KR20220039634A - 미생물 유래 대사물질 그라피스락톤 a를 유효성분으로 함유하는 비만 또는 비알콜성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
미생물 유래 대사물질 그라피스락톤 a를 유효성분으로 함유하는 비만 또는 비알콜성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 장내미생물 유래 대사물질 그라피스락톤 A(Graphislactone A)를 유효성분으로 함유하는 비만 또는 비알콜성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 장내미생물 유래 대사물질 그라피스락톤 A(Graphislactone A)는 백색지방의 전구세포의 분화를 억제하고 간세포의 지방축적을 억제하고, 질환동물모델에서 체지방 및 간 조직 내 중성지방의 축적을 제어할 수 있는 바 비만과 지방간을 예방 또는 치료하는데 유용하다. 또한, 대식세포의 전 염증 관련 유전자들의 발현을 효과적으로 억제하는 바 비만과 함께 동반되는 염증반응을 예방 또는 치료하는데도 유용하다. 따라서, 본 발명의 그라피스락톤 A(Graphislactone A)는 비만 나아가 궁극적으로는 지방간, 비알콜성 지방간염(NASH)과 같은 비알콜성 지방간질환(NAFLD)을 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 미생물 유래 대사물질 그라피스락톤 A(Graphislactone A)를 유효성분으로 함유하는 비만 또는 비알콜성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 본 발명은 미생물이 분비하는 대사산물의 하나인 그라피스락톤 A로부터 백색지방의 전구세포의 분화를 억제하고 질환동물모델에서 체지방 및 간 조직 내 중성지방의 축적을 저해할 수 있어 비만을 예방 또는 치료하는데 유용함을 확인하고, 대식세포의 전 염증 관련 유전자들의 발현을 효과적으로 억제함으로써 비만과 함께 동반되는 염증반응을 예방 또는 치료하는데 유용함을 확인하여, 비만 또는 비알콜성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
비만은 열량의 섭취와 소비의 불균형으로 발생하는 대사성 질환으로, 과잉 열량으로 지방 조직이 비정상적으로 증가한 상태를 말한다. 비만으로 축적된 지방조직에서 만들어진 지방산은 혈중 지방산의 농도를 증가시키고 혈중 지방산이 증가하면 세포에서 포도당 대신 지방산을 받아들이고 간 및 다른 조직으로의 축적이 증가하게 된다. 이러한 간내 과도한 지방의 축적은 간 무게의 5% 이상이 되면 지방간으로 진단한다고 알려져 있으며, 지방간은 염증성 사이토카인의 증가를 유도하여 지방간염 등 간질환으로 진행될 위험성이 높아진다고 알려져 있다. 또한, 비만이 있는 사람은 정상 체중의 사람에 비해 혈중 지질 수치가 증가하여 고지혈증에 걸렬 확률이 높고, 고혈압, 당대사 이상 등 대사증후군을 가질 위험성이 증가된다. 한편, 한국인의 비만율은 국민영양조사에 따르면 2007년 31.7%에서 2018년 34.6%로 지난 10년간 30% 수준을 유지하고 있으나, 꾸준히 증가하고 있으며 성인 남자 10명 중 4명은 비만으로 보고 되고 있다. 또한, 가공 식품 섭취의 증가와 영양의 과잉 섭취, 신체활동의 부족으로 향후 높아질 가능성이 농후하다. 그러나, 글로벌제약회사의 대사성질환 R&D 투자 및 신약개발노력에도 불구하고 지난 30년간 비만 증가율 감소는 없었다. 현재까지의 비만치료제는 GLP-1 유사체이거나 호르몬 조절에 의한 식욕조절 약물이 대부분으로 호르몬 조절에 의한 부작용의 우려가 있어 새로운 기전에 의한 비만치료제의 개발이 요구되고 있다.
