CN112159318B - 一种具有抗病毒活性的大叶桉酮及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗病毒活性的大叶桉酮及其制备方法和用途，属于植物化学和药物领域，具体涉及一种具有抗病毒活性的大叶桉酮G，其结构式如式I所示，还涉及大叶桉酮G的制备方法，含有作为活性药物成分的大叶桉酮G的药物组合物，以及大叶桉酮G的制药用途。大叶桉酮G对于黄病毒属病毒，尤其是寨卡病毒具有显著的抑制作用，可以用于治疗由寨卡病毒所导致的疾病。

Description

一种具有抗病毒活性的大叶桉酮及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于植物化学和药物技术领域，具体而言，涉及一种具有抗病毒活性的大叶桉酮G(Eucalyprobusone G)化合物，含有该化合物的药物组合物，该化合物的制备方法，以及该化合物在制备用于抗黄病毒药物中的应用。

背景技术

寨卡病毒(Zika Virus，ZIKV)是一种典型的通过蚊媒进行传播的病毒，与登革病毒(DENV)、西尼罗病毒(WNV)、黄热病毒(YTV)和日本脑炎病毒(JEV)等病毒一样，属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)。寨卡病毒是一种具有包膜的RNA病毒，病毒基因组全长约11kb，包含两个位于序列两端的非编码区和一个开放阅读框(open readingframe,OFC)。开放阅读框能够翻译出一条多聚蛋白，在宿主和病毒蛋白酶共同作用下，多聚蛋白被加工成三种结构蛋白和七种非结构蛋白(non-structural,NS)。结构蛋白分别为衣壳蛋白(capsid,C)、前体膜蛋白/膜蛋白(premembrane and membrane,prM/M)以及包膜蛋白(envelope,E)，非结构蛋白分别为NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。三种结构蛋白主要在病毒颗粒形成、结合、病毒包膜与宿主细胞膜的融合以及进入宿主细胞环节中发挥作用，七种非结构蛋白主要参与病毒复制、RNA释放以及逃逸宿主免疫防疫。分子生物学和生物信息学表明，寨卡病毒主要存在亚洲型和非洲型两个亚型。

寨卡病毒主要通过伊蚊类蚊媒叮咬传播，但最近的报道表明该病毒有可能通过血液，性和母婴传播。截至2019年5月，全球已有84个国家和地区被发现受到寨卡病毒的威胁。寨卡病毒感染人体后，一般表现为无症状感染，少数感染者表现为发烧、头痛、发热、关节痛、皮疹、结膜炎等，一般具有自限性，患者在感染3-7天后即可自愈。然而，近年来越来越多的研究表明寨卡病毒感染与神经系统疾病直接相关，例如成人感染可导致格林巴利综合症(Guillain-BarméSyndrome,GBs)，孕妇感染可导致胎儿先天性小头畸形。

目前抗寨卡病毒药物主要是通过抑制ZIKV的结构蛋白、非结构蛋白以及作用于宿主的相关因子来发挥疗效。相关文献报道，抗寄生虫药苏拉明可以影响寨卡病毒的结合以及与宿主细胞的附着。S-腺苷基-同型半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine,SAH)和SAM类似物西奈芬净(Sinefungin)是NS5甲基转移酶抑制剂，其IC₅₀值分别为0.43μM和1.18μM。腺苷类似物BCX4430能抑制病毒RNA聚合酶的功能，终止RNA链的合成。麦考酚酸、利巴韦林、嘧啶合成抑制剂Brequinar也具有抗寨卡病毒活性。

然而，截至目前尚没有抗寨卡病毒的药物获批临床应用，因此大多数临床治疗策略均采用对症支持治疗，包括休息、补液、使用镇痛剂和/或解热剂等。天然产物具有丰富的结构类型，是药物研发的重要资源之一，从天然产物中寻找具有抗寨卡病毒(黄病毒)的先导化合物有着巨大的潜力。

发明内容：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的天然产物，即大叶桉酮G(Eucalyprobusone G)化合物，为黄病毒属病毒，尤其是寨卡病毒的治疗提供可选的替代品。

本发明的目的通过以下技术方案来实现。

在第一方面，本发明提供了一种大叶桉酮G化合物，其具有下述式I所示的结构式：

在第二方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含作为活性药物成分的上文式I所示的大叶桉酮G化合物或其衍生物，以及药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂。

在第三方面，本发明涉及上文式I所示大叶桉酮G化合物或其衍生物在制备用于治疗抗病毒药物中的应用。

在优选实施方案中，所述病毒是黄病毒属中的病毒，优选，所述病毒是寨卡病毒。

在第四方面，本发明提供了制备上文式I所示大叶桉酮G化合物的方法，包括以下步骤：

1)将桉属(Eucalyptus L.Herit)植物材料干燥、粉碎，采用有机溶剂浸提后脱溶，得到桉属植物提取物；

2)对所述桉属植物提取物依次采用柱层析、结晶、重结晶，得到大叶桉酮G。

在优选实施方案中，有机溶剂包括石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈和甲酸中的至少一种。

与现有技术相比，本发明具有明显的有益效果。具体而言，本发明的大叶桉酮G通过抑制黄病毒，尤其是寨卡病毒的非结构蛋白NS5中RNA依赖性RNA聚合酶结构域(RdRp)，在细胞水平上对不同寨卡病毒株具有显著的抑制活性，优于阳性对照药利巴韦林。

