CN104873570A - 一种夏枯草总黄酮的提取纯化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种夏枯草总黄酮的提取纯化方法，步骤为：（1）取夏枯草药材粉碎过筛，加1-30倍量5-95%的乙醇，回流提取1-3次，每次1-5h，过滤，合并滤液，得提取液；（2）将所述提取液加热浓缩至浓度为0.05-0.5g/mL，再调节pH值为1-7，得上样液；（3）将所述上样液，上NKA-9大孔吸附树脂，用1-10BV水除杂后，再用1-10BV的10-95%乙醇洗脱；（4）连续多次经过步骤3的纯化工艺得富集物，减压干燥至粉末或浸膏，即得。本发明还提供夏枯草总黄酮在制备治疗肝癌药物中的应用，通过药理药效研究表明夏枯草总黄酮具有明显的抗肝肿瘤活性，并呈明显的量效关系，为开发以夏枯草总黄酮富集物为原料的具有广泛临床使用价值和商业开发价值的抗肝肿瘤新药和工业生产提供理论和实验依据。

Description

一种夏枯草总黄酮的提取纯化方法及其应用

技术领域

本发明涉及化学及医药技术领域，尤其涉及一种夏枯草总黄酮的提取纯化方法及其应用。

背景技术

癌症是一大类恶性肿瘤的统称，是当今世界上第一大严重威胁人类健康的疾病，多种诱发因素如环境污染、化学污染（化学毒素）、电离辐射、自由基毒素等都可导致癌症的发生。目前癌症的治疗包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、中医治疗等，这些治疗手段对癌症均有一定疗效，但是其作用效果有限，且放射治疗、化学治疗对正常组织损害也较大，因此，癌症的治疗仍然是人类面对的极大考验。中医药治疗癌症现在已经被国内外医疗专家广泛的认可，大量的临床试验及科研研究已经证实了中医治疗癌症的效果，无论在抑制或杀伤肿瘤细胞方面还是术后调理，减轻放、化疗不良反应，改善症状和体征，提高生存质量等方面，均发挥了重要的作用，因此，近年来中医中药在癌症的治疗方面日益被人们所关注。

夏枯草为唇形科植物夏枯草的干燥果穗，2010 版《中国药典》收载的中药材，始载于《神农本草经》。《神农本草经》言：“主寒热、瘰疬、鼠瘘、头疮，破症，散瘿结气，脚肿湿痹”；《本草通玄》：“夏枯草，补养厥阴血脉，又能疏通结气。目痛、瘰疬皆系肝症，故建神功。然久用亦防伤胃，与参、术同行，方可久服无弊”；《纲目》：“黎居士《易简方》，夏枯草治目疼，用沙糖水浸一夜用，取其能解内热，缓肝火也。楼全善云，夏枯草治目珠疼至夜则甚者，神效，或用苦寒药点之反甚者，亦神效。盖目珠连目本，肝系也，属厥阴之经。夜甚及点苦寒药反甚者，夜与寒亦阴故也。夏枯禀纯阳之气，补厥阴血脉，故治此如神，以阳治阴也”。从古代各家本草对其性状、产地、用途等方面进行考证与目前习用的夏枯草，即主要为含黄酮类及三萜皂苷类等物质相符。临床上夏枯草用于淋巴结核、甲状腺肿、乳痈、头目眩晕、口眼歪斜、筋骨疼痛、肺结核、血崩、带下、急性传染性黄疸型肝炎及细菌性痢疾等疾病的治疗；而有关其有效成分之一总黄酮富集物的高纯度纯化方法、抗肝肿瘤活性研究迄今为止尚未见报道。