비알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD)은 음주와 관계없이 간 내에 중성지방이 축적되는 질환을 의미하고, 여기에는 지방간(steatosis)과 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)이 포함된다. NASH는 1980년 Ludwig 등에 의하여 처음으로 명명되었고 지방간과 함께 염증 혹은 섬유화를 동반하는 것이 특징이다. 지방간은 임상적으로 예후가 양호한 양성 질환으로 생각되고 있으나, NASH는 진행성 간질환으로 간경변이나 간암을 유발하는 전구 질환으로 인지되고 있다. NASH로 진행되는 동안 환자가 느낄 수 있는 증상이 없어 침묵의 질병으로 불린다. 한편, 지방간 환자의 20~30%는 염증 및 섬유화를 동반하는 지방간염으로 진행된다고 알려져 있어 임상적으로 예후가 좋은 지방간 단계에서의 치료에 대한 중요성이 대두되고 있다. 최근 국민건강연양조사에서 1998~2001년 참여한 14,438명과 2016~2017년에 참여한 11,455명의 간질환 유병률을 분석한 결과 NAFLD 유병률이 18.6%에서 21.5%로 16% 증가하는 등 국내 유병율이 높다. 또한, 세계적으로도 NASH는 현재까지 승인받은 치료제가 없는 질병으로 환자의 부담이 크고 결국에는 간을 이식받아야 되는 질병으로 미국심품의약품안전청 FDA에 따르면 NAFLD와 NASH의 진행속도를 늦추거나 증상을 호전시킬 수 있는 치료제에 대한 수요가 높다고 보고되었다. NAFLD의 주요 병인 기전으로는 1) 지방산 대사의 불균형에 의한 간세포내의 과도한 지방 축적, 2) 축적된 간세포내 지방독성에 의한 TNFα, IL1β 등 염증반응, 3) 산화적 스트레스의 증가 등이 보고 되어 있다. 현재까지 많은 연구자들이 NASH를 포함하는 NAFLD를 치료하기 위해 염증성 사이토카인인 TNF 분비를 조절하거나, 단핵구(monocyte)의 CCR2 수용체의 억제제, 쿠퍼 세포(kupffer cell)의 CD163 수용체 조절, FXR 수용체 억제제, PPARγ 또는 PPARδ/α의 아고니스트 등을 타겟으로 하는 약물 개발이 있었지만(공개특허 10-2015-0118990, 공개특허 10-2020-0089782), 아직까지 최종 치료제로 승인 된 약물은 없으며, 이는 독성 부작용에 대한 합성 화합물 약물의 한계에 상당히 기인한다. 따라서, 상대적으로 독성 부작용이 적을 것으로 생각되는 천연물 또는 생체 유래의 물질, 예를 들어 체내미생물 분비물 등의 물질을 활용한 치료제 개발이 요구되고 있다.
상기한 배경하에, 본 발명자들은 비만 나아가 궁극적으로 비알콜성 지방간, 과 같은 비알콜성 지방간질환(NAFLD)을 치료하기 위한 새로운 약물을 개발하기 위해 노력하던 중, 미생물이 분비하는 대사산물의 하나인 그라피스락톤 A로부터 백색지방의 전구세포의 분화가 억제되고, 이로부터 체내 중성지방의 축적이 저해되는 바, 비만을 예방 또는 치료하는데 유용하고, 비만에 의해 유도되는 지방간 및 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이 (CDAHFD, choline-deficient, L-amino acid defined, high-fat diets) 에 의해 유도되는 비비만성 지방간의 치료제로 유용함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 비만 나아가 궁극적으로는 지방간 (Steatosis) 같은 비알콜성 지방간질환(NAFLD)을 예방 또는 치료할 수 있는 새로운 소재를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 그라피스락톤 A(Graphislactone A)를 유효성분으로 함유하는 비만 또는 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 그라피스락톤 A(Graphislactone A)를 유효성분으로 함유하는 비만 또는 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명은 그라피스락톤 A(Graphislactone A)를 치료학적으로 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비만 또는 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 비만 또는 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 그라피스락톤 A(Graphislactone A)의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 미생물 유래 대사물질 그라피스락톤 A(Graphislactone A)는 백색지방의 전구세포의 분화를 억제함으로써 체내 중성지방의 축적을 제어할 수 있는 바 비만을 예방 또는 치료하는데 유용하다. 또한, 비만 혹은 콜린결핍고지방식이에 의해 유도되는 지방간을 질환동물모델에서 억제함에 따라 지방간 치료에도 유용하다. 대식세포의 전 염증 관련 유전자들의 발현을 효과적으로 억제하는 바 비만과 함께 동반되는 염증반응을 예방 또는 치료하는데도 유용하다. 따라서, 본 발명의 그라피스락톤 A(Graphislactone A)는 비만 나아가 궁극적으로는 지방간, 비알콜성 지방간염(NASH)와 같은 비알콜성 지방간질환(NAFLD)을 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1e는 마우스 유래 대식세포 Raw264.7에서 LPS로 유도 된 전 염증 (pro-inflammatory) 관련 유전자들(TNFα, IL1β, IL6), 대식세포 마커 유전자 F4/80 및 전 염증성 대식세포에서 발현되는 수용체인 Cd11c의 발현에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 2a 내지 도 2e는 마우스 복막으로부터 분리한 대식세포에서 LPS로 유도 된 전 염증 (pro-inflammatory) 관련 유전자들(TNFα, IL1β, IL6), 대식세포 마커 유전자 F4/80 및 전 염증성 대식세포에서 발현되는 수용체인 Cd11c의 발현에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 3은 마우스 유래 간세포 AML12에서 올레산 (oleic acid) 처리에 따른 지방 축적에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 현미경 사진으로 나타낸 도면이다.
도 4는 마우스 유래 간세포 AML12에서 올레산 (oleic acid) 처리에 따른 중성지방 축적에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 정량적으로 측정하여 나타낸 도면이다.
