TWI685345B - 艾草萃取物用於抑制肺癌細胞的用途 - Google Patents

Abstract

一種艾草萃取物用於抑制肺癌細胞的用途，其中艾草萃取物係由艾蒿(Artemisia argyi)萃取而得，且此艾草萃取物的萃取過程包括下述步驟：先進行粗萃取步驟，以乙醇浸泡艾蒿的乾燥全草，獲得粗萃取物；再進行液相萃取步驟，將粗萃取物置入由乙酸乙酯/水所組成的萃取溶劑中進行分配程序以獲得萃取液。接著，進行純化步驟，使萃取液通過矽膠管柱層以獲得純化液，並將純化液區分為11份純化分液，且依照收集時間先後順序分別給予11份純化分液一個編號；其中艾草萃取物包括11份純化分液中的第3號純化分液，且第3號純化分液包括化合物capillene，其結構式為：

Description

艾草萃取物用於抑制肺癌細胞的用途

本揭露書是有關於一種艾草萃取物(Artemisia extraction)，特別是一種用於抑制肺癌細胞的艾草萃取物。

艾草為菊科蒿属(Artemisia)的多年生草本植物，葉子有香氣，可入藥。是中醫常用到的中草藥，其味苦、辛，性溫具有抗菌、祛痰、理氣血的功效。內服可做止血劑。亦供灸法上用，以艾草點燃之後薰、燙穴道，能散寒除濕，溫通氣血，通經活絡。傳統中藥材常用的艾草有青蒿(Artemisia carvifolia)、茵陳蒿(Artemisia capillaris Thunb.)、杜蒿(Artemisia japonica Thunb.)、黃花蒿(Artemisia annua L.)等。傳統西方的藥草應用，則是以艾草搭配薑泡製茶飲，可消除經痛，治療婦科疾病，還是治療消化疾病，憂鬱症的良方。民俗療法上使用，如具化痰、止咳、活血、止痛、誘導汗水、利尿、降壓、驅蟲、解毒和抗過敏等。

現代醫學已於艾草中分離出包含許多次級代謝產物，例如萜類、黃酮類、香豆素類、糖苷、固醇類和聚乙炔類。其成分被證明具有抗瘧疾、抗病毒、抗腫瘤、退熱、抗出血、抗凝血、抗心絞痛、抗氧化、抗肝炎、抗潰瘍、鎮痙、抗補體和干擾素誘導等作用。其中，黃花蒿內所含的青蒿素(artemisinin)，結構屬於倍半萜內酯，用於抗瘧疾、寄生蟲病、病毒感染和腫瘤。目前，青蒿素及其衍生物也已被證明有效對抗多種病毒、肺胞囊蟲、弓形蟲、B型肝炎、C型肝炎等及各種其他熱帶寄生蟲疾病，包括血吸蟲病、利什曼體病、南美錐蟲病、非洲昏睡病，等效果。

雖然，根據報導青蒿素可以用於治療由致癌病毒所誘導的腫瘤。然而，礙於病毒的抗藥性現象和劑量限制性毒性(dose-limiting toxicity，DLT)等問題，青蒿素在癌症的治療上仍然不能令人滿意。因此，有需要提供有效且較安全的艾草萃取物用於抑制肺癌細胞的用途及其萃取方法。

本說明書的一實施例是揭露一種艾草萃取物用於抑制肺癌細胞的用途，其中艾草萃取物係由艾蒿(Artemisia argyi)萃取而得，且此艾草萃取物的萃取過程包括下述步驟：先進行粗萃取步驟，以乙醇(ethanol)浸泡艾蒿的乾燥全草，獲得粗萃取物；再進行液相萃取步驟，將粗萃取物置入由乙酸乙酯(ethyl acetate)/水所組成的萃取溶劑中進行分配(partition)程序以獲得萃取液。接著，進行純化步驟，使萃取液通過矽膠管柱層 (silica gel column)以獲得純化液，並將純化液區分為11份純化分液，且依照收集時間先後順序分別給予11份純化分液一個編號；其中艾草萃取物包括11份純化分液中的第3號純化分液，且第3號純化分液包括化合物capillene，其結構式為：

