CN110974871A - 一种蓝桉果实提取物及其在抗髓母细胞瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中医药领域，具体公开了一种蓝桉果实醇提物及组分在制备预防和/或治疗抗髓母细胞瘤的药物中的应用。本发明对蓝桉果实的有效组分进行提取，利用髓母细胞瘤细胞进行活性筛选，实验结果表明，蓝桉果实醇提物及其组分能有效的抑制髓母细胞瘤增殖活性，在制备开发治疗肿瘤疾病药物方面具有很好的应用前景。

Description

一种蓝桉果实提取物及其在抗髓母细胞瘤中的应用

技术领域

本发明属于中医药领域，涉及蓝桉果实提取物及其组分作为抑制髓母细胞瘤增殖活性的新用途及其应用。

背景技术

髓母细胞瘤(medulloblastoma，MB)是中枢神经系统恶性肿瘤中具有高侵染力的一种肿瘤，由原始神经干细胞演化而来，此类细胞有向神经元或神经胶质细胞等多种方向分化的潜能，属于原始神经外胚层肿瘤。髓母细胞瘤为最常见的儿童恶性肿瘤，常发生于0～8岁的儿童中，成年人中也偶有发生。虽然其发病率仅占儿童肿瘤的25％，但因该肿瘤具有恶性程度高，临床进展快，侵袭性强，易通过脑脊髓播散等特点，死亡率却居儿童恶性肿瘤之首。目前，关于髓母细胞瘤仍无特效的治疗方法和合适的药物，主要的治疗途径包括外科手术、放疗和化疗，但其五年生存率只有60％左右，并且多数患者都长期遭受治疗副作用的折磨，与外科手术相结合的常规疗法、放疗及化疗往往会导致永久性神经认知障碍。因此，寻求更为安全有效的诱导髓母细胞瘤分化和凋亡的化疗药物作为可靠的辅助性治疗手段，已成为改善原发性脑恶性肿瘤治疗现状的当务之急，具有重要的理论及临床应用价值。

从天然产物中寻求有效且无明显毒副作用的抗髓母细胞瘤药物具有很好的开发潜力及应用前景。蓝桉(Eucalyptus globulus Labill.)为桃金娘科桉属植物，原产于澳大利亚，现西班牙、葡萄牙、刚果、南非、中国的云南、广东、广西、福建、浙江、江西等地均有栽培。蓝桉的叶和果实均可入药，为我国传统民间中草药，临床多用其果实，入药俗称“一口钟”或“一口盅”。味微苦、性平，具有疏风散热、抑菌消炎、防腐止痒等功效，主要用于预防流行性感冒、流行性脑脊髓膜炎，治疗上呼吸道感染、咽喉炎、支气管炎、肺炎等；外用治疗烧烫伤、蜂窝组织炎。目前对蓝桉果实已报道的化学成分主要含有萜类、黄酮类、鞣质和间苯三酚衍生物等。对蓝桉药理作用的研究发现其具有抑菌、镇痛抗炎、免疫调节、预防心肌缺血、抗白血病、治疗哮喘等作用。目前尚未见有关于蓝桉果实及其组分抑制髓母细胞瘤增殖方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是对蓝桉果实化学组分及用途进行深入研究和探索，从而提供了蓝桉果实提取物及其组分在抑制髓母细胞瘤增殖方面的新用途及抗肿瘤药物中的应用。

本发明提出了蓝桉果实提取物及其组分在制备治疗和/或预防抗髓母细胞瘤的药物中的应用。其中，所述蓝桉果实提取物及其组分是指蓝桉果实醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分。

蓝桉果实醇提物为蓝桉果实用95％乙醇浸泡提取、过滤、浓缩干燥后得到的乙醇粗提物。石油醚组分、乙酸乙酯组分分别为蓝桉果实乙醇粗提物经石油醚、乙酸乙酯溶剂萃取后得到的相应组分。

所述蓝桉果实醇提物及其组分包括萜类、甾醇类、黄酮类、酰基间苯三酚衍生物。

其中，所述蓝桉果实醇提物及其组分用于抑制髓母细胞瘤细胞的增殖、生长、迁移、浸润、复发、耐药以及促进髓母细胞瘤细胞的凋亡。

其中，所述髓母细胞瘤包括髓母细胞瘤细胞MB39、髓母细胞瘤细胞Daoy、等。

其中，所述蓝桉果实醇提物及其组分的制备方法为室温溶剂浸泡提取、溶剂萃取及硅胶柱色谱分离法，具体包括以下步骤：

(1)取蓝桉的干燥果实粉碎，加入95％乙醇室温(20-25℃)浸泡三次，每次12小时，滤出提取液，减压浓缩干燥后得到蓝桉果实乙醇粗提物；

(2)取蓝桉果实乙醇粗提物，加入去离子水溶解后，依次加入等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取，反复萃取三次，将萃取液减压浓缩干燥，分别得到石油醚层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、水层萃取物；