도 5a 내지 5b는 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 분화에 따른 중성지방 축적에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 6은 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 분화에 따른 지방세포형성(adipogenesis)에 관련된 전사체 발현 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 7은 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 분화에 따른 지방합성에 관여하는 유전자 발현에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 8a 내지 도8 b는 고지방식이에 의해 유도되는 비만 마우스에 대한 그라피스락톤 A의 체중 및 체지방 변화 효과를 나타낸 도면이다.
도 9는 고지방식이에 의해 유도되는 비만 마우스의 혈중 중성지방의 농도에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 10a 내지 10b는 고지방식이에 의해 유도되는 비만 마우스의 지방간증에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 11a 내지 11b는 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이(CDAHFD)에 의해 유도되는 비비만성 지방간질환 모델에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 12는 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이(CDAHFD)에 의해 유도되는 비비만성 지방간질환 모델의 체중변화에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 2a 내지 도 2e는 마우스 복막으로부터 분리한 대식세포에서 LPS로 유도 된 전 염증 (pro-inflammatory) 관련 유전자들(TNFα, IL1β, IL6), 대식세포 마커 유전자 F4/80 및 전 염증성 대식세포에서 발현되는 수용체인 Cd11c의 발현에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 3은 마우스 유래 간세포 AML12에서 올레산 (oleic acid) 처리에 따른 지방 축적에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 현미경 사진으로 나타낸 도면이다.
도 4는 마우스 유래 간세포 AML12에서 올레산 (oleic acid) 처리에 따른 중성지방 축적에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 정량적으로 측정하여 나타낸 도면이다.
도 5a 내지 5b는 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 분화에 따른 중성지방 축적에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 6은 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 분화에 따른 지방세포형성(adipogenesis)에 관련된 전사체 발현 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 7은 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 분화에 따른 지방합성에 관여하는 유전자 발현에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 8a 내지 도8 b는 고지방식이에 의해 유도되는 비만 마우스에 대한 그라피스락톤 A의 체중 및 체지방 변화 효과를 나타낸 도면이다.
도 9는 고지방식이에 의해 유도되는 비만 마우스의 혈중 중성지방의 농도에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 10a 내지 10b는 고지방식이에 의해 유도되는 비만 마우스의 지방간증에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 11a 내지 11b는 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이(CDAHFD)에 의해 유도되는 비비만성 지방간질환 모델에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
도 12는 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이(CDAHFD)에 의해 유도되는 비비만성 지방간질환 모델의 체중변화에 대한 그라피스락톤 A의 효과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 그라피스락톤 A(Graphislactone A)를 유효성분으로 함유하는 비만 또는 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 그라피스락톤 A(Graphislactone A)는 4,7-디히드록시-3,9-디메톡시-1-메틸-6H-벤조[c]크로메-6-논으로, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.
[화학식 1]
상기 본 발명에 따른 미생물 유래 대사물질 중 하나인 그라피스락톤 A(Graphislactone A)는 백색지방의 전구세포인 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하고, 비만 질환모델동물에서 체지방 및 간 조직 내 중성지방의 축적을 억제할 수 있다. 이에, 그라피스락톤 A는 비만 또는 지방간의 예방 또는 치료를 위한 소재로서 유용하다. 또한, 그라피스락톤 A는 대식세포의 전 염증 관련 유전자들, 예를 들어 TNFα, IL1β, IL6의 유전자 발현을 억제함으로써, 비만 또는 지방간과 동반되는 염증반응을 억제시킬 수 있어, 비알콜성 지방간염(NASH)과 같은 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 예방 또는 치료를 위한 소재로서 유용하다.
또한, 본 발명의 그라피스락톤 A(Graphislactone A)는 생체 내에서 자연적으로 존재하는 미생물의 분비물 유래의 성분으로써, 합성 신약에서 우려되는 독성 부작용에 대한 우려가 적은 바, 본 발명의 그라피스락톤 A(Graphislactone A)는 아직까지 최종 치료제로 승인 된 약물이 없는 NAFLD의 예방 또는 치료 분야에서 새로운 약물로서 개발이 가능하다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구 투여를 위한 고형제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 81, 카카오지, 타우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 10 mg을 매일 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 그라피스락톤 A(Graphislactone A)를 유효성분으로 함유하는 비만 또는 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 비알콜성 지방간질환(NAFLD)은 지방간, 비알콜성 지방간염(NASH)을 포함하고, 상기 본 발명에 따른 미생물 유래 대사물질 중 하나인 그라피스락톤 A(Graphislactone A)는 백색지방의 전구세포인 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하고 질환동물모델에서 체지방 및 간 조직 내 중성지방의 축적을 억제할 수 있다. 이에, 그라피스락톤 A는 비만 또는 지방간의 예방 또는 개선을 위한 건강기능성식품 소재로서 유용하다. 또한, 그라피스락톤 A는 대식세포의 전 염증 관련 유전자들, 예를 들어 TNFα, IL1β, IL6의 유전자 발현을 억제함으로써, 비만 또는 지방간과 동반되는 염증반응을 억제시킬 수 있어, 비알콜성 지방간염(NASH)과 같은 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 예방 또는 개선을 위한 건강기능성식품 소재로서 유용하다.