夏枯草中黄酮类化合物作为其中主要的活性成分，具有广泛的生物活性，在心血管系统、中枢神经系统、血液系统、免疫系统、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等方面都有较显著的疗效，但其生物活性的研究主要集中在抗氧化活性方面。夏枯草化学成分复杂，除黄酮类化合物，还含有其它类多种化学成分，主要有黄酮类、三萜皂苷类、苯丙素、甾体、有机酸、挥发油及糖等。因此，药材提取液中含有大量非黄酮类杂质，不利于阐明药效物质组分和作用机制，难以投入到新药的研发中，故对夏枯草总黄酮纯化方法的研究具有现实意义。根据文献报道，对夏枯草中总黄酮富集纯度未达到90%以上，不利于研究其发挥药效的物质基础、作用机制及其药效组分的解析和表征，很难将其研发成临床新药。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种夏枯草总黄酮的提取纯化方法及其应用，该方法使夏枯草中总黄酮富集物纯度达到94%以上，用于制备治疗肝癌的药物。

为实现本发明的上述目的，本发明提供一种夏枯草总黄酮的提取纯化方法，包括以下步骤。

步骤1、取夏枯草药材粉碎过筛，加1-30倍量5-95%的乙醇，回流提取1-3次，每次1-5 h，过滤，合并滤液，作为提取液，备用。

步骤2、将步骤1中的提取液，加热浓缩至浓度为0.05-0.5 g/mL，再用HCl和NaOH溶液调节pH值为1-7，作为上样液。

步骤3、上样液纯化：将步骤2中的上样液，上NKA-9大孔吸附树脂，所述夏枯草药材与树脂用量比为0.1-1.0 g/mL，用1-10 BV水除杂后，再用1-10BV的10-95%乙醇洗脱。

步骤4、连续多次经过步骤3的纯化工艺得富集物，将富集物减压干燥至粉末或浸膏，即得。

本发明还提供夏枯草总黄酮在制备治疗肝癌药物中的应用。

所述夏枯草总黄酮可加入药学上可接受的辅料或载体，制成不同剂型的治疗肝癌的药物。

与现有技术相比本发明的有益效果。

本发明提供夏枯草总黄酮的提取纯化方法及其应用，该方法从夏枯草干燥果穗中提取纯化总黄酮富集物，纯度达到94%以上，可以有效排除杂质对药效成分的干扰并且为药效物质组分的解析及阐明其作用机制奠定基础；通过药理药效研究表明夏枯草总黄酮具有明显的抗肝肿瘤活性，并呈明显的量效关系，同时纯度增加，可减小服用剂量、降低不良反应，为研究其发挥药效的物质基础及作用机制奠定基础，扩大了夏枯草的应用范围；同时为开发以夏枯草总黄酮富集物为原料的具有广泛临床使用价值和商业开发价值的抗肝肿瘤新药和工业生产提供理论和实验依据。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。

1、夏枯草总黄酮提取工艺研究。

1.1单因素水平考察。

表1：夏枯草药材不同粉碎粒径提取总黄酮的含量（%）。

粉碎粒径	20目	40目	60目	80目
					总黄酮含量（%）	1.34	3.71	6.61	4.20

由表1可知，将夏枯草药材粉碎至通过60目药筛，提取液总黄酮含量较高，因此，确定提取粒径为60目。

表2：夏枯草总黄酮不同提取方法考察结果。

方法	超声提取法	回流提取法
			总黄酮含量（%）	8.45	16.23

由表2可知，回流法提取夏枯草总黄酮含量高于超声提取法，故确定回流提取法为夏枯草总黄酮的最佳提取方法。

1.2正交试验设计。

选择提取时间A、提取次数B、溶剂用量C、醇浓度D四个因素，对主要影响因素各取三个水平，进行L₉(3⁴)正交试验考察。以总黄酮含量为考察指标，优选其最佳提取方法。正交试验L₉(3⁴)因素水平表见表3，正交试验设计表及直观分析结果见表4，以总黄酮为指标正交试验方差分析结果见表5。

表3：正交试验L₉(3⁴)因素水平表。

水平	提取时间A（h）	提取次数B	溶剂用量C（倍）	醇浓度D（%）
					1	1	1	10	60
2	1.5	2	15	70
					3	2	3	20	80

