CN101323606B - 倍半萜香豆素醚的提取纯化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种化工技术领域的倍半萜香豆素醚的提取纯化方法，步骤为：第一步：将青蒿发根粉碎，用甲醇超声提取，将提取液旋转蒸发浓缩得到浸膏，通过乙酸乙酯和水双相分散萃取分层，取上层乙酸乙酯有机相作为萃取浓缩液；第二步：在上述的萃取浓缩液中加入吸附剂后进行柱层析，用石油醚和乙酸乙酯混合洗脱液洗脱，然后进行薄层层析收集含倍半萜香豆素醚的组分；第三步：将浓缩液进一步浓缩成浸膏后，用等体积甲醇分散，以尼龙膜过滤，经制备液相ODS RP-C18反相柱进行纯化，以甲醇和水的混合溶液进行洗脱，浓缩对应组分。本发明制备方法简单、制备原料易得，且可应用于化学预防和治疗肿瘤并开发相关抗肿瘤药物。

Description

倍半萜香豆素醚的提取纯化方法及其应用

技术领域

本发明涉及的是一种化工技术领域的方法，更具体地，涉及一种倍半萜香豆素醚的提取纯化方法及其应用。

背景技术

青蒿为我国著名的传统中草药，具有清热，解暑，除蒸；治温病，暑热，骨蒸劳热，疟疾，痢疾，黄疸，疥疮，瘙痒。青蒿根能治疗热骨蒸、关节酸痛、大便下血；果实(青蒿子)能清热泪盈眶明目，杀虫。其产生的抗疟倍半萜青蒿素被世界卫生组织认定为21世纪替代奎宁的最有效的抗菌素疟疾药。二次开发青蒿资源，产生新的具有生物活性的物质，是进一步利用中草药，实现中药现代化的有利手段。利用发根快速生产的特征，大规模生产植物次级代谢物一直是植物细胞工程的常用技术；利用发根积累次级代谢产物的特点还可以用来发现植物本身低含量的次级代谢产物，从而完善植物的代谢谱，并且可以发现新的生物活性物质，并以此为模型研究植物的次级代谢调控规律，具有重要的生产潜力和学术价值。

倍半萜香豆素醚(Drimartol A)为白色针状晶体，在薄层硅胶板GF254上紫外下显兰色荧光。

经过对现有技术的检索发现，在期刊Journal of Natural Products第45卷第四期，New sesquiterpene-courmain from Achillea and Artemisiaspecies一文中，报道了从西北蒿，伊朗蒿，老人蒿，蓍草和毛连蒿中分离到倍半萜香豆素醚的例子，但是在该文献中的方法采用石油醚冷浸提取的方法，此方法分离时间长，分离效率低，消耗溶剂多。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种倍半萜香豆素醚的提取纯化方法及其应用。该制备方法简单、制备原料易得；同时由于该化合物具有明显的抗肿瘤活性，因此可以应用于化学预防和治疗肿瘤和开发相关抗肿瘤药物。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明所涉及的倍半萜香豆素醚的提取纯化方法包括以下步骤：

第一步、提取：将青蒿发根粉碎，用5到10倍体积量的甲醇作为溶剂进行超声提取，超声2到5次，将提取液旋转蒸发，浓缩得到浸膏，通过乙酸乙酯和水双相分散，萃取分层，取上层乙酸乙酯有机相，浓缩至原体积的1/20时，用于下一步的柱层析；

所述超声提取，每次持续时间为30分钟。

第二步、分离：在上述的萃取浓缩液中加入吸附剂，成固体粉末状，然后上硅胶柱进行柱层析，用石油醚和乙酸乙酯混合洗脱液进行洗脱，然后进行薄层层析检测，收集含所述倍半萜香豆素醚的组分，浓缩得到倍半萜香豆素醚的浓缩液；

所述吸附剂为100到200目的硅胶。

所述硅胶柱为100到200目，且规格为4040×800mm的硅胶柱。

所述石油醚和乙酸乙酯的混合洗脱液是指石油醚与乙酸乙酯的体积比为1比3的混合溶液。

第三步、纯化：将第二步中得到的浓缩液进一步浓缩成浸膏后，用等体积甲醇分散，以尼龙膜过滤，经制备液相ODS RP-C18反相柱进行纯化，以甲醇和水的混合溶液进行洗脱，浓缩对应组分。