본 명세서의 "건강기능식품"이란 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (기능성 원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품으로 식품의약품안전처장이 정한 것을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태로 제조될 수 있다.
나아가, 본 발명은 그라피스락톤 A(Graphislactone A)를 치료학적으로 유효한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비만 또는 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 치료방법을 제공한다.
상기 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 상기에서 정의내린 바와 같고, 중복된 설명은 생략한다. 상기 개체는 비만 또는 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 치료가 필요한 개체를 의미하고, 상기 개체는 포유 동물 또는 비 포유 동물이고, 예를 들어 사람이다.
또한, 본 발명은 비만 또는 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 그라피스락톤 A(Graphislactone A)의 용도를 제공한다.
상기 본 발명의 그라피스락톤 A(Graphislactone A)는 백색지방의 전구세포인 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하고 간세포의 지방축적을 억제하고 질환동물모델에서 체지방 및 간 조직 내 중성지방의 축적을 억제할 수 있고, 대식세포의 전 염증 관련 유전자들, 예를 들어 TNFα, IL1β, IL6의 유전자 발현을 억제함으로써,비만 또는 지방간과 동반되는 염증반응을 억제시킬 수 있어, 비알콜성 지방간염(NASH)과 같은 비알콜성 지방간질환(NAFLD)의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 유효성분으로 활용될 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 마우스 유래 Raw264.7 및 마우스 복막으로부터 분리한 대식세포를 이용한 실험을 통해 그라피스락톤 A(Graphislactone A)가 LPS 자극에 의한 대식세포의 전 염증 관련 유전자들, 예를 들어 TNFα, IL1β, IL6의 유전자 발현을 억제함을 확인하였다 (도 1a-1e 및 도 2a-2e 참조). 또한, 그라피스락톤 A의 처리에 의하여 올레산으로 유도된 AML12 간세포의 지방 축적이 억제되는 것을 확인하였다 (도 3 및 도 4 참조). 아울러 그라피스락톤 A가 마우스 유래의 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하여 지방의 축적을 억제하고(도 5 참조), 지방세포형성에 관련된 유전자군 (FAS, ACC1, CPT1a, PPARa 및 PGC1a) 의 발현을 현저히 감소시킴을 확인하였다 (도 6 및 7 참조). 고지방식이로 유도한 비만 동물 모델을 이용한 실험에서, 그라피스락톤 A가 체중 및 체지방을 감소시키고 (도 8 참조), 중성지방의 농도를 감소시키며 (도 8 및 9 참조), 간조직의 지방축적을 현저히 감소시켜 비만과 비만성 지방간을 동시에 완화시키는 것을 확인하였다 (도 10). 또한, 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이 (CDAHFD) 로 유도한 비비만성 지방간 마우스를 이용한 실험에서, 그라피스락톤 A가 간조직의 지방축적을 현저히 감소시키며 (도 11 참조), 이는 체중변화와는 관계없이 작동하는 그라피스락톤 A의 기능임을 확인하였다(도 12 참조).
이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 하기에 구체적으로 예시하여 설명한다. 다만, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명의 일부를 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 그라피스락톤 A(Graphislactone A)의 준비
본 발명의 실험에 사용한 그라피스락톤 A는 Bioaustralis (Australia)로부터 구매하였다.
<실험예 1> 마우스 유래 대식세포 Raw264,7에서 LPS로 유도 된 전 염증 (pro-inflammatory) 관련 유전자들의 발현에 대한 그라피스락톤 A의 억제 효과
Raw264.7 대식세포를 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토 마이신 및 10 %(v/v) 열-불활성화 된 FBS가 포함 된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 5% CO2 하 37 ℃로 배양하였다. 실험을 위해, Raw264.7 대식세포를 12 웰 플레이트에 웰당 2 X 105 세포를 플레이팅 하고, LPS (10ng/mL) 및 Graphislactone A (50, 25, 12.5μM)을 포함하는 serum-free DMEM으로 3시간 동안 처리하였다. 이후, 상기한 바에 따라 처리 된 Raw264.7 대식세포를 RT-PCR 정량 분석을 위해 수집하였다. TRIzol Reagent (Thermo Fishers Scientific, Waltham, MA)을 이용해 Raw264.7 대식세포의 총 RNA를 추출하였다. RNA는 NanoDrop 2000C 분광 광도계 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 260/280파장 측정으로 정량화 하였다. 순수 RNA는 제조사의 프로토콜 (Enzynomics, 대전, 한국)에 따라 TOPscriptTM RT DryMIX 키트를 사용하여 역전사 시켰다. Real-time PCR은 적용된 Biosystems 7300 Real-time PCR 시스템 (Thermo Fishers Scientific, Waltham, MA) 상에서 수행하여 그 결과를 도 1a 내지 도 1e에 나타내었다.