。

根據上述實施例，本說明書是使用常見的艾草，例如青蒿、茵陳蒿、杜蒿、黃花蒿、細葉山艾、艾蒿或上述之任意組合為材料，從中萃取出具有抑制肺癌細胞生物活性以及誘導肺癌細胞進行細胞凋亡的複方萃取液及有效物質，可作為一種預防及治療肺癌之安全、無副作用的食品組合物或醫藥組合物。在本說明書的一些實施例中，此一複方萃取液可以有效抑制人類肺癌細胞株A549的生物活性，而化合物capillene是可以誘導人類肺癌細胞株A549進行細胞凋亡的有效物質之一。

本說明書是提供一種艾草萃取物用於抑制肺癌細胞的用途，可提供有效且較安全的萃取物和有效成分來抑制肺癌細胞。為了對本說明書之上述實施例及其他目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉下述較佳實施例，並配合所附圖式作詳細說明。

請參照第1圖，第1圖係根據一實施例所繪示之艾草萃取物的萃取流程方塊圖。艾草萃取物的萃取流程包括下述步驟：首先將乾燥的艾草全草剪碎(請參照步驟101)。在本說明書的一些實施例中，所謂的艾草可以是青蒿、茵陳蒿、杜蒿、黃花蒿、細葉山艾、艾蒿的乾燥全草或上述種類的任意組合。在本實施例中，是採用艾蒿的乾燥全草加以切碎，並磨成細粉。

之後，在室溫下採用乙醇進行粗萃取步驟，以獲得粗萃取物(請參照步驟102)。在本說明書的一些實施例中，粗萃取步驟是取磨成粉後的艾蒿，用乙醇浸泡萃取，並進行減壓濃縮後得到粗萃取物。在本實施例中，粗萃取步驟是取1927.61 g的艾蒿全草磨成粉後，用500 ml乙醇浸泡萃取5次。固液分離之後，採用台灣泛群科技有限公司(Panchum) 所生產的減壓濃縮機(Rotary Evaporator R-2000V)分離的液體進行減壓濃縮，得到163.17 g的粗萃取物。

接著對粗萃取物進行液相萃取步驟，以獲得萃取液(請參照步驟103)。在本書明書的一些實施例中，液相萃取步驟是將粗萃取物置入乙酸乙酯(ethyl acetate)/水所組成的萃取溶劑中進行分配(partition)。在本實施例中，是採用比例為1000/1000 ml的乙酸乙酯與水所組成的萃取溶劑，對萃取物進行分配3次，得到未濃縮乾燥的萃取液81.25 g，以及水層(未濃縮乾)。未濃縮的水層可以直接用正丁醇(n-Butanol)與水(400/400 ml)所組成的萃取溶劑再進行分配3次。

後續，採用矽膠管柱層析法(silica gel column chromatography) 對萃取液進行純化步驟以獲得純化液，並將純化液區分為11份純化分液(請參照步驟104)。在本說明書的一些實施例中，純化步驟是在直立且開放的玻璃管柱中，裝填矽膠顆粒作為固定相，將要分離的萃取液由管柱頂端緩慢注入，再以沖提液作為移動相進行沖提，利用萃取液中的化合物與固定相之間的吸附力及化合物與沖提液之間溶的解度差異來進行分離。在本實施例中，純化步驟，是採用平均粒徑為40-63 µm的矽膠顆粒填充玻璃管柱，並以甲醇作為沖提液進行沖提。按照沖提液的收集順序標明號碼，將被編碼的沖提液分別用薄層層析法檢測(Thin layer chromatography， TLC)沖提液，把收集的沖提液中具有相同成分的部分合併，而得到11份純化分液，並依照收集時間先後順序分別給予11份純化分液編號，例如純化分液1、純化分液2、純化分液3...至純化分液11。