表4：正交实验设计表及直观分析结果。

序号	A	B	C	D	总黄酮含量（%）
						1	1	1	10	60	19.312
2	1	2	15	70	23.314
						3	1	3	20	80	26.977
4	1.5	1	15	80	20.675
						5	1.5	2	20	60	30.765
6	1.5	3	10	70	28.655
						7	2	1	20	70	23.743
8	2	2	10	80	25.160
						9	2	3	15	60	26.948
1	23.202	21.243	24.376	25.675
						2	26.698	26.143	23.646	25.237
3	25.284	27.527	27.162	24.271
						R	3.497	6.284	3.516	1.404

表5：以总黄酮为指标正交试验方差分析。

因素	偏差平方和	自由度	F比	F临界值	显著性
						提取时间A	18.570	2	5.994	19.000
提取次数B	67.446	2	21.771	19.000	*
						溶剂用量C	20.657	2	6.668	19.000
醇浓度D	3.098	2	1.000
						误差	3.10	2

注：F_0.05=19.00；*为P<0.05。

由表4、5可知，以总黄酮含量为指标，直观分析及方差分析影响总黄酮提取方法的因素顺序为B>C>A，提取次数有显著性差异，且提取次数3>2>1，以此增加因素提取次数B的其它三个水平，即4次、5次、6次，采用20倍量60%乙醇，每次提取1.5 h进行提取，以总黄酮含量为考察指标，结果见表6。

 表6：以总黄酮为指标因素B提取次数结果。

提取次数B	3次	4次	5次	6次
					总黄酮含量（%）	35.602	35.837	36.332	36.410

由表6可知，提取次数4次、5次、6次对总黄酮含量差别影响不大，故综合考虑提取效率、耗时、费用，确定提取次数采用3次，以此筛选出最佳提取条件为A₂B₃C₃D₁，即以20倍量60%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h。

2、夏枯草中总黄酮纯化工艺研究。

2.1树脂静态吸附与解吸试验。

按照总黄酮的最优提取方法即以20倍量60%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h，制成0.1g/mL生药浓度的上样溶液。

表7：不同树脂对各有效成分静态饱和吸附量和解吸能力。

树脂类型	极性	饱和吸附量（mg/g）	解吸率（%）
				AB-8	弱极性	69.37	38.40
X-5	弱极性	81.46	69.94
				HPD400	中极性	76.71	58.05
HPD450	中极性	79.22	59.98
				HPD100	非极性	80.37	63.83
HPD300	非极性	86.10	55.89
				HPD700	非极性	75.45	60.49
D101	非极性	63.14	46.38
				ADS-7	强极性	55.08	20.76
HPD600	极性	82.99	32.35
				聚酰胺	极性	59.96	28.78
NKA-9	极性	92.74	86.21

由表7可知，各树脂的静态饱和吸附量、解吸率有一定差别，均衡考虑各树脂对药液的吸附量及解吸率，NKA-9树脂的饱和吸附量和解析率均相对较高，故最终确定大孔吸附树脂类型为NKA-9树脂。

2.2上样液pH对树脂静态吸附和解吸效果的考察。

将NKA-9型大孔吸附树脂用乙醇浸泡过24 h，抽滤至干，精密称取1 g至25 mL锥形瓶中，再用水洗至无醇味。其它条件一致的前提下，用HCl和NaOH将夏枯草提取溶液分别调成pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，于各锥形瓶中精密加入0.1 g/mL不同pH值的样品溶液30 mL，于37℃下振荡24 h至吸附平衡，过滤，取续滤液用紫外分光光度法测定吸附液中总黄酮的含量，计算饱和吸附量。将已吸附夏枯草总黄酮的树脂分别抽滤至干以除去水溶液，用95%乙醇 30 mL37℃下振荡解吸附24h至解吸平衡，测定解吸液中夏枯草总黄酮的含量，计算解吸率。pH为2、3时饱和吸附量和解析率均较高，考虑到极端酸性对黄酮结构的稳定性产生影响，最终确定上样液pH为3。