도 1a 내지 도 1e를 살펴보면, 대식세포 마커인 F4/80의 유전자 발현에는 영향을 주지 않고, LPS 자극에 의해 유도된 Raw264.7 대식세포의 전 염증성 사이토카인들의 mRNA 발현 수준이 본 발명 그라피스락톤 A의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소되는 것이 확인하였다. TNF-α의 mRNA 발현은 그라피스락톤 A 25, 50 μM 농도로 각각 처리 되었을 때, 31, 50 % 감소되었다. IL-1β의 mRNA 발현은 그라피스락톤 A 12.5, 25, 50 μM 농도로 각각 처리 되었을 때, 60, 76, 82 % 감소되었다. IL-6의 mRNA 발현은 그라피스락톤 A 25, 50 μM 농도로 각각 처리 되었을 때, 61, 77 % 감소되었다. 또한, 전 염증성 대식세포에서 발현되는 수용체인 Cd11c의 mRNA 발현은 그라피스락톤 A 12.5, 25 μM 농도로 각각 처리 되었을 때, 54, 63 % 감소되었다.
한편, 실험에 사용 된 프라이머 시퀀스는 아래 표 1과 같다:
| 유전자 | Forward Primer Sequence | Reverse Primer Sequence |
| Mouse F4/80 | TCATCAGCCATGTGGGTACAG | CACAGCAGGAAGGTGGCTATG |
| Mouse Tnf-α | CCAGACCCTCACACTCAGATC | CACTTGGTGGTTTGCTACGAC |
| Mouse IL-1β | AGGCAGGCAGTATCACTCATTGT | GGAAGGTCCACGGGAAAGA |
| Mouse IL-6 | GCTACCAAACTGGATATAATCAGGA | CCAGGTAGCTATGGTACTCCAGAA |
| Mouse CD11c | ACACAGTGTGCTCCAGTATGA | GCCCAGGGATATGTTCACAGC |
| Mouse Gapdh | TCCCACTCTTCCACCTTCGA | CAGGAAATGAGCTTGACAAAGTTG |
<실험예 2> 마우스 복막으로부터 분리한 대식세포에서 LPS로 유도 된 전 염증 (pro-inflammatory) 관련 유전자들의 발현에 대한 그라피스락톤 A의 억제효과
마우스 복막 대식세포는 10-12 주령 마우스 (C67BL/6N, n = 3 per group)에 4 % 티오글리콜레이트 (1 ml)의 복강 내 주사 4 일 후 10 ml의 빙냉 PBS로 복강 세척하여 취하였다. 유체를 빼내고, 4 ℃에서 10분 동안 400g으로 원심분리 하고, 세포 펠렛을 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 10 % (v/v) 소혈청으로 보충 된 RPMI 배지에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 12 웰 플레이트에 옮기고 5 % CO2를 포함하는 가습 공기하에 37℃에서 밤새 배양하였다. 실험을 위해 비-부착 세포를 PBS로 세척하고, 부착성 대식세포를 LPS (10 ng/ml) 및 그라피스락톤 A (50, 25, 12.5 μM)로 6시간 처리하여 M1 표현형으로 분화시켰다. 처리 된 세포는 RT-PCR 정량 분석을 위해 수집하였다. RT-PCR은 상기 실험예 1과 동일하게 수행하였고, 그 결과를 도 2a 내지 도 2e에 나타내었다.
도 2a 내지 도 2e를 살펴보면, 대식세포 수를 나태내는 마커인 F4/80에 그라피스락톤 A의 영향이 보이지 않았지만, LPS 자극에 의해 유도된 대식세포의 전 염증성 사이토카인들의 mRNA 발현 수준이 본 발명 그라피스락톤 A의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소되는 것이 확인되었다. TNF-α의 mRNA 발현은 그라피스락톤 A 12.5, 25, 50 μM 농도로 각각 처리 되었을 때, 42, 55 65 % 감소되었다. IL-1β의 mRNA 발현은 그라피스락톤 A 25, 50 μM 농도로 각각 처리 되었을 때, 28, 71 % 감소되었다. IL-6의 mRNA 발현은 그라피스락톤 A 12.5, 25, 50 μM 농도로 각각 처리 되었을 때, 38, 54, 72 % 감소되었다.
실험예 1과 2에서 확인되는 바와 같이, 본 발명 그라피스락톤 A는 대식세포의 전염증성 사이토카인의 유전자 발현의 감소에 효과가 있는 것이 Raw 264.7 대식세포와 마우스 복강유래 원발성(primary) 대식세포 모두에서 확인되었다.