附图说明

图1为本发明化合物大叶桉酮G化合物的化学结构式。

图2为本发明化合物大叶桉酮G的单晶衍射图。

图3显示了本发明化合物的大叶桉酮G对ZIKV感染诱导噬斑形成的影响。A：噬斑检测大叶桉酮G对ZIKV SZ-WIV01感染诱导噬斑形成的影响；B：噬斑检测大叶桉酮G对ZIKVMR766感染诱导噬斑形成的影响；C：MTT检测大叶桉酮G对Vero细胞的毒性。

图4显示了本发明化合物大叶桉酮G抑制ZIKV复制。A：通过qRT-PCR检测大叶桉酮G对病毒产量的影响；B：通过蛋白质印记(Western blot)检测大叶桉酮G对ZIKV蛋白表达的影响；C：通过免疫荧光检测大叶桉酮G病毒复制的影响。Mock：未感染的细胞；DMSO：感染ZIKV的细胞。

图5显示了本发明化合物大叶桉酮G对不同细胞中ZIKV复制的影响。A：qRT-PCR检测大叶桉酮G对Huh-7细胞中ZIKV复制的影响；B：qRT-PCR检测大叶桉酮G对A-549细胞中ZIKV复制的影响。显示的结果是三个独立实验的平均值(±SD)，DMSO作为对照。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。

图6显示了本发明化合物大叶桉酮G抑制ZIKV与宿主细胞的结合和内化。A：qRT-PCR检测大叶桉酮G对ZIKV结合宿主细胞的影响；B：流式细胞术检测大叶桉酮G对AXL表达的影响。

图7显示了通过分时给药实验检测本发明化合物大叶桉酮G对ZIKV的作用阶段。A：分时给药示意图；B：分时给药检测大叶桉酮G作用阶段。DMSO作为对照。**p<0.01；****p<0.001。

图8显示了本发明化合物大叶桉酮G抑制ZIKV的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)活性。A：在NS5表达的HEK-293T细胞中，大叶桉酮G呈剂量依赖型方式降低Gluc的活性，而对NS5的表达没有影响；B：在只表达Gluc的HEK-293T细胞中，大叶桉酮G对Gluc的活性没有影响。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的优选实施方案。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方案。相反，提供这些实施方案的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所用的术语只是为了描述具体的实施方案的目的，并非旨在限制本发明的范围。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

根据第一方面，本发明提供了一种大叶桉酮化合物G，其属于酰基间苯三酚二聚体类化合物，其结构式如下式I所示：

大叶桉酮G的物理常数和波谱数据：黄色方晶体(methanol-acetone,1:1v/v)；UV(MeOH)λ_max(logε)208(4.50),301(4.46)nm；¹H NMR(pyridine-d₅,500MHz)δ1.08×2(6H,d,J＝6.6Hz,H₃-4”/H₃-5”),1.10×2(6H,d,J＝6.7Hz,H₃-10/H₃-10'),1.13×2(6H,d,J＝6.7Hz,H₃-9/H₃-9'),1.93(1H,br sept.,J＝6.6Hz,H-3”),2.49(2H,dd,J＝8.2,6.6Hz,H₂-2”),3.64×2(6H,s,OCH₃-3/OCH₃-3'),3.76×2(6H,sept.,J＝6.7Hz,H₃-8/H₃-8'),6.06(1H,t,J＝8.2Hz,H-1”),6.26×2(2H,s,H-4/H-4')；¹³C NMR(pyridine-d₅,125MHz)δ19.6×2(C-9/C-9'),19.7×2(C-10/C-10'),23.2×2(C-4”/C-5”),27.0(C-3”),28.0(C-1”),39.6×2(C-8/C-8'),41.9(C-2”),55.4×2(OCH₃-3/OCH₃-3'),92.9×2(C-4/C-4'),104.6×2(C-2/C-2'),111.4×2(C-6/C-6'),161.5×2(C-3/C-3'),165.2×2(C-5/C-5'),166.8×2(C-1/C-1'),210.2×2(C-7/C-7')。(+)-HRESIMS m/z 511.2302[M+Na]⁺(calcd.forC₂₇H₃₆O₈Na,511.2302)。

根据本发明的第二方面，本发明提供了包含作为活性药物成分的大叶桉酮G或其衍生物以及药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂的药物组合物。

在本发明的实施方案中，本发明的化合物大叶桉酮G可以以一种或多种互变异构形式存在，因此，该化合物可以以互变异构体的混合物形式或单独的互变异构体形式存在。

本领域技术人员应当理解，本发明的化合物大叶桉酮G的药学上可接受的衍生物，例如大叶桉酮G的盐、溶剂合物或水合物也可以用于本发明的药物组合物中。

药学上可接受的盐可以是例如药学上可接受的碱加成盐。

药学上可接受的碱加成盐包括衍生自诸如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝等无机碱的盐。衍生自药学上可接受的无毒有机碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，包括天然存在的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺以及乙醇胺和三乙醇胺。

