CN111548332A - 一种萜酚类化合物no95及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种萜酚类化合物NO95及其制备方法和应用,所述化合物分子式为C21H28O3,分子量为328.45,该化合物具有良好的抗肿瘤细胞增值活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种萜酚类化合物NO95及其 制备方法和应用。
背景技术
麻类植物是一种化学型复杂的植物,主要是因其自身含有许多天然化学 成分。截至1980年,从麻类植物中分离出来的化合物共有432种,到1995 年增加至483种,2005年增加至490种。据统计,至今从麻类植物中分离得 到的化合物共有565种,分为植物大麻素和非大麻素两大类,已报道的植物 大麻素有120种。
麻类植物的生物活性是众所周知,随着大麻素受体的发现,存在探索大 麻作为新治疗剂来源的机会。也存在越来越多的罹患诸如癌症等严重疾病寻 求天然药物作为替代或补充疗法的患者,用于癌症或其它症状的新治疗存在 持续需求。
不同的生活习惯和环境因素等导致癌症的发生率逐年增高,一些肿瘤发 现时已是晚期并很难治愈。由于癌症发病率高且难以治愈,所以对于麻类植 物中活性成分的筛选具有很重要的意义。同时,对“内源性大麻素”系统认识的 进步使得开发大麻素类药物治疗晚期癌症成为可能。
酚类化合物因结构中取代基不同导致构效关系复杂、抗肿瘤活性差异大, 主要集中在羟基的位置和数量、双键的位置上。酚类化合物诱导上游炎性因 子的表达来促进肿瘤细胞凋亡,产生抗肿瘤活性。目前广泛应用的肿瘤细胞 抑制剂有顺铂、紫杉醇和吉西他滨等。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是提供一种萜酚类化合物NO95及其制备方法 和应用,所述化合物分子式为C21H28O3,分子量为328.45,该化合物具有良 好的抗肿瘤细胞增值活性。
本发明采取的具体技术方案是:
一种萜酚类化合物NO95,具有式I所示结构:
本发明还提供了式I所示化合物的制备方法,包括如下步骤:
(1)对麻类植物花序依次进行二氧化碳超临界萃取、乙醇萃取,得到粗 提物浸膏;
(2)将得到的粗提物浸膏用石油醚充分溶解,得可溶性组分;
(3)取步骤(2)制得的可溶性组分上正相硅胶柱色谱进行层析,所述 正相硅胶柱色谱以正己烷/乙酸乙酯=99:1为洗脱剂进行等度洗脱,得含有目标 化合物的一级组分;
(4)取含有目标化合物的一级组分上大孔吸附树脂柱色谱进行层析,所 述大孔吸附树脂柱色谱采用D101大孔吸附树脂柱,以40%-80%乙醇/水为洗 脱剂进行梯度洗脱,合并含有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的二级 组分;
(5)取含有目标化合物的二级组分上一级中压正相硅胶柱色谱进行层 析,所述一级中压正相硅胶柱色谱以三氯甲烷/乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗 脱,合并含有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的三级组分;
(6)取含有目标化合物的三级组分上二级中压反相硅胶柱色谱进行层 析,所述二级中压反相硅胶柱色谱以甲醇/水为洗脱剂进行梯度洗脱,合并含 有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的四级组分;
(7)取含有目标化合物的四级组分,上三级中压正相硅胶柱色谱进行层 析,所述三级中压正相硅胶柱色谱以正己烷/乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱, 合并含有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的五级组分;
(8)取含有目标化合物的五级组分上高压反相HPLC色谱进行层析, 所述高压反相HPLC色谱以乙腈/水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,合并含有相 似组分的洗脱剂,得到式I所示化合物。
优选地,二氧化碳超临界萃取条件为:P萃取釜=30MPa,T萃取釜=45℃;P分离釜I=8MPa,T分离釜I=45℃;P分离釜II=6MPa,T分离釜II=35℃;
优选地,乙醇萃取时乙醇的使用量为麻类植物花序重量的20%,萃取时 间为45min。
本发明还提供了式I所示化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。
相应地,本发明提供了一种肿瘤细胞增殖抑制剂药物,其特征在于,包 括活性成分和药学上可接受的辅料,所述活性成分包括式I所示化合物。
本发明还提供了式I所示化合物在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的应 用。
相应地,本发明提供了一种抗肿瘤药物,包括活性成分和药学上可接受 的辅料,所述活性成分包括式I所示化合物。
优选地,上述肿瘤疾病为肝癌或肺癌。
优选地,上述药物为口服制剂或注射制剂,所述口服制剂选自滴丸、片 剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液剂中的一种;所述注射制剂选自注射液或粉针 剂。
