CN103908447B - 苦参提取物和降苦参酮在抗ev71病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了苦参提取物及其成分降苦参酮在制备预防或者治疗EV71病毒介导的疾病中的应用，尤其是在制备抑制EV71‑3C蛋白酶活性的药物中的应用，其中所述降苦参酮具有下列结构式：降苦参酮具有抑制EV71‑3C蛋白酶活性的作用，其IC₅₀值为135.8μM。

Description

苦参提取物和降苦参酮在抗EV71病毒感染中的应用

技术领域

本发明涉及药学领域，具体而言，涉及中药材苦参提取物及黄酮类化合物降苦参酮的应用。

背景技术

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。人类肠道病毒71型(Humanenterovirus 71，简写EV 71)是导致手足口病的一类主要病毒，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种神经系统疾病(刘丽艳，朱启镕.肠道病毒71型分子生物学研究进展[J].微生物与感染，2010，5(1)：57-60)。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征，少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。少年儿童和成人感染后多不发病，但能够传播病毒。

自1969年最早在美国分离出EV71以来，相继在澳大利亚、日本、巴西、荷兰、马来西亚、中国台湾等国家或地区报道了EV71感染引起的HFMD流行。大量研究均表明，EV71感染为导致严重及死亡HFMD病例的主要病原体，而其他常见的肠病毒血清型如CA16、CA4、CA10、CB3和CA6等引起的HFMD临床症状较轻。自1998年来，中国就不断遭受这种疾病的侵袭，2010年1～4月间，已报告HFMD发病数427 278例，其中死亡260例，均呈明显升高趋势。根据中国疾病预防控制中心的研究，HFMD重症病例中81.59％、死亡病例中96.43％是由EV71引起的(姚昕，毛群颖，梁争论.肠道病毒71型疫苗的研发现状及进展[J].中国生物制品学杂志，2011，24(2)：233.)。目前，HFMD的流行已成为我国大陆、台湾地区以及东南亚国家的重大公共卫生问题之一，造成了巨大的社会负担。因此开发有效的药物来控制EV71的感染是非常必要的因此，EV71感染及流行是值得我们密切关注的问题.由于手足口病多发于亚洲东部等几个地区且属于新兴传染病，其相关的治疗方法与药物研究尚不充分。迄今为止，还没有针对EV71感染和治疗的特效药上市。

EV71是小RNA病毒科(picornavirus)，肠道病毒属成员。病毒基因组为7408个核苷酸的单股正链RNA，基因组中仅有一个开放阅读框，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P33个前体蛋白，P1前体蛋白编码VP1、VP2、VP3、VP44个病毒外壳蛋白；P2和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白(2A～2C和3A～3D)。病毒粒子的衣壳由60个亚单位构成，后者由4种衣壳蛋白(VP1～VP4)拼装成五聚体样结构。根据病毒衣壳蛋白VP1核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C3个基因型，其中B型和C型又进一步分为B1、B2、B3、B4以及C1和C2亚型。EV71感染可在同一家庭多成员中传播，成人症状一般较轻，而患儿发病中，并发症和死亡率较高。关于病毒毒力的机制未明，有研究结果显示，EV71毒力决定簇在基因组中并非单一位点，病毒的毒力是多个位点共同作用决定的；另一方面，复杂的宿主因素，如宿主抵抗力水平的差异以及宿主对肠道病毒属内的不同病毒存在免疫交联保护反应等对病毒的毒力也有影响。3C蛋白酶接近于EV 71基因组表达的多聚蛋白的C端，执行了几乎所有的多聚蛋白的加工和切割工作(除了VP1和2A被2A蛋白酶切；和VP2 and VP4有RNA依赖性的切割外)。同时，3C蛋白酶通过作用于宿主的蛋白CstF-64从而达到降解宿主RNA，以保护自身复制的作用。