因此，在本发明药物组合物的实施方案中，活性药物成分可以是大叶桉酮化合物G、其互变异构体和碱加成盐。

合适的药物赋形剂是本领域技术人员众所周知的。药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂，包括但不仅限于填充剂(稀释剂)、润滑剂(助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂包括糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物(如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等)、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂包括乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等)、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂包括微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂包含淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素等；湿润剂包括十二烷基硫酸钠、水或醇等；抗氧剂包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂包括0.5％苯酚、0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇等；乳化剂包括聚山梨酯-80、没酸山梨坦、卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂包括吐温-80、胆汁、甘油等。

本发明的化合物用作药物时，可以直接施用，或者以药物组合物的形式施用。在本发明的药物组合物中，按药物组合物总重量计，药物组合物可以含有0.1–99％，优选为0.5–90％的大叶桉酮G。

大叶桉酮G或其衍生物的“有效量”是指，足以实现所需生物学效果例如抑制黄病毒属病毒，优选抑制寨卡病毒RNA复制的大叶桉酮G的量。应当理解，有效剂量会取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重。通常，有效量由施用治疗的人例如治疗医师来决定。

在本发明的实施方案中，大叶桉酮G在体外对亚洲株寨卡病毒ZIKV SZ-WIV01G和非洲株寨卡病毒ZIKV MR766的半数最大效应浓度(EC₅₀)分别为10.10±3.84μM和0.43±0.08μM。大叶桉酮在体外对非洲绿猴肾细胞(Vero)的半数细胞毒性浓度(CC₅₀)大于500μM。相应地，大叶桉酮G的治疗指数大于49.50。

本发明的药物组合物可以以单位体重服用量的形式施用。所有以大叶桉酮G或其衍生物为有效成分的药物组合物采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型，例如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物组合物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行黄病毒属病毒，尤其是寨卡病毒感染及由此引起的并发症的治疗。

根据第三方面，本发明提供了本发明的大叶桉酮G或其衍生物在制备用于治疗病毒感染的药物中的用途。

在本发明的实施方案中，该病毒为黄病毒属(Flavivirus)病毒，例如日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus))、登革热病毒(Dengue virus)、西尼罗病毒(WNV)、黄热病毒(YTV)、西尼罗病毒(WNV)和寨卡病毒等。在优选实施方案中，该病毒为寨卡病毒。

根据第四方面，本发明提供了制备上文式I所示大叶桉酮G的方法，包括以下步骤：

1)将桉属植物材料干燥、粉碎，采用有机溶剂浸提后脱溶，得到桉属植物提取物；

2)对所述桉属植物提取物依次采用柱层析、结晶、重结晶，得到大叶桉酮G。

在本发明中，桉属植物是指桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus L.Herit)中的种类。在具体实施方案中，桉属植物可以选自例如白桉(E.alba)、广叶桉(E.amplifolia)、二色桉(E.bicolor)、布氏桉(E.blakelyi)、葡萄桉(E.botryoides)、E.camaldulenais、赤桉(E.camaldulensis)、柠檬桉(E.citriodora)、常桉(E.crebra)、窿缘桉(E.exserta)、蓝桉(E.globulus)、大桉(E.grandis)、斜脉胶桉(E.kirtoniana)、纤脉桉(E.leptophleba)、斑皮桉(E.maculata)、直杆蓝桉(E.maideni)、蜜味桉(E.melliodora)、小帽桉(E.microcorys)、圆锥花桉(E.paniculata)、粗皮桉(E.pellita)、阔叶桉(E.platyphylla)、多花桉(E.polyanthemos)、斑叶桉(E.punctata)、大叶桉(E.robusta)、野桉(E.rudis)、柳叶桉(E.saligna)、细叶桉(E.tereticornis)、毛叶桉(E.torelliana)中的一种或多种。

在本发明优选的实施方案中，桉属植物为大叶桉、赤桉、蓝桉中的一种或多种。

在具体实施方案中，桉属植物材料可以是桉属植物的枝叶、果实或其混合物。在优选的实施方案中，桉属植物的枝叶、果实是干燥的。在进一步优选的实施方案中，桉属植物材料是大叶桉、赤桉或蓝桉的枝叶或果实，或其混合物。

在本发明的实施方案中，步骤1)提取所用有机溶剂包括石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈、和甲酸中的至少一种，优选，有机溶剂包括石油醚和乙酸乙酯，进一步优选，有机溶剂为石油醚和乙酸乙酯的等体积混合物。

在本发明的实施方案中，浸提可以用有机溶剂进行至少1次，例如2、3、4、5次，优选3次，并将浸提液合并，每次浸提可以进行约60-84小时，例如60、61、62、63、64、65、66、67、68、39、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84小时，优选70-74小时，进一步优选72小时。