本发明的有益效果是:本发明式I所示化合物纯度高,稳定性好,且具备 良好的生物活性。通过体外细胞水平相关实验检测,发现其具有抑制肿瘤细 胞增殖的活性,具备开发抗肿瘤药物的潜力。
附图说明
图1显示为式I所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)存活率的影响(MTT 法);
图2显示为式I所示化合物对人肺癌细胞(A549)存活率的影响(CCK8 法);
图3显示为式I所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)存活率的影响(MTT 法);
图4显示为式I所示化合物对人肺癌细胞(A549)存活率的影响(CCK8 法);
图5显示为式I所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)克隆形成的影响;
图6显示为式I所示化合物对人肺癌细胞(A549)克隆形成的影响;
图7显示为式I所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)的抑制曲线;
图8显示为式I所示化合物对人肺癌细胞(A549)的抑制曲线。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果,以下 结合具体实施例并配合附图详予说明。
本发明提供了一种萜酚类化合物NO95,化学结构式、英文命名、分子式 及分子量如下:
实施例1
式I所示化合物NO95的制备方法,包括如下步骤:
(1)对麻类植物花序依次进行二氧化碳超临界萃取、乙醇萃取,得到粗 提物浸膏;二氧化碳超临界萃取条件为:P萃取釜=30MPa,T萃取釜=45℃;P分离釜I=8MPa,T分离釜I=45℃;P分离釜II=6MPa,T分离釜II=35℃;乙醇萃取时乙醇的使 用量为麻类植物花序重量的20%,萃取时间为45min。
(2)将得到的粗提物浸膏用石油醚充分溶解,得可溶性组分;
(3)取步骤(2)制得的可溶性组分上正相硅胶柱色谱进行层析,所述 正相硅胶柱色谱以正己烷/乙酸乙酯=99:1为洗脱剂进行等度洗脱,得含有目标 化合物的一级组分;
(4)取含有目标化合物的一级组分上大孔吸附树脂柱色谱进行层析,所 述大孔吸附树脂柱色谱采用D101大孔吸附树脂柱,以40%-80%乙醇/水为洗 脱剂进行梯度洗脱,合并含有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的二级 组分;
(5)取含有目标化合物的二级组分上一级中压正相硅胶柱色谱进行层 析,所述一级中压正相硅胶柱色谱以三氯甲烷/乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗 脱,合并含有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的三级组分;
(6)取含有目标化合物的三级组分上二级中压反相硅胶柱色谱进行层 析,所述二级中压反相硅胶柱色谱以甲醇/水为洗脱剂进行梯度洗脱,合并含 有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的四级组分;
(7)取含有目标化合物的四级组分,上三级中压正相硅胶柱色谱进行层 析,所述三级中压正相硅胶柱色谱以正己烷/乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱, 合并含有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的五级组分;
(8)取含有目标化合物的五级组分上高压反相HPLC色谱进行层析,所述 高压反相HPLC色谱以乙腈/水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,合并含有相似组 分的洗脱剂,得到目标化合物,将目标化合物进行1H和13C核磁共振检测, 并结构解析为式I化合物。经Sci Finder检索后,发现式I化合物为尚未报到 过的化合物。式I化合物1H和13C核磁共振信息如下: 1HNMR(850MHz,Chloroform-d)δ7.19(1H,d,J=1.8Hz,H-7″),6.87(1H,s,H-2),6.53(1H,s,H-4),2.64(2H, t,J=7.6Hz,H-1′),2.47(2H,t,J=7.5Hz,H-4″),2.07(3H,d,J=2.1Hz,H-6″),1.89(3H,d,J=2.1Hz,H-9″), 1.65(3H,d,J=2.3Hz,H-10″),1.64(4H,m,H-2′,3″),1.34(4H,m,H-3′,4′),0.89(3H,td,J=7.0,2.0Hz,H-5′). 13C NMR(214MHz,Chloroform-d)δ209.44(C-5″),156.69(C-1),150.27(C-5),141.61(C-3),139.46(C-7″), 134.68(C-8″),123.43(C-2″),119.60(C-1″),114.14(C-6),109.37(C-4),103.69(C-2),41.56(C-4″),36.28(C-1′), 31.64(C-3′),31.42(C-2′),30.18(C-6″),29.36(C-3″),22.67(C-10″),22.65(C-4′),20.32(C-9″),14.15(C-5′).