对于由微生物引起的疾病治疗中，疫苗无疑是最好的方法。然而，由于手足口病一般由多种病毒引起，而单一疫苗只能对单一相应病毒起作用，所以其相关研究至今处于初级阶段。当今，针对EV71病毒以及手足口病的复制、发病特点，当今对其研究、治疗的手段主要集中在以下几个方面：针对病毒与宿主细胞吸附，进入以及脱壳过程的抑制；在不影响宿主细胞的情况下针对对病毒翻译病毒蛋白过程的抑制；针对EV71主蛋白酶3C活性的抑制；针对EV71主要复制酶RdRp(3D)蛋白活性的抑制；针对调节宿主细胞膜运输以及病毒病毒复制过程的蛋白3A活性的抑制以及针对病毒核酸类似物的研究(比如一种广谱抗病毒药物，利巴韦林)。但由于相关研究均开始较晚，至今未能找到一种针对EV71感染的特效药。可治疗严重的病例只有维持疗法和静脉注射免疫球蛋白，但是静脉注射免疫球蛋白的治疗效果还是很限的。在抗病毒的化合物中，pleconaril已被证明可以抑制小RNA病毒，如柯萨奇病毒，鼻病毒，但是对于EV71感染的病人却没有疗效。pyridyl imidazolidinone(吡啶咪唑啉酮，针对VP1蛋白)的衍生物在体外试验中是一个比较有前景的抗EV71的药物(Zhao-HongLi，Chien-Ming Li，PinLing et al.Ribavirin Reduces Mortality in Enterovirus 71-Infected Mice byDecreasing Viral Replication[J].The Journal of InfectiousDiseases 2008，197：854-721.)，然而仍然需要进一步研究才能将这些新药开发上市。因此寻求新的治疗药物还是一个亟待解决的问题。

天然产物又称次级代谢产物，具有结构多样性和生物活性多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(Newman DJ，Gragg GM，Snader KM.Nat ProdRep，2000，17(3)：215-234；Lee K-H.J Nat Prod.2004，67(2)：273-283)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。对于天然产物尤其是来源于中药等的天然产物的研究是很有必要的，因为中药在我国已有数千年应用的历史，是药物小分子化合物的一个巨大的宝库，因此从中药等天然产物中进行重要病毒或重要疾病相关靶蛋白抑制剂的筛选是很有必要的。

苦参(Sophora flavescens)为豆科苦参属的植物。苦参也叫苦骨、川参、牛参、地参、牛人参、野槐根、凤凰爪。其性温，味甘、微苦，归肝、肾经。功能主治：清热燥湿，杀虫，利尿。用于热痢，便血，黄疸尿闭，赤白带下，阴肿阴痒，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，疥癣麻风；外治滴虫性阴道炎。主要化学成分为生物碱、黄酮、皂苷及醌类化合物。药理实验表明苦参有抗菌、抗癌、治疗心律不齐和美容等作用。

李梢在CN102018697A中公开苦参酮具有抑制血管内皮细胞增殖的效果对类风湿性关节炎等血管新生相关疾病有潜在作用。严孝强等在CN1676521A中公开苦参酮及其衍生物及类似物在制备抗癌药物中的用途。于喜水等在CN1437941A中公开苦参中苦参总碱在治疗心律失常和急性肠炎上的应用。吴同心等在CN1416813A中公开苦参中氧化苦参碱在治疗肾综合征出血热药物中的应用，对肾综合征出血热病毒有明显的抑制作用。刘金虎等在CN1157717A中公开一种苦参中氧化苦参碱在治疗乙型肝炎的应用，可以有效抑制肝炎病毒的复制。郭勃等在CN1348762A中公开苦参黄酮在制备降糖药中的应用。

虽然苦参中的化学成分在抑制乙型肝炎病毒、抗癌、降血糖、治疗心律失常和急性肠炎等方面有较强作用，但在作为EV71抑制剂方面的研究尚无报道。因此，寻找新型EV71-3C蛋白酶抑制剂和找到能有效抑制病毒、修复人体免疫力、低毒、廉价的抗EV71药物仍然是现阶段急需解决的问题。