<실험예 3> 마우스 유래 간세포 AML12에서 올레산 (oleic acid) 처리에 따른 지방 축적에 대한 그라피스락톤 A의 억제효과
AML12 간세포는 10 % (v/v) 열 불활성화 FBS, 10 μg/mL 인슐린, 5.5 μg/mL 트랜스페린, 6.7 ng/mL 셀레늄, 40 ng/mL 덱사메타손, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충 된 DMEM/Ham's F12 배지에서 5 % CO2 하에서 37 ℃에서 배양시키고, AML12 간세포를 200 μM BSA-conjugated OA (Oleic acid) 및/또는 그래피스락톤 A로 18 시간 동안 처리하였다. OA 유도 된 지질 방울은 제품 설명서에 따라 TG 정량 분석 키트 (Abcam, Cambridge, UK)로 트리글리 세라이드 농도를 측정했다. 세포 이미징을 위해 OA 유도 지질 방울을 BODIPYTM 493/503으로 30 분 동안 염색 한 다음, 10 % 포르말린으로 30 분 동안 고정한 후 DAPI (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)가 포함 된 ProLong Gold antifade 시약을 마운팅하였다. BODIPY 염색 된 세포는 LSM 700 공초점레이저스캐닝 현미경 (ZEISS, Oberchen, Germany)으로 캡처하여 이미지는 ZEN 2.6 (블루 에디션) Microscope Software를 사용하여 도 3에 나타내었다. 한편, OA- 유도 된 지질의 농도는 마이크로 플레이트 리더 (SoftMax Pro 5 Microplate reader, Molecular Devices, California USA)를 사용하여 570nm에서 Triglyceride Quantification Assay Kit (Abcam, 영국 캠브리지)에 의해 측정되었고 정량 분석을 위한 그래프를 도 4에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, AML12 간세포에 200 μM OA (올레산)를 18시간 처리하여 지방축적을 유도하였을때 BODIPY로 염색된 지방방울이 대조군에 비해 급격히 증가하였으나, 그라피스락톤 A 50 μM를 함께 처리하였을 때 AML12 간세포내에 축적되는 지방방울이 현저하게 감소되었다.
도 4의 그래프를 보면, 올레산만 처리한 그룹 대비 그라피스락톤 A가 농도별로 함께 처리한 그룹에서 모두 40% 이상으로 감소됨이 확인되었다.
<실험예 4> 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 분화 억제 및 지방 축적에 대한 그라피스락톤 A의 효과
마우스 3T3-L1 지방전구세포(American Type Culture Collection (ATCC) #F8979)는 100 U/mL 페니실린, 100 μg.mL 스트렙토마이신 및 10 %(v/v) 열불활성화 된 BCS를 포함하는 DMEM (성장 배지)에서 5% CO2 하 37 ℃에서 배양되었다. 실험을 위해, 3T3-L1 지방전구세포를 12개의 웰 플레이트에 웰당 2 X 105의 밀도로 분주하고 세포 성장 배지에서 postconfluence에 이르도록 2일 동안 배양시켰다. Post-confluence 상태에 이른 지방전구세포는 분화를 위해 10% FBS, 100 U/mL의 페니실린, 100 μg.mL 스트렙토마이신, 0.5mM IBMX, 1μM 덱사메타손 및 10μg/mL 인슐린 용액을 포함하는 DMEM (분화유도 배지)에서 이틀간 배양되었다. 2일 후 10μg/mL 인슐린 용액을 포함하는 DMEM (분화유지 배지)에서 배양하였고, 이틀마다 새 배지로 교체하여 세포주를 유지하여 주었다. 분화 시작 8일 후 분화 된 3T3-L1 세포를 10% 포르말린으로 1시간 동안 고정시키고, Oil red O(60 % 이소프로판올 중 0.8 μg/mL)로 20분 동안 지방 방울을 염색하였다. 염색 된 지방 방울을 이소프로판올로 용해시키고 495nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였고, 그 결과를 도 5a에 나타내었고, 이때의 지방방울이 염색된 세포의 사진을 도 5b에 나타내었다.
도 5a 와 도 5b를 보면, 3T3-L1 세포에서 그라피스락톤 A의 처리에 따라 농도 의존적으로 세포 분화가 억제되고, 지방 축적이 억제되는 것이 확인되었다.
<실험예 5> 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 지방 축적 관련 유전자 발현 조절에 대한 그라피스락톤 A의 효과
<5-1> RNA 시퀀싱을 통한 전사체 분석
마우스 3T3-L1 지방전구세포를 <실험예 4>와 동일한 방식으로 지방세포로 분화시키고, 분화배지 처리 후 3일에 세포로부터 RNA를 추출하였다. 이를 차세대 염기서열분석법을 이용한 RNA 시퀀싱 기법을 통해 전사체 분석을 시행하여 그라피스락톤 A 처리(10 μM)에 따른, 지방세포 분화 과정에서의 전체 유전자 수준의 발현 변화를 확인하였다. Gene set enrichment analysis 알고리즘을 이용하여 대조군에 비하여 그라피스락톤 A 처리군에서 변화한 유전자군(gene set)을 분석하였다.