实施例2
式I所示化合物NO95的抗肿瘤活性鉴定
药物:实施例1制备的式I所示化合物NO95。
(1)MTT比色法检测式I所示化合物对肿瘤细胞存活性能的影响
取对数生长期人肝癌细胞(HepG2),用DMEM培养液配制适宜浓度细 胞悬液,细胞密度约70000个/mL(即每100μL培养液中约含7000个细胞), 以每孔100μL细胞悬液将细胞接种于96孔板,37℃培养箱中培养至细胞贴壁。 以DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I所示化合物溶液,实验时用培养 液稀释至所需工作浓度。96孔板弃培养液后,实验组分别加入工作浓度为20 μg/mL、40μg/mL的式I所示化合物溶液100μL,空白对照组加入培养液100 μL,阳性对照组加入浓度为10μg/mL的抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)溶液100μL, 将96孔板继续放置培养箱中24h后用MTT试剂检测细胞存活率,实验重复3 次取平均值。
结果如图1所示,随着式I所示化合物浓度的升高,人肝癌细胞(HepG2) 的存活率越低,即式I所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)存活性能的抑制作 用越强。
取对数生长期人肺癌细胞(A549),用DMEM培养液配制适宜浓度细胞 悬液,细胞密度约70000个/mL(即每100μL培养液中约含7000个细胞), 以每孔100μL细胞悬液将细胞接种于96孔板,37℃培养箱中培养至细胞贴壁。 以DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I所示化合物溶液,实验时用培养 液稀释至所需工作浓度。96孔板弃培养液后,实验组分别加入工作浓度为20 μg/mL、40μg/mL的式I所示化合物溶液100μL,空白对照组加入培养液100 μL,阳性对照组加入浓度为10μg/mL的抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)溶液100μL, 将96孔板继续放置培养箱中24h后用MTT试剂检测细胞存活率,实验重复 3次取平均值。
结果如图2所示,随着浓度的升高,人肺癌细胞(A549)的存活率越低, 即式I所示化合物对人肺癌细胞(A549)存活性能的抑制作用越强。
(2)CCK8比色法检测式I所示化合物对肿瘤细胞存活性能的影响
取对数生长期人肝癌细胞(HepG2),用DMEM培养液配制适宜浓度细 胞悬液,细胞密度约70000个/mL(即每100μL培养液中约含7000个细胞), 以每孔100μL细胞悬液将细胞接种于96孔板,37℃培养箱中培养至细胞贴壁。 以DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I所示化合物溶液,实验时用培养 液稀释至所需工作浓度。96孔板弃培养液后,实验组分别加入工作浓度为20 μg/mL、40μg/mL的式I所示化合物溶液100μL,空白对照组加入培养液100 μL,阳性对照组加入浓度为10μg/mL的抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)溶液100μL, 将96孔板继续放置培养箱中24h后用CCK8试剂检测细胞存活率,实验重复 3次取平均值。
结果如图3所示,随着式I所示化合物浓度的升高,人肝癌细胞(HepG2) 的存活率越低,即式I所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)存活性能的抑制作 用越强。
取对数生长期人肺癌细胞(A549),用DMEM培养液配制适宜浓度细胞 悬液,细胞密度约70000个/mL(即每100μL培养液中约含7000个细胞), 以每孔100μL细胞悬液将细胞接种于96孔板,37℃培养箱中培养至细胞贴壁。 以DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I所示化合物溶液,实验时用培养 液稀释至所需工作浓度。96孔板弃培养液后,实验组分别加入工作浓度为20 μg/mL、40μg/mL的式I所示化合物溶液100μL,空白对照组加入培养液100 μL,阳性对照组加入浓度为10μg/mL的抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)溶液100μL, 将96孔板继续放置培养箱中24h后用CCK8试剂检测细胞存活率,实验重复 3次取平均值。
结果如图4所示,随着浓度的升高,人肺癌细胞(A549)的存活率越低, 即式I所示化合物对人肺癌细胞(A549)存活性能的抑制作用越强。
(3)细胞克隆形成实验检测式I所示化合物对肿瘤细胞增殖的影响