2.3树脂动态吸附与解吸试验。

2.3.1上样浓度的考察。

按照上述优选出的NKA-9树脂及上样液pH为3的条件下，取6份0.1 g/mL的上样溶液，按照浓度为0.05、0.1、0.125、0.2、0.25、0.3分别稀释或浓缩成40 mL上样，以2 BV/h的流速进行动态吸附，测定流出液中总黄酮的含量。结果当生药浓度为0.1 g/mL时，NKA-9吸附较夏枯草其它几个浓度的高，在此浓度下生产效率和总黄酮的吸附量均较高，因此确定最佳上样浓度为0.1 g/mL。

2.3.2泄漏曲线的考察。

取处理好的湿树脂10 mL，加入0.1 g药材/mL的提取液，上柱流速调节为2 BV/h（每小时2倍树脂柱体积）进行动态吸附，收集流出液，流出液每10 mL收集一管，共收集18管，测定流出液中总黄酮的含量。当上样至第10份时流出液中总黄酮含量显著增大，说明此时总黄酮开始明显泄漏，故确定数值最大上样量为第9份，即树脂比上柱量为0.9 g·mL^-1（原药材／湿树脂）。

2.3.3解吸液浓度考察。

取6份供试品溶液加于10 mL NKA-9柱上，控制吸附流速为2 BV/h，分别100 mL的10、30、50、70、80、90%乙醇洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液，定容至25 mL容量瓶中，测定总黄酮含量。结果表明，用80%乙醇洗脱时，洗脱液中总黄酮含量最大，纯度最高，因此确定最佳洗脱醇浓度为80%乙醇洗脱。

2.3.4洗脱醇用量的考察。

取供试品溶液，加于NKA-9树脂柱上，待吸附结束后，用80%乙醇洗脱，流速为2 BV/h，每10 mL收集一份洗脱液，共收集10份，测定洗脱液中总黄酮的含量。结果表明，当洗脱液达到6 BV时，已基本将总黄酮洗脱完全，故确定解吸液用量为6 BV的80%乙醇洗脱。

2.3.5冲洗杂质用水体积对纯度的影响。

按上述试验条件下取4份供试品溶液，以流速为2 BV/h上柱，过柱完后分别用3、4、5、6水冲洗后用6 BV的80%乙醇洗脱，分别测定洗脱液中总黄酮的含量。可知，吸附后用水冲洗对已吸附的黄酮造成一定量的损失，水洗体积越大，损失率越大，但水洗可出去杂质，提高总黄酮的纯度，但当水洗体积大于5 BV时，总黄酮纯度下降，可能此时杂质已洗脱完全，再增加洗脱水的体积，总黄酮含量下降，反而使总黄酮纯度下降，水洗体积为4 BV适宜。

2.3.6确定的最佳提取纯化方法。

本实施例1提供夏枯草总黄酮的提取纯化方法，包括以下步骤。

步骤1、取夏枯草药材粉碎，过60目药筛，混匀，加20倍量60%的乙醇，水浴回流提取3次，每次1.5 h，过滤，合并滤液，作为提取液，备用。

步骤2、将步骤1中的提取液，回收乙醇，用水定容使浓度为0.1 g药材/mL，再用HCl和NaOH溶液调节pH值为3，作为上样液。

步骤3、上样液纯化：将步骤2中的上样液，上NKA-9大孔吸附树脂，所述夏枯草药材与树脂用量比为0.9 g/mL，上柱速度为2 BV/h，先用4 BV水除杂，弃去水洗液，再用6 BV 80%乙醇洗脱，洗脱流速为2 BV/h。一次纯化后总黄酮的纯度为77.65%左右。

2.3.7夏枯草总黄酮的二、三次纯化。

由于经过大孔吸附树脂一次纯化后的夏枯草总黄酮富集物的纯度大于70%，因此采用连续过树脂的方法将洗脱液按最佳纯化工艺条件进行二、三次纯化，经过三次纯化后总黄酮纯度大于94%。

即步骤4、连续三次经过步骤3的纯化工艺得富集物，将富集物减压干燥至粉末或浸膏，即得。

2.3.8纯化工艺、总黄酮回收率重现性实验。

精密称取3份夏枯草药材粉末，按照最佳的提取纯化方法进行提取纯化，并按照比色法测定总黄酮的含量，计算总黄酮的纯度和总黄酮的回收率，结果显示该纯化提取方法稳定、可靠、较理想，结果见表8、表9。

