.2％醋酸水溶液。
梯度洗脱如下所示：
流速300ml/min，检测波长210nm，柱温为室温，进样量70ml。去掉9min之前和37min以后的峰，收集出峰时间9min到37min的洗脱液。洗脱液减压回收溶剂，65℃真空浓缩干燥，粉碎，称重，得到裸花紫珠药效标准提取物。
(1)药效标准提取物色谱表征及定量分析
精密称取裸花紫珠药效标准提取物粉末0.1002g，溶于80％乙醇，置于50mL容量瓶中，80％乙醇定容至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
精密称取咖啡酸对照品1.04mg，连翘酯苷B对照品1.13mg，毛蕊花糖苷4.92mg对照品，木犀草苷2.09mg对照品，置于5mL容量瓶中，50％甲醇定容至刻度。精密取2mL，置于10mL容量瓶中，用50％甲醇定容至刻度，得到混合标准品溶液。
采用超高效液相色谱(UPLC)法中的超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；EclipsePlusC18RRHD色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.8μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
流速为0.3ml/min，检测波长332nm，柱温45℃；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μL进样。测定总苯丙烯酸类，黄酮类含量，将游离苯丙烯酸类化合物采用咖啡酸作为对照品，苯丙烯酸类化合物采用连翘酯苷B及毛蕊花糖苷作为对照品，黄酮类化合物采用木犀草苷作为对照品计算含量。结果见表20、21，超高效液相色谱(UPLC)色谱表征见图5。
表20裸花紫珠药效标准提取物峰的UPLC-DAD-Q-TOF-MS鉴定结果
表21裸花紫珠药效标准提取物中苯丙烯酸和黄酮类化合物数与含量结果
(2)裸花紫珠药效标准提取物峰的成分归属
采用超高效液相色谱(UPLC)Agilent 1290超高效液相色谱-6530四极杆-飞行时间质谱仪(Q-TOF-MS)，配有两个独立二元高压梯度泵、可控温自动进样器、可控温柱温箱、二极管阵列检测器(DAD)和电喷雾离子源(ESI)；AgilentEclipsePlusC18UPLC色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.8μm。流动相为(A)0.1％甲酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
流速为0.3ml/min，检测波长332nm，柱温45℃，进样量1μL。采用二极管阵列检测器(DAD)在线检测，得到紫外可见光谱信息见图6。峰2、3、4、7、8、10、12、14、15、16、17、18、20、21、22、24、25、26、28、29、31、34、35、36、39、40、42、43、45、46的UV信号符合苯丙烯酸衍生物光谱特征：220nm有小峰吸收和肩峰，260nm左右有最小吸收峰，260～330nm间有一个肩峰，在330nm左右有最大吸收峰。峰9、11、13、19、27、30、32、33、37、38、41、44的UV信号符合黄酮类化合物，其UV谱有2个吸收带，吸收带I位于337～348nm，是分子中C环和B环上的羰基共轭体系的紫外吸收，位于251～285nm的吸收带II是A环与C环上羰基共轭体系的紫外吸收。
采用电喷雾离子源，四极杆-飞行时间质谱检测器，质谱条件：质谱检测分别在正、负离子模式下进行，毛细管电压分别为3500V(正模式)和3000V(负模式)，碰撞电压125V。一级质谱选用MS1模式，质量扫描范围50-1500m/z。所得LC-MS数据由Agilent MassHunter软件采集。LC/MS正、负模式总离子流图(图7～9)
所得质谱信息通过一级质谱得到的精确质量数，在一级质谱中，这些化合物在正负模式下生成加合离子，依据加合离子信息，推断出化合物的精确分子量和分子式。在线查阅文献及与已知裸花紫珠化合物波谱对比，化合物归属结果见表20。
实施例9
供试液制备：精密称取裸花紫珠药效标准提取物粉末0.35g，加入50％无水乙醇至7ml，然后用灭菌水稀释，采用倍比稀释法，配成50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195、0.098mg/ml的不同浓度，使用前加温混匀。