取对数生长期人肝癌细胞(HepG2),用DMEM培养液配制适宜浓度细 胞悬液,细胞密度约117个/mL(即每1mL培养液中约含117个细胞),以每 孔3mL细胞悬液将细胞接种于6孔板,37℃培养箱中培养至细胞贴壁。以 DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I所示化合物溶液,实验时用培养液稀 释至所需工作浓度。6孔板弃培养液后,实验组分别加入工作浓度为20μg/mL、 40μg/mL的式I所示化合物溶液3mL,空白对照组加入培养液3mL,将6 孔板继续放置培养箱中,每2-3天更换新鲜的培养液或含药物的培养液,持续 培养两周左右,持续观察细胞形态,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终 止培养。弃培养液,用PBS小心浸洗2次,加入4%多聚甲醛(PFA)1mL 固定细胞30min。弃PFA后每孔加入1mL0.1%的结晶紫染色30min,超纯水 洗去染色液,6孔板晾干后拍照(图5)并计算克隆形成率。
结果如图5所示,随着浓度的升高,人肝癌细胞(HepG2)的克隆形成率 越低,即式I所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)增殖性能的抑制作用越强。
取对数生长期人肺癌细胞(A549),用DMEM培养液配制适宜浓度细胞 悬液,细胞密度约117个/mL(即每1mL培养液中约含117个细胞),以每孔 3mL细胞悬液将细胞接种于6孔板,37℃培养箱中培养至细胞贴壁。以DMSO 为溶剂配制浓度20mg/mL的式I所示化合物溶液,实验时用培养液稀释至所 需工作浓度。6孔板弃培养液后,实验组分别加入工作浓度为20μg/mL、40 μg/mL的式I所示化合物溶液3mL,空白对照组加入培养液3mL,将6孔板 继续放置培养箱中,每2-3天更换新鲜的培养液或含药物的培养液,持续培养 两周左右,持续观察细胞形态,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培 养。弃培养液,用PBS小心浸洗2次,加入4%多聚甲醛(PFA)1mL固定细 胞30min。弃PFA后每孔加入1mL0.1%的结晶紫染色30min,超纯水洗去染 色液,6孔板晾干后拍照(图6)并计算克隆形成率。
结果如图6所示,随着浓度的升高,人肺癌细胞(A549)的克隆形成率 越低,即式I所示化合物对人肺癌细胞(A549)增殖性能的抑制作用越强。
(4)式I所示化合物对肿瘤细胞24小时半抑制浓度(IC50值)的测定
取对数生长期人肝癌细胞(HepG2),用DMEM培养液配制适宜浓度细 胞悬液,细胞密度约70000个/mL(即每100μL培养液中约含7000个细胞), 以每孔100μL细胞悬液将细胞接种于96孔板,37℃培养箱中培养至细胞贴壁。 以DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I所示化合物溶液,实验时用培养 液稀释至所需工作浓度。96孔板弃培养液后,实验组分别加入工作浓度为 1.857μg/mL、3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL的式 I所示化合物溶液100μL,空白对照组加入培养液100μL,阳性对照组加入浓 度为10μg/mL的抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)溶液100μL,将96孔板继续放 置培养箱中24h后用CCK8试剂检测细胞存活率,实验重复3次取平均值。 通过GraphPad Prism软件绘制剂量抑制曲线,并计算出式I所示化合物对肿 瘤细胞的IC50值。如图7所示,式I所示化合物对人肝癌细胞(HepG2)的抑 制率随着浓度的增加曲线逐渐变得平缓,且随着浓度的升高,肿瘤细胞抑制 率升高,呈现递增关系。
取对数生长期人肺癌细胞(A549),用DMEM培养液配制适宜浓度细胞 悬液,细胞密度约70000个/mL(即每100μL培养液中约含7000个细胞),以 每孔100μL细胞悬液将细胞接种于96孔板,37℃培养箱中培养至细胞贴壁。 以DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I所示化合物溶液,实验时用培养 液稀释至所需工作浓度。96孔板弃培养液后,实验组分别加入工作浓度为 1.857μg/mL、3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL的式 I所示化合物溶液100μL,空白对照组加入培养液100μL,阳性对照组加入浓 度为10μg/mL的抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)溶液100μL,将96孔板继续放 置培养箱中24h后用CCK8试剂检测细胞存活率,实验重复3次取平均值。 通过GraphPad Prism软件绘制剂量抑制曲线,并计算出式I所示化合物对肿 瘤细胞的IC50值。如图8所示,式I所示化合物对人肺癌细胞(A549)的抑 制率随着浓度的增加曲线逐渐变得平缓,且随着浓度的升高,肿瘤细胞抑制 率升高,呈现递增关系。