发明内容

本发明提供了苦参提取物及降苦参酮在制备用于预防或者治疗EV71病毒感染的药物中的应用，尤其是在制备EV71-3C蛋白酶抑制剂中的应用。

其中，所述降苦参酮具有下列结构式：

在上述应用中，所述降苦参酮的分子式为C₂₅H₂₈O₆，分子量为424。

在上述应用中，所述降苦参酮可以通过本领域已知的各种方法或者变通方法从植物中分离提取、合成或者半合成的方法制备得到，也可以直接商购获得。

本发明还提供了一种用于制备预防或者治疗EV71病毒感染的药物组合物，所述药物组合物中包含作为活性成分的降苦参酮，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

将作为活性成分的降苦参酮与药学上可接受的载体或赋形剂混合后，按相应的常规药物制剂方法，可以制备抑制EV71病毒主蛋白酶活性、预防和/或治疗EV71病毒感染的药物。例如，与在口服制剂中可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用辅助添加成分混合后，按常规的操作方法和过程，可以制成为片剂、丸剂、胶囊剂或多种相应的缓释剂、控释剂等固体口服制剂形式的药物；与常规的增溶剂、乳化剂、润饰剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合后，按相应的常规方法，可以制备成为合剂、糖浆、口服液等液体制剂形式的口服药物；与常规的悬浮剂、稳定剂、分散剂或调节溶液渗透压剂混合，按相应的常规方法，配置成注射液。

经药理活性测试，苦参提取物及其降苦参酮对EV71病毒主蛋白酶具有良好的抑制作用，其中苦参酮对EV71病毒主蛋白酶抑制的IC₅₀值为135.8μM。表明降苦参酮可以用作EV71病毒主蛋白酶抑制剂，预防或者治疗EV71病毒感染。

附图说明

图1示出了降苦参酮在50mg/mL的终浓度下(重复实验三次)对EV71病毒主蛋白酶的抑制活性曲线。

图2示出了降苦参酮对EV71病毒主蛋白酶的抑制活性IC₅₀曲线图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，在下面将详述本发明的具体实施方式。

化学提取分离纯化部分

1)苦参浸膏的制备

取一定量的苦参药材用醇、水或其混合物进行回流提取，料药比例为2∶1～20∶1(L/Kg)，每次提取1～8小时，共计提取3～5次。将提取液经过滤后减压蒸干得浸膏苦参提取物。

2)苦参各萃取物的制备

苦参各萃取物包括苦参乙醇提取物的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。下面简述它们的制备过程。

取苦参乙醇提取物，用1～5倍量双蒸水超声1～3小时使其分散后，将其倒入分液漏斗中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，充分振摇，静置，分离出有机相和水相，每种溶剂萃取3次，将每种溶剂的有机相合并，并用旋转蒸发仪浓缩，分别得到干膏状的苦参石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物。

3)苦参乙酸乙酯萃取物的分离纯化。

在活性指导下确定苦参乙酸乙酯萃取物为小分子抑制剂主要集中的部位，我们对五味子乙酸乙酯萃取层通过反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析法、制备HPLC等各种色谱法进行分离，得到一系列化合物。为了简明起见，这些化合物的具体分离制备方法将在具体实施例中给出。

药理活性测试部分

1)EV71-3C蛋白酶片段的扩增及表达载体的构建

设计引物PCR将EV71-3C蛋白酶编码片段扩增，回收PCR产物及pET-28a载体用BamHI和Xho I酶切，回收目的片段，将酶切后的片段与线性化载体进行连接后转化E.coli.DH5α感受态细胞。挑取转化的克隆进行PCR鉴定，阳性克隆进行DNA测序。