在本发明的实施方案中，有机溶剂与干燥的桉属植物材料的体积比为1:1到10:1，例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，以及上述任意两个比例之间的比例，例如1.5:1、2.5:1、3.5:1、4.5:1、5.5:1等，优选为3:1。

在本发明的具体实施方案中，步骤2)具体包括：

在本发明的具体实施方案中，在步骤2)中，所述柱层析包括正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析(例如RP-8或RP-18)、凝胶柱层析(例如Sephadex LH-20)、中压色谱分离凝胶(例如，MCI Gel CHP20P)和制备或半制备高效液相色谱(HPLC)；优选地，所述柱层析包括正相硅胶柱层析、反相RP-18柱层析和凝胶柱层析。

在本发明的具体实施方案中，在步骤2)中，柱层析所用洗脱剂包括石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈、水和甲酸中的一种或两种以上的组合，例如上述有机溶剂中任意两种的组合，任意三种的组合、任意四种的组合等；优选地，正相硅胶柱层析采用石油醚和乙酸乙酯按体积比从1:0到0:1梯度洗脱，例如1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1；反相RP-18柱层析采用乙腈和水按体积比从6:4到1:0梯度洗脱，例如6:4、7:3、8:2、9:1、1:0；凝胶柱层析，例如Sephadex LH-20凝胶柱层析，采用氯仿和甲醇按体积比1:1洗脱；中压色谱分离凝胶，例如MCI Gel CHP20P，采用甲醇和水按体积比从5:5到1:0梯度洗脱；制备或半制备HPLC采用乙腈和水按体积比从7:3到1:0梯度洗脱。

在本发明的具体实施方案中，在步骤2)中，结晶以及重结晶采用的溶剂系统为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中的一种或两种以上的组合，例如上述有机溶剂中的任意一种，或者任意两种的组合、任意三种的组合、任意四种的组合等；优选地，采用甲醇/丙酮(1:1，v/v)。结晶是本领域的常规技术手段，例如溶剂缓慢挥发法，将样品加热溶解后放置于4℃冰箱内缓慢挥发溶剂形成晶体。在具体实施方案中，加热的具体温度没有特别限制，只要样品能够溶解即可。

下面结合附图和实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来限制本发明的保护范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，所有这些修改和替换都落入了本发明权利要求书请求保护的范围内。

下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

在下述实施例中，¹H,¹³C NMR和2D NMR谱在Bruker DRX-500核磁共振仪上测定；电喷雾电离质谱(ESI-MS)由Waters XevoTQ-S三重四极杆串联质谱联用仪或Bruker HTC/Esquire液相-离子阱色谱质谱联用仪测定；高分辨质谱(HR-ESI-MS)由Agilent UPLC/Q-Tof液质联用仪测定；紫外光谱(UV)在甲醇中用ShimazuUV-2401PC紫外光谱仪测定；HPLC分析和制备用Agilent 1260型或1100型高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent ZORBAX-SB-C18层析柱(5μm；4.6×150mm)或Agilent ZORBAX-SB-C18层析柱(5μm；9.4×250mm)；柱层析用正相硅胶(200–300目)及薄层层析板均为青岛海洋化工厂产品；薄层层析通过10％FeCl₃-乙醇溶液观察其斑点；Sephadex LH-20为GE Healthcare公司产品；反相材料Rp-8及Rp-18为Merck公司产品。MCI Gel CHP20P为日本三菱化学产品。

实施例1：化合物大叶桉酮G的制备方法一

在本实施例中，采用以下步骤制备大叶桉酮G：

(1)将大叶桉的枝叶和果实样品的混合物进行干燥、粉碎，得到大叶桉植物材料；

(2)在室温下，采用石油醚/乙酸乙酯(1:1，v/v)对上述植物材料进行提取，有机溶剂和植物材料的体积比为3:1，总共提取3次，每次72h，合并提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状大叶桉植物提取物；

(3)将所述植物提取物采用正相硅胶柱层析(硅胶用量与提取物的质量比为4:1)，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，得到五个部分即：Fr.1(石油醚：乙酸乙酯＝1:0，v/v)、Fr.2(石油醚：乙酸乙酯＝50:1，v/v)、Fr.3(石油醚：乙酸乙酯＝25:1，v/v)、Fr.4(石油醚：乙酸乙酯＝10:1，v/v)、Fr.5(石油醚：乙酸乙酯＝5:1，v/v)；

(4)将收集得到的Fr.4部分采用反相硅胶柱层析(Rp-18)，以乙腈/水(以乙腈和水的总体积计，含千分之一甲酸)为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，分段收集得到五个部分：Fr.4-1(乙腈：水＝6:4，v/v)、Fr.4-2(乙腈：水＝7:3，v/v)、Fr.4-3(乙腈：水＝8:2，v/v)、Fr.4-4(乙腈：水＝9:1，v/v)和Fr.4-5(乙腈：水＝1:0，v/v)；