需要说明的是,在本文中,诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来 将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示 这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、 “包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要 素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明 确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所 固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括……”或“包含……”限定 的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存 在另外的要素。此外,在本文中,“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本 数;“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述,但本领域内的技术人员一旦得知 了基本创造性概念,则可对这些实施例做出另外的变更和修改,所以以上所 述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利保护范围,凡是利用本 发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用 在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (9)
2.一种权利要求1所述的式I所示化合物的制备方法,其特征在于,
(1)对麻类植物花序依次进行二氧化碳超临界萃取、乙醇萃取,得到粗提物浸膏;
(2)将得到的粗提物浸膏用石油醚充分溶解,得可溶性组分;
(3)取步骤(2)制得的可溶性组分上正相硅胶柱色谱进行层析,所述正相硅胶柱色谱以正己烷/乙酸乙酯=99:1为洗脱剂进行等度洗脱,得含有目标化合物的一级组分;
(4)取含有目标化合物的一级组分上大孔吸附树脂柱色谱进行层析,所述大孔吸附树脂柱色谱采用D101大孔吸附树脂柱,以40%-80%乙醇/水为洗脱剂进行梯度洗脱,合并含有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的二级组分;
(5)取含有目标化合物的二级组分上一级中压正相硅胶柱色谱进行层析,所述一级中压正相硅胶柱色谱以三氯甲烷/乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱,合并含有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的三级组分;
(6)取含有目标化合物的三级组分上二级中压反相硅胶柱色谱进行层析,所述二级中压反相硅胶柱色谱以甲醇/水为洗脱剂进行梯度洗脱,合并含有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的四级组分;
(7)取含有目标化合物的四级组分,上三级中压正相硅胶柱色谱进行层析,所述三级中压正相硅胶柱色谱以正己烷/乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱,合并含有相似组分的洗脱剂,得含有目标化合物的五级组分;
(8)取含有目标化合物的五级组分上高压反相HPLC色谱进行层析,所述高压反相HPLC色谱以乙腈/水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,合并含有相似组分的洗脱剂,得到式I所示化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,二氧化碳超临界萃取条件为:P萃取釜=30MPa,T萃取釜=45℃;P分离釜I=8MPa,T分离釜I=45℃;P分离釜II=6MPa,T分离釜II=35℃;和/或
乙醇萃取时乙醇的使用量为麻类植物花序重量的20%,萃取时间为45min。
4.式I所示化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。
5.一种肿瘤细胞增殖抑制剂药物,其特征在于,包括活性成分和药学上可接受的辅料,所述活性成分包括式I所示化合物。
6.式I所示化合物在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
7.一种抗肿瘤药物,其特征在于,包括活性成分和药学上可接受的辅料,所述活性成分包括式I所示化合物。
8.根据权利要求4或6所述的应用,其特征在于,所述肿瘤疾病为肝癌或肺癌。
9.根据权利要求5或7所述的药物,其特征在于,所述药物为口服制剂或注射制剂,所述口服制剂选自滴丸、片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液剂中的一种;所述注射制剂选自注射液或粉针剂。
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