將純化分液3和純化分液4與人類肺癌細胞株A549接觸，藉由肺癌細胞的生物活性測，例如細胞存活率分析(MTT assay)，可以證明純化分液3和純化分液4具有抑制肺癌細胞的功能。在本實施例中，是將人類肺癌細胞株A549培養於含有重量百分比為10 (10 %)胎牛血清(Fetal Bovine Sera，FBS)與重量百分比1 (1 %)之PS的F12培養液內，置於恆溫37℃與5 %二氧化碳(CO ₂)的培養箱中，48至72小時更換培養液。當人類肺癌細胞株A549的細胞密度達至80 %時，以繼代細胞方法將細胞離心並打散均勻後，用細胞計數器將5 × 10 ⁴顆細胞和3 × 10 ⁴顆細胞分別種於24 孔(well)培養盤中，待細胞貼於培養皿上後，去除培養液，並在24 孔的每格中加入0.5毫升(ml)以F12培養液，將純化分液3和純化分液4配置濃度分別為5 微克/毫升(μg/ml)、10 微克/毫升、20 微克/毫升、40 微克/毫升和80 微克/毫升的純化分液3和純化分液4，分別於恆溫培養箱中反應24、48小時，於每格中加入50 微升(μl)的MTT試劑(0.25 克溶於50 毫升的杜氏磷酸鹽緩衝液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，DPBS))反應約1小時，待反應結束後會形成紫色結晶，去除培養液，再於每格加入200 微升的二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解紫色結晶，取適量溶解液於96 孔盤中，用酵素免疫分析測讀儀(Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay reader，ELISA reader)於590 nm波長下偵測吸光值。最後，計算實驗組平均值與對照組平均值的比值可得出細胞存活率。

請參照第2A圖和第2B圖，第2A圖和第2B圖係分別繪示採用本說明書所提供的純化分液3和純化分液4對人類肺癌細胞株A549進行細胞存活率分析之後的結果。其中橫軸為純化分液3和純化分液4的濃度，縱軸為細胞存活率。曲線24 h、48 h和72 h分別代表培養24小時、48小時和72小時後的結果。其結果顯示，純化分液3和純化分液4確實具有抑制人類肺癌細胞株A549的效果。其中，純化分液3和純化分液4在濃度大於10微克/毫升時，抑制人類肺癌細胞株A549的效果相當顯著。純化分液3則在濃度大於5微克/毫升時即有顯著抑制人類肺癌細胞株A549的效果。

請參照第3圖，第3圖係繪示以本說明書所提供的純化分液3進行腫瘤實驗之後的結果曲線圖。選取對癌細胞完全無免疫能力的活鼠注射人類肺癌細胞株A549，以誘發肺癌腫瘤。並以不同濃度(25 微克/毫升50 微克/毫升和100 微克/毫升)的純化分液3餵食具有肺癌腫瘤的活鼠，犧牲後量測其腫瘤尺寸。由第3圖的觀察結果發現，餵食10日之後，肺癌腫瘤相對於控制組CTL有明顯縮小。

在本說明書的一些實施例中，可以對純化分液3進行進一步的純化。例如請參照第1圖步驟105，對純化分液3進行至少一次梯度沖提步驟。在本說明書的一些實施例中，可以採用重量百分濃度99的正己烷(n-Hexane)和乙酸乙酯作為沖提液。在本實施例中，包括兩次梯度沖提步驟。其中第一次的梯度沖提步驟係取毫克200 (mg)的純化分液3，在梯度濃度由100%的正己烷到正己烷與乙酸乙酯的比值為50:50的條件下進行沖提。按照沖提液的收集順序標明號碼，將被編碼的沖提液分別用薄層層析法檢測沖提液，把收集的沖提液中具有相同成分的部分合併，而得到22份梯度純化分液，並分別依照收集時間先後順序給予22份梯度純化分液編號，例如第一次梯度純化分液1、第一次梯度純化分液2、第一次梯度純化分液3...至第一次梯度純化分液22。

第二次的梯度沖提步驟係分別取200毫克的第一次梯度純化分液10，在梯度濃度由100 %的正己烷到正己烷與乙酸乙酯的比值為44:56的條件下進行沖提。按照沖提液的收集順序標明號碼，將被編碼的沖提液分別用薄層層析法檢測沖提液，把收集的沖提液中具有相同成分的部分合併，而得到6份梯度純化分液，並分別依照收集時間先後順序給予6份梯度純化分液編號，例如第二次梯度純化分液1、第二次梯度純化分液2、第二次梯度純化分液3...至第二次梯度純化分液6。