(5)将上述步骤中收集到的Fr.4-3部分采用凝胶柱层析(例如Sephadex LH-20)，以氯仿：甲醇(1:1，v/v)为洗脱剂，分段收集得到四个部分：Fr.4-3-1、Fr.4-3-2、Fr.4-3-3和Fr.4-3-4；

(6)将上述步骤中收集到的Fr.4-3-3部分用甲醇-丙酮(1:1，v/v)加热充分溶解，冷却后放置在4℃冰箱进行结晶，待晶体(黄色方晶体)形成后过滤洗涤并重复上述步骤进行重结晶，即可得到大叶桉酮G(Eucalyprobusone G)，经HPLC检测其纯度为98％。

大叶桉酮G的物理常数和波谱数据：黄色方晶体(methanol-acetone,1:1v/v)；UV(MeOH)λ_max(logε)208(4.50),301(4.46)nm；¹H NMR(pyridine-d₅,500MHz)δ1.08×2(6H,d,J＝6.6Hz,H₃-4”/H₃-5”),1.10×2(6H,d,J＝6.7Hz,H₃-10/H₃-10'),1.13×2(6H,d,J＝6.7Hz,H₃-9/H₃-9'),1.93(1H,br sept.,J＝6.6Hz,H-3”),2.49(2H,dd,J＝8.2,6.6Hz,H₂-2”),3.64×2(6H,s,OCH₃-3/OCH₃-3'),3.76×2(6H,sept.,J＝6.7Hz,H₃-8/H₃-8'),6.06(1H,t,J＝8.2Hz,H-1”),6.26×2(2H,s,H-4/H-4')；¹³C NMR(pyridine-d₅,125MHz)δ19.6×2(C-9/C-9'),19.7×2(C-10/C-10'),23.2×2(C-4”/C-5”),27.0(C-3”),28.0(C-1”),39.6×2(C-8/C-8'),41.9(C-2”),55.4×2(OCH₃-3/OCH₃-3'),92.9×2(C-4/C-4'),104.6×2(C-2/C-2'),111.4×2(C-6/C-6'),161.5×2(C-3/C-3'),165.2×2(C-5/C-5'),166.8×2(C-1/C-1'),210.2×2(C-7/C-7')。(+)-HRESIMS m/z 511.2302[M+Na]⁺(calcd.forC₂₇H₃₆O₈Na,511.2302)。

实施例2：化合物大叶桉酮G的制备方法二

在本实施例中，采用以下步骤制备大叶桉酮G：

(1)将赤桉的枝叶和果实样品的混合物进行干燥、粉碎，得到赤桉植物材料；

(2)在室温下，采用乙酸乙酯对上述植物材料进行提取，有机溶剂和植物材料的体积比为10:1，总共提取4次，每次80h，合并提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状提取物；

(3)将所述植物提取物采用正相硅胶柱层析(硅胶用量与提取物的质量比为5:1)，以石油醚/丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，得到六个部分即：Fr.1(石油醚：丙酮＝0:1，v/v)、Fr.2(石油醚：丙酮＝100:1，v/v)、Fr.3(石油醚：丙酮＝50:1，v/v)、Fr.4(石油醚：丙酮＝25:1，v/v)；Fr.5(石油醚：丙酮＝10:1，v/v)、Fr.6(石油醚：丙酮＝5:1，v/v)；

(4)将收集得到的Fr.5部分采用中压色谱分离凝胶MCI，以甲醇/水(以甲醇和水的总体积计，含千分之一甲酸)为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，分段收集得到三个部分：Fr.5-1(甲醇：水＝5:5，v/v)、Fr.5-2(甲醇：水＝7:3，v/v)、Fr.5-3(甲醇：水＝9:1，v/v)；

(5)将上述步骤中收集到的Fr.5-2采用反相硅胶柱层析(Rp-18)，以乙腈/水(以乙腈和水的总体积计，含千分之一甲酸)为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，分段收集得到五个部分：Fr.5-2-1(乙腈：水＝6:4，v/v)、Fr.5-2-2(乙腈：水＝7:3，v/v)、Fr.5-2-3(乙腈：水＝8:2，v/v)、Fr.5-2-4(乙腈：水＝9:1，v/v)和Fr.5-2-5(乙腈：水＝1:0，v/v)；

(6)将上述步骤中收集到的Fr.5-2-3通过半制备高效液相色谱(HPLC)，以乙腈/水(以乙腈和水的总体积计，含千分之一甲酸)为流动相，采用梯度洗脱的方法(0～30分钟，乙腈浓度从70％～100％，v/v)进行制备可得到大叶桉酮G。经过HPLC分析大叶桉酮G纯度为97％。

实施例3：化合物大叶桉酮G的制备方法三

在本实施例中，采用以下步骤制备大叶桉酮G：

(1)将蓝桉的枝叶和果实样品的混合物进行干燥、粉碎，得到蓝桉植物材料；

(2)在室温下，采用甲醇对上述植物材料进行提取，有机溶剂和植物材料的体积比为5:1，总共提取4次，每次60h，合并提取液，过滤，滤液进行减压浓缩得到膏状提取物；

(3)将所述植物提取物采用正相硅胶柱层析(硅胶用量与提取物的质量比为5:1)，以氯仿/甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，得到六个部分即：Fr.1(氯仿：甲醇＝0:1，v/v)、Fr.2(氯仿：甲醇＝200:1，v/v)、Fr.3(氯仿：甲醇＝100:1，v/v)、Fr.4(氯仿：甲醇＝50:1，v/v)；Fr.5(氯仿：甲醇＝25:1，v/v)、Fr.6(氯仿：甲醇＝10:1，v/v)；

(4)将收集得到的Fr.4部分采用反相硅胶柱层析(Rp-18)，以乙腈/水(以乙腈和水的总体积计，含千分之一甲酸)为洗脱剂进行梯度洗脱(每个梯度3～5个柱体积)，分段收集得到五个部分：Fr.4-1(乙腈：水＝6:4，v/v)、Fr.4-2(乙腈：水＝7:3，v/v)、Fr.4-3(乙腈：水＝8:2，v/v)、Fr.4-4(乙腈：水＝9:1，v/v)和Fr.4-5(乙腈：水＝1:0，v/v)；

(5)将上述步骤中收集到的Fr.4-3部分采用凝胶柱层析(Sephadex LH-20)，以氯仿：甲醇(1:1，v/v)为洗脱剂，分段收集得到四个部分：Fr.4-3-1、Fr.4-3-2、Fr.4-3-3和Fr.4-3-4；

(6)将上述步骤中收集到的Fr.4-3-3部分用甲醇-丙酮(1:1，v/v)加热充分溶解，冷却后放置在4℃冰箱进行结晶，待晶体(黄色方晶体)形成后过滤洗涤并重复上述步骤进行重结晶，即可得到大叶桉酮G(Eucalyprobusone G)，经HPLC检测其纯度为98％。

实施例4：大叶桉酮G的抗寨卡病毒活性

利用噬斑法对大叶桉酮G抗寨卡病毒ZIKV作用进行了评估。Vero细胞以每孔3×10⁵个细胞/mL的密度铺于12孔板，在37℃和含有5％CO₂的培养箱中培养过夜，待细胞密度适宜时，加入ZIKV SZ-WIV01(50PFU，Plaque Forming Unit)或ZIKV MR766(50PFU)，使其吸附2小时。2小时后用PBS(0.01M，pH 7.4，10×贮存液，Thermo Fisher公司)洗涤3次，以除去未结合的病毒，此时将大叶桉酮G用4％FBS(Fetal Bovine Serum，Thermo Fisher公司)稀释成25μM、12.5μM、6.25μM和3.125μM四个梯度浓度并分别和2％低熔点琼脂糖(Agarose 4g，1×PBS 200ml)等体积混合后加入Vero细胞中，同时设置不含大叶桉酮G的DMSO组和未感染病毒的Mock组作为对照。待混合液完全凝固后，将12孔板倒置与37℃、5％CO₂培养箱中培养4天。感染后(Post infection hours,hpi)4天，在细胞中加入4％PFA(Paraformaldehyde)固定20分钟，缓慢吹起半固体培养基并弃去，随即加入0.8％结晶紫对细胞进行染色15分钟，然后用水洗掉多余的染料并烘干。随后，利用酶联荧光斑点分析仪(CTL，ImmunospotS6Universal)采集图像并对ZIKV感染所产生的空斑个数进行统计，并计算出大叶桉酮G的半数有效浓度EC₅₀。结果显示，大叶桉酮G以剂量依赖方式抑制ZIKV感染诱导的噬斑形成。通过不同药物浓度下的噬斑个数进行统计并与DMSO组进行比较，得出大叶桉酮G对亚洲株ZIKV SZ-WIV01的EC₅₀为10.10±3.84μM(图3A)，对非洲株ZIKV MR766的EC₅₀为0.43±0.08μM(图3B)。同样的方法测得阳性对照药利巴韦林(ribavirin)对ZIKV SZ-WIV01和ZIKVMR766的EC50分别为47.46±4.73和58.78±1.86μM。大叶桉酮G的抗寨卡病毒活性显著高于阳性对照药利巴韦林。

为了阐明大叶桉酮G的抗病毒作用是否为其细胞毒活性造成，利用MTT法测定了大叶桉酮G对Vero的细胞毒性。Vero细胞铺于96孔板,密度为3×10⁵个细胞/mL。37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜，待细胞长成紧密的单层后，在实验组内依次加入梯度稀释的大叶桉酮G(浓度梯度为250μM、125μM、62.5μM和31.25μM)，每个浓度均设置3个复孔。与此同时，设置不含大叶桉酮G的阴性对照组(DMSO)和不含细胞的空白对照组(Mock)，同样设置三个复孔。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱培养4天。4天后取出培养板，按照从低浓度到高浓度的顺序依次加入20μL浓度为5mg/mL的MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)，随后置于37℃孵育继续培养4小时以使活细胞与甲臜充分结合。4h后，每孔均吸走100μL上清，然后依次加入100μL 12％SDS-50％DMF溶液并置于37℃孵育12～24h以使甲臜充分溶解。次日，使用ELx800酶标仪检测OD值(检测波长570nm，参考波长630nm)。根据所测得的OD值和化合物浓度在Excel上绘制剂量反应曲线。最后，计算出化合物半数细胞毒性浓度CC₅₀(50％Cytotoxity Concentration)。结果显示其CC₅₀大于500μM(图3C)，治疗指数大于49.5，说明抗病毒作用并非由于大叶桉酮G的细胞毒活性造成。