도 6에서와 같이, 그라피스락톤 A 처리에 의해 변화한 유전자군들 중 지방세포형성(adipogenesis)에 관련된 유전자군의 발현이 억제됨을 알 수 있다.
<5-2> 실시간 중합효소연쇄반응 분석
마우스 3T3-L1 지방전구세포 <실험예 4>와 동일한 방식으로 지방세포로 분화시키고, 분화배지 처리 후 3일에 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. 이를 real-time PRC을 통해 그라피스락톤 A 처리(10 μM)에 따른, 3T3-L1 지방전구세포의 지방 합성에 관여하는 mRNA 발현을 확인하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 그라피스락톤 A 처리시, 지방 합성에서 중요하게 작용하는 ACC1 및 FAS 유전자의 발현이 현저하게 감소하는 것으로 나타났고, 이를 통해, 본 발명에 따른 그라피스락톤 A가 지방 합성을 억제함으로써 지방세포의 분화 및 발달을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.
실험에 사용 된 프라이머 시퀀스는 아래 표 2과 같다:
| 유전자 | Forward Primer Sequence | Reverse Primer Sequence |
| Mouse FAS | CCTGCTATCATCTGA CTTCCTCT | AGGGTGGTTGTT AGAAAGATCAA |
| Mouse ACC1 | GCGGGAGGA GTTCCTAATTC | TGTCCCAGACGTAAGCCTTC |
| Mouse/Rat CPT1a | GTCTGAGCCATGGAGGTTGT | GGCTTGTCTCAAGTGCTTCC |
| Mouse PPARa | AACTGGATGACAGTGACATTTCC | CCCTCCTGCAACTTCTCAAT |
| Mouse PGC1a | CGATGTGTCGCCTTC TTGCT | CGAGAGCGCATCCTT TGG |
<실험예 6> 식이유도 동물모델에서의 항비만효과
그라피스락톤 A의 항비만효과를 평가하기 위해 60% 고지방식(HFD, D12492, Research Diets)으로 동물 연구를 4주 동안 수행하였다. C57BL/6 마우스는 OrientBio Inc. (Seongnam, Korea)에서 구입했으며, 통제 된 온도 (22 ± 1℃), 습도 (55 ± 10%) 및 조도 (12시간 명/암) 하 무균 시설에 개별적으로 수용시키고, 물과 HFD 또는 NCD (normal chow diet) (5053, Labdiet, St. Louis, MO)를 자유롭게 급여하였다. HFD 급여 3주 후 HFD를 하면서 그라피스락톤 A를 10mg/kg 농도로 1주간 매일 ip (intraperitoneal) injection하였고, 일주일에 두번 체중변화를 모니터링하였으며, 그라피스락톤 A 투여 1주일 후 체지방 조성을 핵자기공명분광기 H-NMR (Proton nuclear magnetic resonance, Bruker Optics, Billerica, MA)로 측정하였다. 실험이 종료된 후 모든 동물은 부검 후 안락사 되었으며, 이때 심장채혈하여 혈액을 수거하였고 3000rpm에서 20분간 원심분리하여 얻은 혈장을 혈액분석에 이용하였다. plasma TG는 Cayman colorimetric triglyceride assay kit (Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 정량 하였으며, Aspartate transaminase (AST), and alanine transaminase (ALT)는 Cobas c111 analyzer (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 모든 동물 실험 절차는 가천대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받아 진행되었다.
도 8a 내지 도 8b에 나타낸 바와 같이, 고지방식이 시작 후 3주간 체중이 급격히 증가하였으나, 그라피스락톤 A를 10mg/kg로 일주일간 ip 투여 후 고지방식이군에 비해 유의적으로 체중이 감소되는 것으로 확인되었다.. 또한, 이때 마우스의 체지방 측정 결과, 그라피스락톤 A의 ip 투여에 의하여 전신의 체지방이 약 2g 감소하는 것을 확인하였고, 이는 그라피스락톤 A에 의한 체중의 감소는 전신 체지방 감소에 기인하는 것을 의미한다.
또한, 혈장의 중성지방의 농도는 고지방식이에 의해 유의적으로 증가하는 것이 확인되었으며, 그라피스락톤 A 투여시에는 혈장의 중성지방의 농도를 감소시키는 경향을 나타내었다. 간독성 수치를 나타내는 AST, ALT는 모든 군에서 유의적인 차이를 보이지 않아 그라피스락톤 A 에 의해 간독성은 없는 것으로 확인되었다 (도9).
<실험예 7> 식이유도 동물모델의 지방간 감소 효과
그라피스락톤 A의 고지방식에 의해 유도된 지방간의 저해효과를 평가하기 위하여 상기 실험예 6과 같이 동물연구를 진행하였고, 부검 후 간조직을 10% 포르말린 용액에 고정 시킨 후 parafin wax를 이용하여 parafin section을 만들어 H&E (hematoxylin & eosin) 염색하였고, Kleiner D.E (Hepatology, 2005)의 histological scoring system에 따라 간조직의 지방간 정도를 평가하였다. H&E 염색된 간조직은 steatosis(지방증) 정도를 각 마우스의 간조직 무작위 5군데를 선정하여 0, 1, 2, 3의 score로 평가하고 이를 수치화 하였다.
도 10a 내지 도 10b를 살펴보면, 현미경 배율 200배에서 일반식이 마우스 간조직에 비해 고지방식이 마우스 간조직의 지방축적 (노란화살표)이 많이 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있으며, 고지방식이에 의해 증가된 지방축적이 그라피스락톤 A ip 투여에 의해 현저히 감소된 것을 관찰할 수 있다. 이때, steatosis정도를 수치화 해본 결과 고지방 식이에 의해 증가된 지방간증이 그라피스락톤 A에 의해 현저히 감소되는 것이 확인되었다.
<실험예 8> 비비만성 지방간질환 동물모델에서의 효과
간으로의 지방 축적에 대하여 그라피스락톤 A의 효과를 평가하기 위해 약 3주 동안 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식단(CDAHFD, A06071302, Research Diets)으로 동물 연구를 수행하였다. C57BL/6 마우스는 OrientBio Inc. (Seongnam, Korea)에서 구입했으며, 통제 된 온도 (22 ± 1 ℃), 습도 (55 ± 10%) 및 조도 (12 시간 명/암) 하 무균 시설에 수용시키고, 물과 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이 (CDAHFD) 또는 일반식이 (NCD,normal chow diet) (5053, Labdiet, St. Louis, MO)를 자유롭게 급여하였다. 체중변화는 일주일에 두 번씩 모니터링하였다. 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이 (CDAHFD) 투여 열흘 후 일주일간 10mg/kg 농도의 그라피스락톤 A를 ip injection하였으며 이후 모든 마우스는 간조직 수거 하였으며, 10% 포르말린 고정 및 H&E 염색을 <실험예 8>과 같이 수행하였으며, steatosis scoring 하였다. 모든 동물 실험 절차는 가천대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받아 진행되었다.
도 11a 내지 도 11b를 살펴보면, 현미경 배율 200배에서 마우스 간조직에 비해 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이 (CDAHFD) 에 의해 지방간질환이 유도된 마우스 간조직의 지방축적 (노란화살표)이 현저히 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있으며, 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이 (CDAHFD) 에 의해 지방간질환이 유도된 간조직의 지방축적이 그라피스락톤 A ip 투여에 의해 현저히 감소된 것을 관찰할 수 있다. 이때, steatosis정도를 수치화 해본 결과 그라피스락톤 A는 간으로의 지방의 축적을 저해하는 효과를 가지고 있음이 확인되었다.
도 12를 살펴보면, 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이(CDAHFD)에 의해 지방간질환이 유도된 마우스는 일반식이 마우스에 비해 체중 감소가 확인되었으며, 그라피스락톤 A에 의한 체중 변화는 없었다.
실험예 7 및 8에서 확인되는 바와 같이, 본 발명 그라피스락톤 A는 60% 고지방식이에 의해 유도되는 비만 마우스 모델의 지방간증의 완화 및 0.1 % 메티오닌과 콜린 무첨가 된 60 kcal% 지방의 L-아미노산 식이에 의해 유도되는 지방간 질환 마우스 모델의 지방간증의 완화가 모두 관찰되어 체중 증가에 의해 유도되는 지방간 및 체중 증가 없이 유도되는 지방간 모두에서 지방간 완화 효과가 확인되었다.
Claims (10)
- 그라피스락톤 A(Graphislactone A) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 비알콜성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 그라피스락톤 A(Graphislactone A)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
[화학식 1]
- 제1항에 있어서,
상기 비알콜성 지방간질환은 지방간 또는 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 그라피스락톤 A는 장내미생물 분비하는 대사산물인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 그라피스락톤 A는 백색지방의 전구세포의 분화 억제 또는 체내 중성지방의 축적 억제로부터 비만 또는 지방간을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 그라피스락톤 A는 대식세포의 전 염증 관련 유전자의 발현 억제, 염증 반응을 억제하는 것으로부터 비알콜성 지방간염을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 그라피스락톤 A 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 비알콜성 지방간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 그라피스락톤 A는 장내미생물 분비하는 대사산물인 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 비알콜성 지방간질환은 지방간 또는 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis)인 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 그라피스락톤 A는 백색지방의 전구세포의 분화 억제, 체내 중성지방의 축적 억제, 대식세포의 전 염증 관련 유전자의 발현 억제하는 것으로부터 비만 또는 비알콜성 지방간질환을 예방 또는 개선하는 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.
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