所述尼龙膜是指孔径为0.45um的尼龙膜。

所述甲醇和水的混合溶液是指甲醇体积比例为78％，水的体积比例为22％的混合溶液。

采用本发明方法得到的倍半萜香豆素醚，可以应用于肿瘤的预防和治疗。所述肿瘤为肺癌、卵巢癌、肝癌、子宫颈癌、高转移肺癌和胰腺癌中的一种或几种。

本发明首次从青蒿发根中分离得到倍半萜香豆素醚，制备方法简便、原料易得，采用甲醇超声萃取，进一步可用柱层析纯化结晶，还可用制备液相直接分离纯化出高纯度的晶体，为大规模工业自动化生产提供了可能。大大节省了分离时间，提高了分离效率。由此，本发明也用于可开发上述含有倍半萜香豆素醚的植物资源。

本发明还首次发现倍半萜香豆素醚具有明显的抗肿瘤活性，通过流式细胞仪分析了倍半萜香豆素醚对肿瘤细胞周期的影响，在此基础上提供了其在肿瘤预防治疗中的实际应用，对于开发相关抗肿瘤药物以及青蒿资源的二次开发均具有重要意义。

附图说明

图1倍半萜香豆素醚对六个肿瘤细胞株的生长抑制示意图。

图2倍半萜香豆素醚对H08910细胞形态学的影响图；

其中：A为DMSO对照组的正常细胞形态；B为倍半萜香豆素醚组诱导H08910细胞凋亡形态图。

图3倍半萜香豆素醚的制备液相色谱图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

倍半萜香豆素醚的制备

1.将菊科艾属植物青蒿诱导得到的发根进行培养，培养条件为：基础MS培养基+蔗糖30g/L，光周期：光照16h/黑暗8h，25℃，摇床转速110r/min；获得生长到稳定期的青蒿发根；

2.将生长到稳定期的青蒿发根200g取出晒干后，用粉碎机粉碎，粉碎过的样品均需过60目筛。未能过筛部分再次粉碎或经研钵内研磨之后再过筛，直至全部样品过筛为止；

3.以2L甲醇浸泡样品粉末，超声2次，每次30min，中间摇匀，间隔10min，注意控制水温不超过50℃。提取完毕后，过滤，取滤液，旋转蒸发后浓缩得棕色浸膏(15g左右)，再用1L体积比为1∶1的乙酸乙酯和水双相萃取，取上层乙酸乙酯有机相，将有机相旋转蒸发减压浓缩至萃取体积的约1/20(约25mL)时，加入吸附剂(硅胶100~200目)，成固体粉末状。然后上硅胶柱进行柱层析(硅胶100~200目，硅胶柱规格：40×800mm)，用体积比为1比3的石油醚和乙酸乙酯的混合洗脱液进行洗脱；然后用TLC薄层检验倍半萜香豆素醚的存在，在GF254的硅胶板上，以体积比为1∶3的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，紫外下显蓝色荧光，RF值0.5左右。

4.收集含所述倍半萜香豆素醚的组分，旋转蒸发，浓缩得到所述倍半萜香豆素醚。纯度约为85％，进一步，用少量甲醇完全溶解所得产物，于-20℃重结晶，可得到纯度大于98％的晶体220mg。该化合物倍半萜香豆素醚为白色针状晶体。

5.高分辨质谱得到该化合物的精密质量数为442.2357，推算其分子式为C₂₆H₃₄O₆。

由1H和13C-NMR数据以及文献(Bohlmann，F.etal.，Chem.Ber.，1974.(107)：644；1975.(108)：1902)数据对比得知此物质为倍半萜香豆素醚。

6.将所分离得到的倍半萜香豆素醚用DMSO溶解配成5mg/mL的浓缩液，分别进行细胞毒性实验和细胞周期实验。

实施例2

倍半萜香豆素醚drimartolA的柱层析分离

1.将生长到稳定期(14~18天)的青蒿发根200g取出晒干后，用粉碎机粉碎，粉碎过的样品均需过60目筛。未能过筛部分再次粉碎或经研钵内研磨之后再过筛，直至全部样品过筛为止。

2.以2L甲醇浸泡样品粉末，超声五次，每次30min，注意控制水温不超过50℃。提取完毕后，过滤，取滤液，旋转蒸发后浓缩得棕色浸膏(17.3g左右)，直接用石油醚∶乙酸乙酯(体积比1∶3)50mL分散所得浸膏，可辅助超声5~10min，然后过滤，将滤液应用于硅胶柱进行柱层析(硅胶100~200目，硅胶柱规格：40×800mm)，用石油醚∶乙酸乙酯(体积比1∶3)洗脱。用TLC薄层检验DrimartolA的存在，在GF254的硅胶板上，以石油醚∶乙酸乙酯(体积比1∶3)为展开剂，紫外下显蓝色荧光，RF值0.5左右。