後續將第二次梯度純化分液1、第二次梯度純化分液2、第二次梯度純化分液3...至第二次梯度純化分液6分別再進一步分離，或以核磁共振光譜儀(Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 對所分離出的化合物進行一維/二維核磁共振光譜鑑定。例如，在本實施例中，第二次梯度純化分液3包含有化合物capillene，其結構式為：

又例如，取200毫克的第二次梯度純化分液5，在梯度濃度由正己烷與氯仿(chloroform)的比值為50：50到正己烷與氯仿的比值為30:70的條件下進行2第三次沖提，而得到17份梯度純化分液，並分別依照收集時間先後順序給予17份梯度純化分液編號，例如第三次梯度純化分液1、第三次梯度純化分液2、第三次梯度純化分液3...至第三次梯度純化分液17。其中，第三次梯度純化分液4包含有化合物capillaridin F，其結構式為：

再例如，取200毫克的第三次梯度純化分液4，以高效能液相層析儀(High performance liquid chromatography，HPLC)來進一步分離，條件為管柱250 毫米(mm)×10 毫米、粒徑5微米，將第三次梯度純化分液4分為3針，每一針分別注入1 毫升。其中，第1針和第2針的濃度為0.2 毫克/毫升(mg/ml)，流速為2 毫升/分鐘(ml/min)，以 波長254 奈米(nm) 的紫外光進行偵測，第3針的濃度為0.9 毫克/毫升，流速為3 毫升/分鐘，以波長254 奈米)的紫外光進行偵測，並以氯仿(100％)沖提，而得到4份HPLC純化分液，並分別依照收集時間先後順序給予4份HPLC純化分液編號，例如HPLC純化分液1、HPLC純化分液2、HPLC純化分液3和HPLC純化分液4。其中，HPLC純化分液2包含有化合物capillaridin C，其結構式為：

請參照第4A圖和第4B圖，第4A圖係繪示將人類肺癌細胞株A549以不同濃度(0微莫耳/升(μM)、1微莫耳/升、5微莫耳/升、 10微莫耳/升、20微莫耳/升、40微莫耳/升)的capillene進行處理24小時與48小時之後，進行細胞存活率分析之後的結果。第4B圖係繪示將人類肺癌細胞株A549以不同濃度(0微莫耳/升、1微莫耳/升、5微莫耳/升、10微莫耳/升、20微莫耳/升、40微莫耳/升)的capillene進行處理24小時與48小時之後，用顯微鏡所拍攝的人類肺癌細胞株A549之細胞形態影像。根據第4A圖的分析結果，可知capillene在濃度大於5微莫耳/升時，抑制人類肺癌細胞株A549的效果相當顯著。根據第4B圖的影像顯示，人類肺癌細胞株A549在加入capillene後，細胞形態隨著濃度增加而改變，而在加入10微莫耳/升的capillene 處理下，細胞開始出現皺縮死亡的現象。

請參照第5圖，第5圖係分別繪示將人類肺癌細胞株A549以不同濃度(0微莫耳/升、1微莫耳/升、5微莫耳/升、10微莫耳/升、20微莫耳/升、40微莫耳/升)的capillene進行處理48小時之後，以西方墨點法(Western blot)分析與細胞凋亡相關的蛋白質Caspase-3、Caspase-9和 PARP表現的結果。第5圖的結果顯示：隨著capillene濃度上升，蛋白質cleaved-PARP, cleaved-caspase-9與cleaved-PARP表現量增加，可以推測capillene係透過誘導細胞凋亡來抑制人類肺癌細胞株A549。

根據上述實施例，本說明書是使用常見的艾草，例如青蒿、茵陳蒿、杜蒿、黃花蒿、細葉山艾、艾蒿或上述之任意組合為材料，從中萃取出具有抑制肺癌細胞生物活性以及誘導肺癌細胞進行細胞凋亡的複方萃取液及有效物質，可作為一種預防及治療肺癌之安全、無副作用的食品組合物或醫藥組合物。在本說明書的一些實施例中，此一複方萃取液可以有效抑制人類肺癌細胞株A549的生物活性，而化合物capillene是可以誘導人類肺癌細胞株A549進行細胞凋亡的有效物質之一。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何該技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