EV71-3C蛋白酶的基因序列：

GGCCCGAGCCTTGACTTTGCTCTCTCCCTACTGAGGAGGAACGTCAG

GCAAGTCCAAACAGACCAGGGGCATTTCACCATGTTGGGTGTTAGGG

ATCGCTTAGCAGTCCTCCCACGCCACTCACAACCCGGCAAAACTATTT

GGATTGAGCACAAACTCGTGAACGTCCTTGATGCAGTTGAATTGGTG

GATGAGCAAGGAGTCAACCTGGAATTAACCCTCATCACTCTTGACAC

CAACGAGAAGTTTAGGGATATCACCAAATTCATCCCAGAAAATATTA

GCACTGCTAGTGATGCCACCCTAGTGATCAACACGGAGCACATGCCC

TCAATGTTTGTCCCGGTGGGTGACGTTGTGCAGTATGGCTTCCTGAAT

CTCAGTGGTAAGCCTACCCATCGCACCATGATGTACAACTTTCCTACT

AAAGCAGGACAGTGTGGAGGAGTGGTGACATCTGTTGGGAAGATTAT

CGGTATTCACATTGGTGGCAATGGCAGACAAGGCTTTTGCGCAGGCC

TCAAAAGGAGTTACTTTGCTAGTGAACAA

2)EV71-3C蛋白酶的表达和纯化

培养经测序正确的克隆菌株，提取质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在37℃培养至OD600nm≈0.8-1.0，加入0.5mmol/L IPTG，16℃诱导17h。离心收集菌体，以溶液A(20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM NaCl)重悬菌体，超声破菌。15000rpm/min离心40min，收集上清。利用affinitychromatography(Ni-NTA)去除没有组氨酸标签的杂蛋白初步纯化蛋白，用溶液B(20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM NaCl，250mM咪唑)将目的蛋白洗下。利用10KD浓缩管浓缩后将蛋白溶液换液至溶液C(20mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，5mM beta-巯基乙醇)中，12000rpm/min离心20min。利用GE公司的AKTA进行阳离子交换层析，进一步纯化蛋白得到95％以上纯度的目的蛋白如下图。

收集上清，测定复性后蛋白的活性，把得到的有活性的蛋白利用10KD浓缩管浓缩至20mg/ml，-80℃冻存。

3)蛋白活性检测

利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技术测定针对EV71-3C蛋白酶的抑制剂的活性，根据EV71-3C蛋白酶识别位点设计底物：MCA-RTATVQG PSLDF-Dnp(上海吉尔生化)，当抑制剂对EV71-3C蛋白酶没有作用时，EV71-3C蛋白酶可以切割底物，淬灭基团(Dnp)远离荧光基团(MCA)，荧光基团吸收320nm波长，激发出405nm的波长，通过检测器检测荧光强度，如果抑制剂对EV71-3C蛋白酶有作用，淬灭基团不会被切去，荧光基团吸收320nm的波后一部分能量会转移给淬灭基团，405nm的激发波强度就会减弱，以此来检测抑制剂对EV71-3C蛋白酶的抑制效果。

将蛋白浓度稀释至15μM，底物40μM，检测荧光强度。每个反应体系100μL，先加入蛋白97μL与1μL备选样品混匀，然后加入底物启动反应，并立即测定，每隔3秒测一次，测4分钟，同时要设计好阴性及阳性对照实验。针对每种备选样品平行测定三次。根据反应过程曲线的初速度来计算备选样品对酶的抑制效果。阴性对照，反应速率定为V0，实验组反应的初速度定为Vi。Vi/V0则反映蛋白的剩余活性，1-Vi/V0则为药物对蛋白的抑制率。

初次筛选出剩余活性低于80％的备选样品为阳性结果，还需要通过荧光淬灭的方法排除假阳性。采用的方法是先将蛋白与底物混匀，反应完全，荧光值达到最大值时，在体系中加入备选化合物，再次测定荧光值。通过备选化合物加入反应体系前后荧光值的变化计算备选化合物对产物荧光的淬灭率。将反应达到最大值的荧光值定为Q，加入备选化合物后，荧光值定为Qi，备选化合物对产物荧光的淬灭率为(Q-Qi)/Q。针对剩余活性低于50％，淬灭率低于30％的备选化合物进行进一步测定。