实施例5：大叶桉酮G对寨卡病毒复制的抑制作用

为了进一步确定大叶桉酮G的抗ZIKV活性，我们首先使用qRT-PCR检测了大叶桉酮G处理后对ZIKV复制的影响。将Vero细胞以每孔3×10⁵个细胞/mL的密度铺于12孔板，在37℃和含有5％CO₂的培养箱中培养过夜，待细胞达到95％融合后，加入ZIKV SZ-WIV01(500PFU)在37℃孵育2h后用PBS洗涤3次去除未结合的病毒。然后加入不同浓度的大叶桉酮G(25μM、12.5μM、6.25μM和3.125μM)，继续培养至48h后收集细胞上清液，按照

Viral RNA Kit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)说明书操作提取细胞上清液中RNA，随后使用One Step q-PCR Kit定量试剂盒RNA-direct^TMRealtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)和引物(Takara公司)，TaqMan探针(Takara公司)在ABI ViiA^TM 7Real-Time PCRSystem下来检测ZIKV病毒载量。结果显示，大叶桉酮G以剂量依赖性的方式抑制ZIKV RNA的产生(图4A)。

为了在蛋白水平进一步证实这一发现，将ZIKV MR766在37℃孵育2h，然后加入不同浓度的大叶桉酮G(50μM、10μM、2μM、0.4μM和0.08μM)继续培养至48h，移走细胞上清，然后加入4℃预冷的PBS洗涤2-3次。配制细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂PMSF)，200μL/孔(12孔板)加入细胞内，置于冰上裂解30min(每10min摇动一次，使其充分裂解)。将细胞轻轻吹打混匀，转移到提前预冷的离心管内，4℃、12000rpm离心10min。吸取160μL蛋白上清液，然后使用蛋白浓度试剂盒(碧云天生物技术公司)检测蛋白浓度。随后通过蛋白质印迹法(WesternBlot)评估大叶桉酮G对ZIKV E蛋白的影响。结果显示，随着大叶桉酮G浓度的增加，ZIKV E蛋白的表达逐渐被抑制。用2μM或更高浓度的大叶桉酮G处理几乎完全抑制了E蛋白的表达(图4B)。随后，通过免疫荧光检测了大叶桉酮G对ZIKV复制的影响。将ZIKV SZ-WIV01(MOI＝1)与大叶桉酮G一起加入Vero细胞并于37℃孵育1h。在感染48h，与仅用DMSO处理相比，50μM处理的细胞中观察到ZIKV E蛋白阳性细胞显著减少(图4C)。这些结果表明大叶桉酮G具有显著的抗ZIKV活性。

实施例6：大叶桉酮G能抑制不同细胞中寨卡病毒的复制

如实施例3所示，大叶桉酮G在非洲绿猴肾细胞(Vero)具有良好的抗ZIKV活性。为了测试其在人源细胞中的抗ZIKV活性，类似地，通过qRT-PCR实验检测了其在腺癌人类肺泡基底上皮细胞A549(图5A)和人肝癌细胞Huh-7(图5B)中的抗ZIKV活性及在不同化合物浓度中的细胞存活率(化合物浓度设置为50μM、10μM、2μM和0.4μM)。结果显示，大叶桉酮G均以剂量依赖型方式抑制两种人源细胞中ZIKV的复制。

实施例7：大叶桉酮G抑制寨卡病毒与宿主细胞的结合

黄病毒进入宿主细胞需要经过吸附和内化等过程。因此通过吸附实验和内化实检测大叶桉酮G是否影响ZIKV的吸附和内化。对于吸附实验，将Vero细胞铺于12孔板中(3×10⁵个细胞/mL)。培养箱中培养过夜。将预冷的细胞与ZIKV SZ-WIV01(MOI＝1)和50μM大叶桉酮G一起在4℃下孵育1小时，并以表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)为阳性对照。然后，用PBS洗涤以除去未结合的病毒。收集细胞利用qRT-PCR检测吸附在细胞表面的ZIKV水平。结果显示(图6A)，大叶桉酮G处理的样品与媒介物(DMSO)处理的样品之间观察到ZIKVRNA存在显著差异，表明大叶桉酮G抑制了ZIKV的吸附。