(3)取乙酸乙酯层萃取物，采用100-200目硅胶进行硅胶柱层析，依次用洗脱溶剂石油醚：乙酸乙酯(体积百分比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙酸乙酯、乙酸乙酯：乙醇(体积百分比为50:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙醇进行梯度洗脱，分离得到40个(Fr.1-40)洗脱组分。

所述蓝桉果实醇提物是指蓝桉果实用95％乙醇浸泡提取、过滤、浓缩干燥后得到的乙醇粗提物。

所述石油醚组分、乙酸乙酯组分、正丁醇组分分别是指蓝桉果实乙醇粗提物经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂萃取浓缩后得到的相应组分。

用本发明所述的上述方法制备得到的蓝桉果实醇提物及组分可用于抗髓母细胞瘤活性的筛选。

本发明还提出了一种抑制髓母细胞瘤体外细胞增殖的中药提取物及其组分，所述中药提取物包括所述蓝桉果实醇提物及组分。

其中，所述蓝桉果实醇提物包括萜类、甾醇类、黄酮类及酰基间苯三酚衍生物等。

所述组分为石油醚组分、乙酸乙酯组分，所述石油醚组分、乙酸乙酯组分分别为蓝桉果实乙醇粗提物经石油醚、乙酸乙酯溶剂萃取后得到的相应组分。

本发明还提出了一种蓝桉果实醇提物及其组分的制备方法，包括以下步骤：

(1)取蓝桉的干燥果实粉碎，加入95％乙醇室温(20-25℃)浸泡三次，每次12小时，滤出提取液，减压浓缩干燥后得到蓝桉果实乙醇粗提物；

(2)取蓝桉果实乙醇粗提物，加入去离子水溶解后，依次加入等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取，反复萃取三次，将萃取液减压浓缩干燥，分别得到石油醚层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、水层萃取物；

(3)取乙酸乙酯层萃取物，采用100-200目硅胶进行硅胶柱层析，依次用洗脱溶剂石油醚：乙酸乙酯(体积百分比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙酸乙酯、乙酸乙酯：乙醇(体积百分比为50:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙醇进行梯度洗脱，分离得到40个(Fr.1-40)洗脱组分。

本发明还提出了由上述方法制备得到的蓝桉果实醇提物及组分。

本发明同时使用人和小鼠髓母细胞瘤细胞作为活性组分筛选的细胞筛选模型，以保证活性测试数据的准确性和完整性，检测了蓝桉果实醇提物及其组分在细胞水平的抗肿瘤活性。结果表明所述的蓝桉果实醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分，及由乙酸乙酯组分分离得到的有效组分Fr.4-Fr.18对髓母细胞瘤细胞具有显著的抑制增殖活性。其中，醇提物是总的粗提物，石油醚组分和乙酸乙酯组分是由总粗提物萃取分离得到的，有效组分Fr.4-Fr.18又是由乙酸乙酯组分经硅胶柱色谱分离得到的。

本发明的有益效果在于：蓝桉果实醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分及其有效组分Fr.4-Fr.18可用于有效抑制髓母细胞瘤的细胞增殖，并可作为药物原料，在制备治疗开发抗髓母细胞瘤的药物等方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为蓝桉果实醇提物及组分对髓母细胞瘤抑制其增殖活性的数据图。

图2为蓝桉果实醇提物乙酸乙酯组分抑制髓母细胞瘤增殖活性的数据图(横坐标代表从乙酸乙酯组分中分离得到的部分组分Fr.3-Fr.26)。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1蓝桉果实提取物及其组分的提取分离

取蓝桉的干燥果实充分粉碎，加入95％的乙醇常温浸泡，滤出提取液，浓缩干燥后得到蓝桉果实乙醇粗提物。取蓝桉果实乙醇粗提物，加入去离子水溶解后，依次加入等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取，将萃取溶剂浓缩干燥，分别得到石油醚层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、水层萃取物。取乙酸乙酯层萃取物，采用100-200目硅胶进行硅胶柱层析，依次用洗脱溶剂石油醚：乙酸乙酯(体积百分比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙酸乙酯、乙酸乙酯：乙醇(体积百分比为50:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙醇进行梯度洗脱，依据溶剂洗脱顺序依次接收，根据薄层点板结果将相同部分合并，依次得到40个(Fr.1-40)洗脱组分。

实施例2髓母细胞瘤细胞筛选模型的建立

为了确保活性筛选结果的准确性和可靠性，本发明同时使用两种髓母细胞瘤细胞系MB39(小鼠髓母细胞瘤细胞系)、Daoy(人髓母细胞瘤细胞系)，作为活性组分筛选的细胞筛选模型，以保证活性测试数据的准确性和完整性。

实施例3蓝桉果实醇提物及其组分抑制髓母细胞瘤增殖活性测试

在生物活性筛选时，选用CCK8来分析检测醇提物及其组分(包括石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及组分Fr.1-40)对髓母细胞瘤细胞的抑制情况。CCK8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪测定450nm波长处OD值，间接反映活细胞数量。当在该细胞模型中加入要测试的提取物后，具有活性的组分能够抑制细胞增长甚至杀死细胞，使得活细胞数目降低。通过检测OD值的高低，即能判断被测组分活性的大小。