4)EV71-3C蛋白酶IC₅₀值测定

IC50是指酶催化反应中酶活性被抑制一半时抑制剂的浓度，反应了化合物(抑制剂)对酶活性抑制能力的大小，一定的实验条件下IC₅₀越小表示抑制酶活性所需化合物浓度越小，化合物的抑制效果越好。

为了测定EV71-3C蛋白酶IC₅₀值，我们将备选样品用95％DMSO以2倍浓度梯度进行稀释14-20个浓度梯度之后平行3次测定各个浓度化合物的反应体系的初速度Vi，以Vi作为反应不同浓度样品条件下的酶反应活性(IC₅₀坐标的纵坐标数值)，再以每个样品的浓度log10作为横坐标计算备选样品对蛋白抑制的IC₅₀值。

下列实施例仅用于举例说明本发明，对本发明没有任何限制。

实施例1苦参乙醇提取物的制备

将18Kg的苦参(Sophora flavescens，产地：内蒙古)用8倍的95％乙醇，2小时/次回流提取2次，得95％提取液和残渣；残渣用8倍的50％乙醇，2小时/次回流提取2次，得50％提取液和残渣。合并两次提取液并减压旋蒸回收溶剂，苦参浸膏约2.6Kg。

实施例2苦参乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的制备

将上述所得浸膏用1.2倍双蒸水超声分散，依次用1.2倍的石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行液液萃取，充分振摇，静置6个小时，每种溶剂萃取4次，萃取液用EYELA N1001型旋转蒸发仪浓缩，得到干膏状的苦参石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物。

实施例3降苦参酮的分离纯化

上述乙酸乙酯部分加少量乙酸乙酯溶解过滤，上清液浓缩得到浸膏105g，取90g进行常压硅胶柱层析。选用100-200目硅胶进行拌样，1kg100-200目硅胶装柱(d＝100mm，h＝1200mm)，柱床体积为2500ml。用二氯甲烷/甲醇(50∶1，20∶1，5∶1，1∶1)作为流动相，分别得到四个组分1，2，3，4.

将3组分进行200-300目的硅胶柱层析，用800g硅胶装柱(d＝80mm，h＝1000mm)，柱体积为2L，选石油醚/乙酸乙酯(3∶1-1∶1)、二氯甲烷/甲醇(10∶1-8∶1)作为流动相，分别得到Fr1-14个组分。将其中的Fr3用石油醚/乙酸乙酯(3∶1)进行重结晶，得到米白色固体206mg，即为降苦参酮。

降苦参酮的鉴定：10％浓硫酸显示红棕色，ESI-MS给出分子离子峰m/z 424，据氢谱碳谱分析其分子式为C₂₅H₂₈O₆，其核磁数据为：

¹H NMR(400MHz，丙酮)δ7.41(d，J＝8.3Hz，1H，H-6’)，6.50(s，1H，H-6，H-3’)，6.48(d，J＝8.5Hz，1H，H-5’)，6.03(s，1H，H-6)，5.69(dd，J＝13.2，2.6Hz，1H，H-2)，5.01(t，J＝7.0Hz，1H，H-4”)，4.61(s，1H，H-9”)，4.57(s，1H，H-9”)，3.09(dd，J＝17.0，13.3Hz，1H，H-3a)，2.78(dd，J＝17.1，2.7Hz，1H，H-3e)，2.64(m，2H，H-3”)，2.53(m，1H，H-2”)，2.03(m.1H，H-1”)，1.66，1.58，1.51(s，each 3H，CH3)；

¹³C NMR(101MHz，丙酮)δ197.33(C-4)，164.35(C-7)，162.14(C-9)，161.23(C-5)，158.51(C-2’)，155.23(C-4’)，148.25(C-1’)，130.74(C-5”)，127.77(C-6’)，123.58(C-4”)，116.98(C-8”)，110.31(C-9”)，107.10(C-6)，106.94(C-5’)，102.53(C-10)，102.33(C-3’)，95.32(C-8)，74.4(C-2)，46.93(C-2”)，41.96(C-3)，31.03(C-3”)，26.87(C-1”)，24.93(C-6”)，18.25(C-10”)，16.97(C-7”)。