3.收集含所述倍半萜香豆素醚DrimartolA的组分，旋转蒸发，浓缩得到所述倍半萜香豆素醚。纯度约为83％，进一步，用少量甲醇完全溶解所得产物，于-20℃重结晶，可得到纯度大于98％的晶体233mg。

实施例3

倍半萜香豆素醚drimartolA的制备液相分离法

1.将生长到稳定期(14~18天)的青蒿发根200g取出晒干后，用粉碎机粉碎，粉碎过的样品均需过60目筛。未能过筛部分再次粉碎或经研钵内研磨之后再过筛，直至全部样品过筛为止。

2.以2L甲醇浸泡样品粉末，过夜，超声三次，每次30min，中间摇匀，间隔5~10min，注意控制水温不超过50℃。提取完毕后，过滤，取滤液，旋转蒸发后浓缩得棕色浸膏(15.8g左右)，再用1L乙酸乙酯和水(体积比1∶1)双相萃取，取上层乙酸乙酯有机相，将有机相旋转蒸发减压浓缩成浸膏(约9.6g)，再用萃取体积的1/20的甲醇重新分散浸膏(可以辅助用超声超5~10分钟)，用0.45m的尼龙滤膜过滤，取滤液用于制备液相的分离纯化。

色谱条件为：

色谱柱：大连依利特Hypersil ODS2，5m，10×250mm；

流速：3.6mL/min；

检测波长：220nm；

流动相：甲醇∶水＝78∶22(v/v)

等梯度洗脱，目的产物Drimartol A出峰时间约为21.2min。

收集相应组分旋转蒸发浓缩后，可得纯度大于98％的倍半萜香豆素醚纯品257mg。

实施例4

细胞毒性实验

实验材料：细胞株：A-549(人肺癌细胞)，HO8910(人卵巢癌细胞)，QGY(人肝癌细胞株)，Hela(人子宫颈癌细胞)，95D(人高转移肺癌细胞)，SW1990(人胰腺癌细胞株)均购自中国科学研究院上海细胞所。SW1990，HO8910，QGY，Hela，95D细胞均用RPMI1640培养基加10％胎牛血清常规培养传代，A549细胞用F12K培养基加10％胎牛血清常规培养传代，各细胞置5％CO₂培养箱，37℃培养。

实验方法：国际通用的MTT法：根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以100L/孔接种于96孔培养板，接种密度为10000~20000/孔，贴壁生长5~18h再加药1L/孔。每个浓度设5个复孔。并设置相应浓度的溶媒对照以及无细胞调零孔。每个细胞株重复5次。肿瘤细胞在37℃，5％CO₂条件下培养24小时。药物作用结束前4小时，加MTT，终浓度为50g/mL。5％CO₂孵箱37℃继续孵育4小时后，在酶标仪上测定570nm和630nm的吸光度值。计算抑制率。

细胞抑制率＝[1-(测试组OD平均值-空白组OD平均值)/(对照组OD平均值-空白组OD平均值)]×100％。

实验结果：参见表1和图1，化合物倍半萜香豆素醚能够抑制A-549，HO8910，QGY，Hela，95D，SW1990的生长，IC50见表1。由表1可知化合物倍半萜香豆素醚对各个肿瘤细胞的IC50均小于20g/mL，可以认为倍半萜香豆素醚具有明显的抗肿瘤活性和宽广的抗肿瘤谱。

表1  倍半萜香豆素醚对六个肿瘤细胞株的IC50(g/mL)值

细胞株	A-549	HO8910	QGY	Hela	95D	SW1990
							IC50(g/mL)	8.78±1.04	7.93±0.69	9.24±0.7	9.21±0.35	9.86±0.31	12.6±1.2

实施例5

细胞周期实验

1.实验方法：常规培养法培养Hela细胞，给药，以等体积溶媒作为对照，24小时后收集细胞，用PBS洗两次后以70％酒精固定过夜。1000rpm/10min离心去乙醇，用含1％胎牛血清的PBS洗两次，再以含1％胎牛血清的PBS重悬，调整细胞浓度约10⁶个/mL，加入无DNA酶的RNA酶，终浓度为100U/mL，37℃保温30min，加入PI，终浓度为50g/mL，在暗中常温下反应30min，冰上放置20min后，进行流式细胞仪检测，每次记录30000个细胞。