阳性对照药(裸花紫珠颗粒)：将裸花紫珠颗粒2袋(含干浸膏1.6克)用研钵研成粉末后，加入50％无水乙醇至12.8ml，然后用灭菌水稀释，采用倍比稀释法，配成125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.95、0.98mg/ml的不同浓度，使用前加温混匀。
阳性对照药(甲硝唑片)：将甲硝唑片10片用研钵研成粉末后，加入50％无水乙醇至8ml，然后用灭菌水稀释，采用倍比稀释法，配成250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.95、0.98mg/ml的不同浓度，使用前加温混匀。
空白对照：量取所需体积的灭菌水。
培养基准备与接种：采用琼脂稀释法。取上述各稀释液1ml，分别加到无菌平皿内，倾注9mlM.H琼脂培养基，另外设二个不含药的培养基，作为空白对照组和菌对照组，用多点接种仪定量接种，每点接种105CFU，于37℃恒温培倒置培养22小时后，观察并记录结果。
白色念珠菌：取上述各稀释液1ml，分别加到无菌平皿内，倾注9ml改良马丁琼脂培养基，另外设二个不含药的培养基，作为空白对照组和菌对照组，用多点接种仪定量接种，每点接种105CFU，于35℃恒温培倒置培养48小时后，观察并记录结果。
肠球菌、肺炎双球菌、肺炎杆菌：取上述各稀释液1ml，分别加到无菌平皿内，倾注9ml M.H琼脂培养基(血)，另外设二个不含药的培养基，作为空白对照组和菌对照组，用多点接种仪定量接种，每点接种105CFU，于35℃恒温培倒置培养48小时后，观察并记录结果。试验结果以药物抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度(MIC)。结果见表22。
表22样品抗菌活性MIC(mg/ml)
裸花紫珠药效标准提取物较裸花紫珠颗粒、甲硝唑片的体外抗菌活性更强。
实施例10
实验条件：给药前后，各组大鼠均分笼饲养，喂饲全价营养颗粒饲料，自由饮水，室温22±2℃，湿度55-65％。
实验方法：取体重180-220g SD大鼠60只，正常饲养3天后，雌雄各半，随机均分6组(n＝10)，分别为：
(1)空白对照组：等量NS，1ml/100g
(2)阳性对照药醋酸地塞米松片组：1mg/kg，0.1mg/ml，1ml/100g
(3)阳性对照药裸花紫珠颗粒组：生药4g/kg，0.4g/ml，1ml/100g
(4)药效标准提取物高剂量组:生药4g/kg,生药0.4g/ml，1ml/100g
(5)药效标准提取物中剂量组：生药2g/kg,生药0.2g/ml，1ml/100g
(6)药效标准提取物低剂量组：生药1g/kg,生药0.1g/ml，1ml/100g
以上各组动物分别灌胃给药7天，末次给药0.5h后，分别在大鼠左后肢足跖皮下注射1％角叉菜胶混悬液0.1ml/只，致炎后，每隔1h用测厚仪测量足跖厚度，连续6次，计算肿胀抑制率。不同样品对大鼠体重的影响(见表23),对角叉菜致大鼠足跖肿胀的影响和抑制率见表24、25。
表23不同样品对大鼠体重的影响
实验结果所示：灌服不同样品对大鼠的体重没有显著性影响。
表24不同样品对角叉菜致大鼠足跖肿胀的影响
与空白组比较*P<0.05,**P<0.01
表25不同样品对角叉菜致大鼠足跖肿胀的抑制率的影响
结果显示裸花紫珠药效标准提取物的抗炎作用较佳，优于裸花紫珠颗粒。
实施例11
实验条件：给药前后，各组小鼠均分笼饲养，喂饲全价营养颗粒饲料，自由饮水，室温22±2℃，湿度55-65％。
统计学方法：统计学处理数据用表示，采用t检验，用SPSS16.0统计软件进行统计分析。
实验方法：取体重为18～22g的小鼠210只，雌雄各半，随机均分21组(n＝10)，分别为：空白对照组：等量NS，0.2ml/10g，阳性对照药肾上腺色腙片组：0.75g/kg,0.0375g/ml，0.2ml/10g，阳性对照药裸花紫珠颗粒组；6g/kg,0.3g/ml，0.2ml/10g，裸花紫珠药效标准提取物高剂量组:6g/kg,0.3g/ml，0.2ml/10g，裸花紫珠药效标准提取物中剂量组：3g/kg,0.15g/ml，0.2ml/10g，裸花紫珠药效标准提取物低剂量组：1.5g/kg,0.067g/ml，0.2ml/10gk，空白对照组用生理盐水灌胃，其它组灌相应药物，各组每日给药1次，连续7d，于末次给药后30min，以利剪将小鼠尾尖0.5cm处横断，待血液自然流出后计时，每隔15s用滤纸吸去血滴1次，直至血液自然停止，秒表记录并计算出血时间，与对照组比较差异的显著性。裸花紫珠药效标准提取物对小鼠断尾出血模型体重和止血时间的影响实验结果见表26。
表26不裸花紫珠提取物对小鼠断尾出血模型体重和止血时间的影响
*P<0.05,**P<0.01，与空白组比较。
结果所示：裸花紫珠药效标准提取物高、中、低剂量组小鼠出血时间显著缩短，具有一定的止血作用，优于两个阳性药。

Claims (5)

1.一种裸花紫珠药效标准提取物，其特征在于总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分含量在92％～98％，其中苯丙烯酸类：黄酮类化合物百分含量比值为70±5％：30±10％；苯丙烯酸类：黄酮类化合物数目比值为25～35：8～16。
2.根据权利要求1所述的一种裸花紫珠药效标准提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将裸花紫珠药材粉末，用8～20倍量的10％～90％的乙醇水溶液混合，热回流提取次数1～4次，每次提取0.5h～2h，所得提取液合并；
(2)合并后的提取液用苯乙烯型非极性吸附树脂纯化，上样量为每1g干树脂上样总苯丙烯酸类、黄酮类5～15mg/g，上样浓度总苯丙烯酸类、黄酮类1～4mg/ml，吸附流速为2～5bv/h，洗脱量为2～5bv/h，洗脱浓度5～95％乙醇，得大孔树脂分离纯化提取物；
(3)大孔树脂分离纯化后提取物再经水饱和乙酸乙酯萃取1～3次，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取物；
(4)乙酸乙酯萃取物再经制备HPLC分离，除去小分子量的大极性成分和极性小的萜类成分，制备HPLC色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，其规格为外径10mm～300mm×柱长250mm～1500mm，填料粒径5μm～50μm，流动相体系为甲醇～甲酸水溶液或甲醇～乙酸水溶液或甲醇～磷酸水溶液或乙腈～甲酸水溶液或乙腈～乙酸水溶液或乙腈～磷酸水溶液，梯度洗脱，采用DAD检测器检测，210nm和250～350nm双波长检测，收集总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分洗脱液；
(5)总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分洗脱液，减压回收溶剂，65℃真空干燥，得到裸花紫珠叶药效标准提取物。
3.根据权利要求1所述的一种裸花紫珠药效标准提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将裸花紫珠药材粉末，用10～12倍量的60％～90％的乙醇水溶液混合，热回流提取次数3次，每次提取1h，所得提取液合并；
(2)合并后的提取液用AB-8树脂纯化，上样量为每1g干树脂上样总苯丙烯酸类、黄酮类10mg/g，上样浓度总苯丙烯酸类、黄酮类2.942mg/ml，吸附流速为3bv/h，洗脱量为3bv/h，洗脱浓度80％乙醇，得大孔树脂分离纯化提取物；
(3)大孔树脂分离纯化后提取物再经等量水饱和乙酸乙酯萃取1次，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取物；
(4)乙酸乙酯萃取物再经制备HPLC分离，制备HPLC色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，其规格为外径150mm×柱长600mm，填料粒径10μm，流动相A相为甲醇，B相为0.2％醋酸水溶液，梯度洗脱，流速300ml/min，柱温为室温，进样量70ml。洗脱程序如下所示：
采用DAD检测器检测，210nm和250～350nm双波长检测，收集总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分洗脱液；
(5)总苯丙烯酸类，黄酮类活性成分洗脱液，减压回收溶剂，65℃真空干燥，得到裸花紫珠叶药效标准提取物。
4.根据权利要求2或3所述的一种裸花紫珠药效标准提取物的制备方法，其特征在于大孔树脂分离纯化提取物中总苯丙烯酸类，黄酮类纯度大于60％。
5.根据权利要求2或3所述的一种裸花紫珠药效标准提取物的制备方法，其特征在于乙酸乙酯萃取物中总苯丙烯酸类，黄酮类纯度达到80％以上。
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