具体实验步骤为：

(1)细胞接种：肿瘤细胞(髓母细胞瘤MB39、髓母细胞瘤Daoy)按照一定的数量接种在96孔板中，过夜培养；

(2)细胞给药：设置空白组(未接种细胞)、对照组(添加与给药组相同体积的DMSO)，给药组(蓝桉果实醇提物及其组分，母液浓度为30mg/mL)；

(3)初筛：蓝桉果实醇提物及其组分作用于肿瘤细胞，蓝桉果实醇提物及其组分的终浓度为30μg/ml；

(4)复筛：将初筛有效的(抑制率超过50％)组分配成一系列浓度梯度(30、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL)，依次稀释7个浓度；

(5)给药后，37℃，5％CO₂，95％湿度培养箱中孵育72h；

(6)移除旧培养基，每孔CCK8和培养基按照10μL和100μL的体积混合加入，培养1-4h，酶标仪检测450nm OD值；

(7)数据统计计算

细胞活力(％)＝【(给药组-空白组)/(对照组-空白组)】*100％

抑制率(％)＝(1-细胞活力)*100(％)

蓝桉果实醇提物及其组分对髓母细胞瘤细胞增殖的影响结果见图1、图2。

实验结果表明，蓝桉果实醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分(用药浓度30μg/mL)都对髓母细胞瘤细胞具有较强的抑制作用，抑制率明显高于正丁醇组分，并且这两种肿瘤细胞活性筛选结果一致(图1)。

对乙酸乙酯组分进一步分离纯化，同时对分离得到的各组分进行抗肿瘤活性筛选。由筛选结果可以看出，由乙酸乙酯组分分离得到的部分组分之间抑制髓母细胞瘤增殖活性差异较大，主要的活性部位集中在组分Fr.4-Fr.18之间，其中以组分Fr.10、Fr.13活性最强，在两种髓母细胞瘤上抑制率均超过90％(图2)。其中组分Fr.6、Fr.10、Fr.13在髓母细胞瘤MB39细胞上的IC₅₀分别为6.41μg/mL、9.64μg/mL、15.68μg/mL(表1)。

表1.三个组分Fr.6、Fr.10、Fr.13对髓母细胞瘤MB39细胞增殖抑制率及IC₅₀值

30μg/mL组分	抑制率(％)	IC<sub>50</sub>(μg/mL)
			Fr.6	90.34	6.41
Fr.10	90.80	9.64
			Fr.13	90.31	15.68

本发明保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (8)

1.蓝桉果实醇提物及其组分在制备治疗和/或预防抗髓母细胞瘤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蓝桉果实醇提物及其组分用于抑制髓母细胞瘤细胞的增殖、生长、迁移、浸润、复发、耐药以及促进髓母细胞瘤细胞的凋亡。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述髓母细胞瘤细胞包括髓母细胞瘤细胞MB39、髓母细胞瘤细胞Daoy。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蓝桉果实醇提物及其组分包括萜类、甾醇类、黄酮类、酰基间苯三酚衍生物。

5.一种抑制髓母细胞瘤体外细胞增殖的中药提取物，其特征在于，所述中药提取物包括蓝桉果实醇提物及其组分。

6.根据权利要求5所述的中药提取物及其组分，其特征在于，所述蓝桉果实醇提物及其组分包括萜类、甾醇类、黄酮类、酰基间苯三酚衍生物。

7.根据权利要求1所述的应用或权利要求5所述的中药提取物及其组分，其特征在于，所述蓝桉果实醇提物及其组分的制备方法具体包括以下步骤：

(1)蓝桉的干燥果实粉碎，95％乙醇浸泡三次，每次12小时，滤出提取液，减压浓缩，干燥后得到蓝桉果实乙醇粗提物；

(2)取蓝桉果实乙醇粗提物，加入去离子水充分溶解，依次加入等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取，反复萃取三次，萃取液减压浓缩干燥，分别得到石油醚层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、水层萃取物；

(3)取乙酸乙酯层萃取物，采用100-200目硅胶进行硅胶柱层析，依次用体积百分比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、1:1的石油醚：乙酸乙酯，纯乙酸乙酯，体积百分比为50:1、10:1、5:1、1:1的乙酸乙酯：乙醇，纯乙醇进行梯度洗脱，分离得到40个洗脱组分Fr.1-40。

8.一种蓝桉果实醇提物及其组分的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)蓝桉的干燥果实粉碎，95％乙醇浸泡三次，每次12小时，滤出提取液，减压浓缩，干燥后得到蓝桉果实乙醇粗提物；

(2)取蓝桉果实乙醇粗提物，加入去离子水充分溶解，依次加入等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取，反复萃取三次，萃取液减压浓缩干燥，分别得到石油醚层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、水层萃取物；

(3)取乙酸乙酯层萃取物，采用100-200目硅胶进行硅胶柱层析，依次用体积百分比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、1:1的石油醚：乙酸乙酯，纯乙酸乙酯，体积百分比为50:1、10:1、5:1、1:1的乙酸乙酯：乙醇，纯乙醇进行梯度洗脱，分离得到40个洗脱组分Fr.1-40。

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