2.实验结果：化合物倍半萜香豆素醚在20g/mL，作用24小时后，可使Hela细胞周期停止在G₀/G₁期。实验结果见表2。

表2  化合物倍半萜香豆素醚对Hela肿瘤细胞周期的影响

实施例6

细胞形态学观察

1.实验方法：培养方法同实施例2，待HO8910细胞长至80％汇合，加入倍半萜香豆素醚20μg/mL作用24h后，再加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，制备单细胞悬液，调细胞浓度为10⁷/mL，取细胞悬液25μl，加2μL AO染液(100μg/ml)及2μL EB染液(100μg/mL)，滴于载玻片，盖片封片后荧光显微镜直接观察，于20min内计数500个细胞。溶媒对照组加等体积DMSO，阳性对照喜树碱加药浓度为0.5μg/mL。

AO吖啶橙/EB双荧光染色法是一种鉴别细胞坏死和凋亡的简便方法。AO能够进入正常细胞膜的细胞中，与DNA结合显绿色/黄绿色荧光。早期凋亡细胞的细胞膜正常，胞浆浓缩，核DNA浓缩致密，低倍镜下呈荧光亢进的圆珠状小体，高倍镜下可见不规则的块状荧光。晚期凋亡细胞胞膜通透性破坏被EB染成红色，核形态与早期凋亡细胞相似，或为浓染的红色碎片(核碎裂)或凋亡小体。而细胞坏死时，细胞膜的完整性早期即被破坏，线粒体明显肿胀，细胞体积明显增大，呈不均匀的橙红色荧光。

2.实验结果：观察倍半萜香豆素醚对HO8910细胞形态学的影响，发现在20g/mL对HO8910细胞能引起凋亡形态学变化，阳性药喜树碱也能引起相似的凋亡形态学变化，实验结果见附图2。

综上所述，倍半萜香豆素醚具有明显的抗肿瘤活性，可用于化学预防和治疗肿瘤和开发相关抗肿瘤药物。

Claims (7)

1.一种倍半萜香豆素醚Drimartol A的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步、提取：将青蒿发根粉碎，用5到10倍体积量的甲醇作为溶剂进行超声提取，超声2到5次，将提取液旋转蒸发，浓缩得到浸膏，通过乙酸乙酯和水双相分散，萃取分层，取上层乙酸乙酯有机相，浓缩至原体积的1/20时，用于下一步的柱层析；

第二步、分离：在上述的萃取浓缩液中加入吸附剂，成固体粉末状，然后上硅胶柱进行柱层析，用石油醚和乙酸乙酯混合洗脱液进行洗脱，然后进行薄层层析检测，收集含所述倍半萜香豆素醚Drimartol A的组分，浓缩得到倍半萜香豆素醚浓缩液；

第三步、纯化：将第二步中得到的浓缩液进一步浓缩成浸膏后，用等体积甲醇分散，以尼龙膜过滤，经制备液相ODS RP-C18反相柱进行纯化，以甲醇和水的混合溶液进行洗脱，浓缩对应组分。

2.根据权利要求1所述的倍半萜香豆素醚Drimartol A的提取纯化方法，其特征是，第一步中，所述所述超声提取，每次持续时间为30分钟。

3.根据权利要求1所述的倍半萜香豆素醚Drimartol A的提取纯化方法，其特征是，第二步中，所述吸附剂为100到200目的硅胶。

4.根据权利要求1所述的倍半萜香豆素醚Drimartol A的提取纯化方法，其特征是，第二步中，所述硅胶柱为100到200目，且规格为4040×800mm的硅胶柱。

5.根据权利要求1所述的倍半萜香豆素醚Drimartol A的提取纯化方法，其特征是，第二步中，所述石油醚和乙酸乙酯的混合洗脱液是指石油醚与乙酸乙酯的体积比为1比3的混合溶液。

6.根据权利要求1所述的倍半萜香豆素醚Drimartol A的提取纯化方法，其特征是，第三步中，所述尼龙膜是指孔径为0.45um的尼龙膜。

7.根据权利要求1所述的倍半萜香豆素醚Drimartol A的提取纯化方法，其特征是，第三步中，所述甲醇和水的混合溶液是指甲醇体积比例为78％，水的体积比例为22％的混合溶液。

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