101‧‧‧將乾燥的艾草全草剪碎

102‧‧‧採用乙醇進行粗萃取步驟以獲得粗萃取物

103‧‧‧對粗萃取物進行液相萃取步驟以獲得萃取液

104‧‧‧對萃取液進行純化步驟以獲得純化液，並將純化液區分為11份純化分液

105‧‧‧對純化分液3進行至少一次梯度沖提步驟

為了對本說明書之上述及其他方面有更佳的瞭解，下文特舉實施例，並配合所附圖式詳細說明如下： 第1圖係根據一實施例所繪示之艾草萃取物的萃取流程方塊圖； 第2A圖和第2B圖係分別繪示採用本說明書所提供的純化液3和純化液4對人類肺癌細胞株A549進行細胞存活率分析之後的結果； 第3圖係繪示以本說明書所提供的純化液3進行腫瘤實驗之後的結果曲線圖； 第4A圖係繪示將人類肺癌細胞株A549以不同濃度的capillene進行處理24小時與48小時之後，進行細胞存活率分析之後的結果； 第4B圖係繪示將人類肺癌細胞株A549以不同濃度的capillene進行處理24小時與48小時之後，用顯微鏡所拍攝的人類肺癌細胞株A549之細胞形態影像； 第5圖係分別繪示將人類肺癌細胞株A549以不同濃度的capillene進行處理48小時之後，以西方墨點法(Western blot)分析與細胞凋亡相關的蛋白質Caspase-3、Caspase-9和 PARP表現的結果。

無。

101‧‧‧將乾燥的艾草全草剪碎

102‧‧‧採用乙醇進行粗萃取步驟以獲得粗萃取物

103‧‧‧對粗萃取物進行液相萃取步驟以獲得萃取液

104‧‧‧對萃取液進行純化步驟以獲得純化液，並將純化液區分為11份純化分液

105‧‧‧對純化分液3進行至少一次梯度沖提步驟

Claims (7)

1. 一種艾草萃取物用於製備抑制肺癌細胞之藥物的用途，其中該艾草萃取物係由一艾蒿(Artemisia argyi)萃取而得，且該艾草萃取物的萃取包括下述步驟：進行一粗萃取步驟，以乙醇(ethanol)浸泡該艾蒿的一乾燥全草，獲得一粗萃取物；進行一液相萃取步驟，將該粗萃取物置入一萃取溶劑中進行一分配(partition)程序以獲得一萃取液和一水層，其中該萃取溶劑係由乙酸乙酯(ethyl acetate)/水所組成；以及進行一純化步驟，使該萃取液通過一矽膠管柱層(silica gel column)以甲醇作為一沖提液進行沖提，獲得一純化液，並將該純化液區分為11份純化分液，且依照收集時間先後順序分別給予該11份純化分液一編號；其中該艾草萃取物包括該11份純化分液中的一第3號純化分液，且該第3號純化分液包括一化合物capillene，其結構式為：

   
2. 如申請專利範圍第1項所述之艾草萃取物用於製備抑制肺癌細胞之藥物的用途，包括該11份純化分液中的一第4號純化分液。
3. 如申請專利範圍第1項所述之艾草萃取物用於製備抑制肺癌細胞之藥物的用途，其中該第3號純化分液更包括一化合物capillaridin F，其結構式為：

   
4. 如申請專利範圍第1項所述之艾草萃取物用於製備抑制肺癌細胞之藥物的用途，其中該第3號純化分液更包括一化合物capillaridin C，其結構式為：

   
5. 如申請專利範圍第1項所述之艾草萃取物用於製備抑制肺癌細胞之藥物的用途，其中該化合物capillene，係藉 由將該第3號純化分液以正己烷(n-Hexane)和乙酸乙酯作為一沖提液，進行兩次梯度沖提步驟所得。
6. 如申請專利範圍第1項所述之艾草萃取物用於製備抑制肺癌細胞之藥物的用途，其中該肺癌細胞係人類肺癌細胞株A549。
7. 如申請專利範圍第1項所述之艾草萃取物用於製備抑制肺癌細胞之藥物的用途，其中該化合物capillene具有透過誘導細胞凋亡來抑制該肺癌細胞的用途。

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