表8：纯化工艺重现性试验。

	1	2	3	平均值%	RSD%
						总黄酮纯度(%)	94.34	93.85	94.16	94.26	0.24

表9：夏枯草总黄酮回收率重现性实验。

	1	2	3	平均值%	RSD%
						纯化一次(%)	91.46	93.43	92.87	92.59	1.10
纯化二次(%)	81.22	83.51	82.63	82.45	1.40
						纯化三次(%)	72.41	74.56	74.22	73.73	1.57

3、夏枯草总黄酮纯化前后体外药效对比研究。

体外抑制人肝癌SMMC-7721细胞实验：取对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，用培养基制备成 5×10⁴个细胞/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μL。37℃、5%CO₂及饱和湿度下培养细胞24 h。在保证生药量一致的前提下，分别加入最优提取纯化方法下的提取物（即纯化前总黄酮）和纯度大于90%的富集纯化物（即纯化后总黄酮）低、中、高剂量（200，400，600 mg·L^-1）100μL。将每组设5个复孔，将正常肝癌细胞组作为空白对照组，调零对照组加等量新鲜培养液，37℃、5%CO₂及饱和湿度下继续培养24 h后，每孔加入20μL新配制的5 mg·mL^-1 MTT（四甲基偶氮唑盐），置37℃的CO₂培养箱内培养4h后，吸弃上清液，加入150μL的二甲基亚砜（DMSO），摇床上振摇10 min后，用酶标仪于492 nm处测吸光度值（OD值），取5孔平均值，计算抑制率，结果如表10所示。计算公式为：细胞抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。

表10：纯化前后总黄酮对细胞抑制率的影响。

组别	纯化前总黄酮的细胞抑制率（%）	纯化后总黄酮的细胞抑制率（%）
			低剂量	24.43	41.74
中剂量	42.36	78.17
			高剂量	64.83	83.62

由表10可知，夏枯草总黄酮能明显抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖，在保证生药量一致的前提下，纯化后的总黄酮细胞抑制率明显高于纯化前，即随着剂量的增加，细胞抑制率也随之增加，抑制作用与剂量呈明显的剂量效应关系。本发明优选出的提取纯化方法不仅使总黄酮纯度提高到94%以上，纯度的增加提高了药效，同时减小了用药剂量，便于临床制成不同剂型给药，扩大了夏枯草的应用范围，为抗肝肿瘤新药的开发提供理论依据。

Claims (7)

1.一种夏枯草总黄酮的提取纯化方法，包括以下步骤：

步骤1、取夏枯草药材粉碎过筛，加1-30倍量5-95%的乙醇，回流提取1-3次，每次1-5 h，过滤，合并滤液，作为提取液，备用；

步骤2、将步骤1中的提取液，加热浓缩至浓度为0.05-0.5 g/mL，再调节pH值为1-7，作为上样液；

步骤3、上样液纯化：将步骤2中的上样液，上NKA-9大孔吸附树脂，用1-10 BV水除杂后，再用1-10BV的10-95%乙醇洗脱；

步骤4、连续多次经过步骤3的纯化工艺得富集物，将富集物减压干燥至粉末或浸膏，即得。

2.如权利要求1所述的夏枯草总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤2中采用HCl和NaOH溶液调节pH值为1-7。

3.如权利要求1所述的夏枯草总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤3中夏枯草药材与树脂用量比为0.1-1.0 g/mL。

4.如权利要求1所述的夏枯草总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，所述纯化工艺的次数为三次。

5.如权利要求1所述的夏枯草总黄酮的提取纯化方法，其特征在于，所述连续三次纯化工艺后得到的夏枯草总黄酮纯度大约达到94%以上。

6.夏枯草总黄酮在制备治疗肝癌药物中的应用。

7.如权利要求1所述的夏枯草总黄酮的应用，其特征在于，所述夏枯草总黄酮可加入药学上可接受的辅料或载体，制成不同剂型的治疗肝癌的药物。