此外，有研究表明黄病毒通过病毒颗粒与细胞表面受体相互作用从而进入宿主细胞，黄病毒的进入因子包括DC-SIGN、AXL、Tyro3和MER(TAM)。为了确定大叶桉酮G是否通过影响AXL受体的表达来抑制ZIKV的吸附，采用流式细胞术检测了ZIKV感染后用大叶桉酮G处理的Vero细胞表面AXL的表达水平。即将50μM大叶桉酮G和Vero细胞在37℃共孵育1h，然后将ZIKV SZ-WIV01(MOI＝1)在37℃下感染Vero细胞，感染后1h收集细胞，并通过流式细胞术(BD FACSVerseTM flow cytometer)检测。结果显示(图6B)，大叶桉酮G不影响AXL的表达，即大叶桉酮G不是通过影响AXL的表达水平来抑制病毒的吸附。

实施例8：分时给药实验检测大叶桉酮G作用于寨卡病毒的RNA合成阶段

为了确定大叶桉酮G所作用的病毒生命周期阶段，采用了分时给药实验(图7A)，即：将Vero细胞在4℃下加入ZIKV SZ-WIV01(MOI＝1)，感染1h，然后用预冷的PBS洗涤2次。分别在感染后0、1、2、4、6、12小时加入50μM大叶桉酮G，对照孔加入媒介物(DMSO)。其余孔用新鲜维持培养基(2％FBS DMEM)替代并维持到实验结束。感染后24h，收集细胞上清并提取RNA，通过qRT-PCR进行检测。结果显示(图7B)，在感染后6h加入大叶桉酮G显著抑制了ZIKV的复制，表明大叶桉酮G主要抑制ZIKV RNA的合成。

实施例9：大叶桉酮G抑制ZIKV的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性

在6孔板内培养HEK-293T细胞(2×10⁵个细胞/mL)，将10ng ZIKV Gluc荧光素酶质粒和1μg ZIKV NS5载体共转染到HEK-293T细胞中，用不同浓度的大叶桉酮G(10μM、5μM、2.5μM和1.25μM)处理细胞24小时，然后收集上清液检测Gluc的含量，另外收集细胞进行提取蛋白进行NS5表达量的检测。Gluc的mRNA被细胞中的RNA聚合酶II所合成，从而维持Gluc的基础表达量。当细胞内的ZIKV NS5的表达量升高，NS5中的RNA依赖性RNA聚合酶结构域(RdRp)可以扩增出更多的Gluc mRNA从而显著提高Gluc荧光素酶的水平。因此，分泌到培养基中的荧光素酶Gluc的含量可以反应RdRp的活性。结果显示，大叶桉酮G以剂量依赖性的方式抑制了表达NS5的细胞中的荧光素酶Gluc的活性，并且在10μmol/L的浓度下几乎完全抑制了由于NS5的表达而导致的Gluc活性增加(图8A)。然而，在只表达荧光素酶Gluc的细胞中大叶桉酮G对荧光素酶的活性没有影响(图8B)，说明大叶桉酮G依赖于RdRp起作用。蛋白印记(Western Blot)实验表明大叶桉酮G不影响NS5的表达。

综上所述，大叶桉酮G可以抑制NS5中RdRp结构域的活性，但却不影响NS5的表达。

Claims (15)

1.大叶桉酮G在制备抗寨卡病毒的药物中的用途，所述大叶桉酮G具有以下结构式I：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述大叶桉酮G的制备方法包括以下步骤：

1)将桉属(Eucalyptus L.Herit)植物材料干燥粉碎，采用有机溶剂浸提后脱溶，得到桉属植物提取物；

2)对所述桉属植物提取物依次采用柱层析、结晶、重结晶，得到大叶桉酮G。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述桉属植物材料是桉属植物的枝叶、果实或其混合物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述桉属植物材料是大叶桉(E.robusta)、赤桉(E.camaldulensis)或蓝桉(E.globulus)的枝叶或果实，或其混合物。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，在步骤1)中，所述有机溶和桉属植物材料的体积比为1:1到10:1。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述有机溶和桉属植物材料的体积比为3:1。

7.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，在步骤1)，中所述有机溶剂包括石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈和甲酸中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述有机溶剂包括石油醚和乙酸乙酯。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述有机溶剂为石油醚和乙酸乙酯等体积混合而成。

10.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，在步骤2)中，所述柱层析包括正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、中压色谱分离凝胶和制备或半制备高效液相色谱(HPLC)。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述柱层析包括正相硅胶柱层析、反相RP-18柱层析和凝胶柱层析。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，在步骤2)中，柱层析所用洗脱剂包括石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈、水和甲酸中的一种或两种以上的组合。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，正相硅胶柱层析采用石油醚和乙酸乙酯按体积比从1:0到0:1梯度洗脱；反相RP-18柱层析采用乙腈和水按体积比从6:4到1:0梯度洗脱；凝胶柱层析采用氯仿和甲醇按体积比1:1洗脱；中压色谱分离凝胶(MCI)采用甲醇和水按体积比从5:5到1:0梯度洗脱；制备或半制备HPLC采用乙腈和水按体积比从7:3到1:0梯度洗脱。

14.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，在步骤2)中结晶以及重结晶采用的溶剂系统为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中的一种或两种以上的组合。

15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，在步骤2)中结晶以及重结晶采用的溶剂系统为甲醇/丙酮，其体积比为1:1。

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