该数据与文献(朱丽君，苦参有效部位化学研究，[D]，北京中医药大学，2007年)中的降苦参酮的核磁数据基本一致，因此鉴定为降苦参酮。其结构如下：

实施例4 苦参提取物对EV71-3C蛋白酶抑制活性的测定

将实施例1和2中得到的苦参乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，分别用95％的DMSO溶解成50mg/mL的溶液。

按照药理活性测试部分第3部分中的筛选方法对苦参乙醇提取物和各萃取物先后进行活性测试，在50mg/mL浓度下，苦参乙醇提取物对EV71-3C蛋白酶的抑制活性为51.6％，在50mg/mL浓度下，苦参石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物对EV71-3C蛋白酶的抑制率分别为84.4％、91.6％和61.0％，由此可知苦参乙酸乙酯萃取物对EV71-3C蛋白酶的抑制活性最好，可以对其进行进一步分离纯化。

实施例5 降苦参酮对EV71-3C蛋白酶抑制活性的测定

将实施例3中得到的降苦参酮采用与实施例4相同的筛选方法该化合物进行测定，获得对EV71-3C蛋白酶的活性抑制曲线如图1所示(重复测定三次)，根据曲线进行计算，得到如下结果：在50mg/mL浓度下，降苦参酮对EV71-3C蛋白酶的抑制率为95.4％，进一步对降苦参酮进行IC₅₀值测定。

将降苦参酮用95％的DMSO溶解成50mg/mL的溶液。取10μl的上述溶液用95％的DMSO进行2倍的梯度稀释，共稀释成14个浓度的样品溶液，以Vi作为反应不同浓度样品条件下的酶反应活性计算备选样品对蛋白抑制的IC50值见表1，将稀释的化合物浓度除以相应化合物的分子量并取以10为底的对数值作为X轴，对应的Vi为Y轴，用GraphPad Prism 5作图并计算相应的IC₅₀值，得到降苦参酮的IC₅₀值，为0.0575792mg/mL，即135.8μM，抑制活性IC₅₀曲线图见图2。

表1 降苦参酮在不同稀释浓度下的Vi值

浓度(mg/ml)	Log C	Vi
			0.848	3.30103	-5.007486667
0.424	3	-4.965553333
			0.212	2.69897	-0.88617
0.106	2.39794	5.796959
			0.053	2.09691	13.58846
0.0265	1.79588	22.24459333
			0.01325	1.49485	27.50387667
0.006625	1.19382	31.04669667
			0.0033125	0.89279	33.23956667
0.00165625	0.59176	33.69735
			0.000828125	0.29073	35.06700333
0.000414063	-0.0103	34.70037
			0.000207031	-0.31133	34.14048
0.000103516	-0.61236	35.38254

根据上述实施例，可以了解苦参提取物、乙酸乙酯萃取层及其中得到的降苦参酮具有很好地抑制EV71-3C蛋白酶活性的作用。鉴于此，降苦参酮可以作为抑制EV71-3C蛋白酶抑制剂，从而预防或治疗EV71病毒感染。

为了清楚和易于理解的目的，通过举例说明和实施例详细地描述了上述发明。可以在附随的权利要求的范围内进行改变和修改，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，可以理解，上面的说明书旨在用于说明而不是用于限制。因此，本发明的范围不应参考上述说明书来确定，而应当参照下面所附权利要求以及这些权利要求所享有的等同原则所确定的全部范围确定。

Claims (6)

1.降苦参酮在制备用于预防或者治疗由EV71病毒介导的疾病的药物中的应用，其中，所述降苦参酮具有下列结构式：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为EV71-3C蛋白酶抑制剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述降苦参酮采用从植物中提取分离或者合成或半合成的方法获得。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述降苦参酮自苦参中提取分离获得。

5.根据权利要求1所述的应用，所述由EV71病毒介导的疾病为手足口病。

6.根据权利要求1所述的应用，所述由EV71病毒介导的疾病为无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹。