CN103156907B - 中药腊肠豆及其提取物的制药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供中药腊肠豆在制备治疗艾滋病的药物中的用途,特别是在制备抑制HIV‑1蛋白酶的药物中的用途。本发明提供的腊肠豆乙酸乙酯萃取物对HIV‑1蛋白酶活性的抑制率为83.4%,从腊肠豆中分离出来的白皮杉醇对HIV‑1蛋白酶抑制活性的IC50值为59μM。
Description
技术领域
本发明涉及中药的用途,具体而言,本发明涉及中药腊肠豆及其提取物的用途,属于中药领域。
背景技术
艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的慢性传染病。HIV主要侵犯、破坏T4淋巴细胞,导致机体细胞免疫功能受损,最终并发各种机会性感染和肿瘤。艾滋病严重地威胁着人类的生存,已引起世界卫生组织及各国政府的高度重视。艾滋病在世界范围内的传播越来越迅猛,严重威胁着人类的健康和社会的发展,已成为威胁人们健康的第四大杀手。联合国艾滋病规划署2006年5月30日宣布自1981年6月首次确认艾滋病以来,25年间全球累计有6500万人感染艾滋病毒,其中250万人死亡。到2005年底,全球共有3860万名艾滋病病毒感染者,当年新增艾滋病病毒感染者410万人,另有280万人死于艾滋病。据联合国艾滋病规划署《2008艾滋病流行状况报告》指出,2007年,全球防治艾滋病的努力取得了显著进展,艾滋病流行首次呈现缓和局势,新增艾滋病毒感染者的数量以及因艾滋病死亡的人数都出现下降。2007年全球新增艾滋病毒感染者270万,比2001年下降了30万;因艾滋病死亡的人数为200万,比2001年下降20万。
人类免疫缺陷病毒(Human Immuno deficiency Virus,HIV),顾名思义它会造成人类免疫系统的缺陷。1981年,人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lentivirus),属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力,导致免疫系统的失去抵抗力,而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存,发展到最后,导致艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)。目前已发现两种HIV病毒株系,分别为HIV-1和HIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-1广泛分布于世界各地,是引起全世界AIDS流行的病原,目前HIV的研究也是以HIV-1为主。
自1981年发现首例艾滋病病例以来,世界各国的科学家们就致力于寻找抗艾滋病药物。随着人们对HIV病毒学和分子生物学等方面研究的深入。近年来随着人们对AIDS更深一步的了解以及对HIV-1感染机制的阐明,抗HIV的药物筛选模型逐步建立并取得很好的应用,是以病毒酶为目的靶标的筛选模型,主要分为以HIV蛋白酶,逆转录酶和整合酶为靶点的筛选模型。
1986年,Kramer等首次报导HIV蛋白酶(protease)可作为潜在的艾滋病药物“靶标”。(Kramer RA.Sehaber MD,Skalla AM,et al.HTLV-III gag protein is processedin yeas t cells by the virus pol protease[J].Science,1986,231(4745):1580-1584.)HIV蛋白酶是由两条相同的肽链组成的同质二聚体,具有C对称轴,每条肽链由99个氨基酸残基构成。HIV蛋白酶的活性中心位于两条肽链之间,由两个起催化的天冬氨酸(Asp25和Asp 25’)组成。在这两个天冬氨酸残基的附近有一个水分子,在催化过程中此水分子作为亲核体。两个单体的相同的氨基酸残基构成与底物键合的缝隙,其一边由上述的两个天冬氨酸残基组成,另一边是由此二聚体形成的β-发卡式的结构。HIV蛋白酶在病毒复制过程中的主要作用是将gag和gag-pol基因产物裂解成病毒成熟所需要的结构蛋白(基质、壳、核壳)和酶类(蛋白酶、整合酶、逆转录酶)。虽然在体内抑制这种酶的活性,其子代病毒仍会产生,但却是不成熟和不具传染性的。因此抑制HIV蛋白酶,可阻止病毒进一步感染。目前人们已经制备了大量的肽类和非肽类HIV蛋白酶抑制剂。
根据这一思路人们合成了多种HIV-I蛋白酶抑制剂,已有10个HIV-I蛋白酶抑制剂成功应用于临床,如沙奎那韦、利托那韦、印地那韦、奈非那韦、安普那韦、阿扎那韦、地瑞那韦等。由于HIV-I病毒易变异的特点,耐药性的问题也随之出现,而国际上使用的高效的抗逆转录病毒治疗(HAART,或称“鸡尾酒疗法”)并不能根除体内的病毒,而长期的药物治疗也会带来一些副作用,且价格较高(每人每年高达15000美金)。因此,寻找新型HIV-I蛋白酶抑制剂和找到能有效抑制病毒、修复人体免疫力、低毒、廉价的抗HIV药物仍然是现阶段研究人员急需解决的问题。
天然产物及其衍生物被用于治疗各种疾病由来已久。与合成药物相比而言,天然产物具有结构多样性,功能多样性,副作用低等优点,其中传统中药更是历经几千年医疗验证,因此从中筛选结构新颖,作用方式独特的HIV蛋白酶抑制剂具有很大意义。
天然产物又称次级代谢产物(Secondary Metabolites),具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用,也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(Newman DJ,Gragg GM,Snader KM.Nat ProdRep,2000,17(3):215-234;Lee K-H.J Nat Prod.2004,67(2):273-283)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾,每年都会有大量结构新颖的化合物被发现提供出来,这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉,在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。对于天然产物尤其是来源于中药等的天然产物的研究是很有必要的,因为中药在我国已有数千年应用的历史,是一个伟大的药物小分子化合物的宝库,因此从中药等天然产物中进行重要病毒或重要疾病相关靶蛋白抑制剂的筛选是很有必要的。
腊肠豆为豆科植物腊肠豆(Cassia fistula L.)的果实。性味苦凉,清热解毒,理气润肠。治胃痛,疟疾,感冒,麻疹,水痘,便秘。
已有不少专利公开中药可以作为潜在的抗艾滋病病毒药物,刘光明等在CN101982187A中公开核桃壳提取物、周英在CN101507778A中公开了茶叶提取物、戴好富等在CN101411796A中公开了槟榔提取物、陈光英等在CN101254224中公开了青梅提取物、吴南屏等在CN1850144中公开了金银花提取物、张兰珍在CN1255355中公开了叶下珠提取物均具有抗艾滋病病毒作用。除此之外,没有有关腊肠豆(Cassia fistula L.)在抗艾滋病药物中的应用,而且,以上的提取物也没有能最终确定其抗艾滋病病毒的活性成分。
发明内容
本发明选取HIV-1蛋白酶作为靶标蛋白,通过体外酶活高通量筛选(HTS)作为初步筛选的活性评价方法筛选腊肠豆提取物,找出具备发展为具有全新抗艾滋病潜力的药物。
根据本发明的一个方面,提供了中药腊肠豆在制备治疗艾滋病的药物中的用途,特别是提供了中药腊肠豆在制备抑制HIV-1蛋白酶的药物中的用途。
本文中的中药腊肠豆是豆科植物腊肠豆(Cassia fistula L.)的果实。
本文中的腊肠豆为腊肠豆原生药材。
本文中的中药腊肠豆提取物是水提取物或有机溶剂提取物,优选有机溶剂提取物,其中有机溶剂提取物优选为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或石油醚分别提取得到的提取物或者上述溶剂的两种以上先后提取得到的提取物。其中,乙醇优选95%的乙醇。
其中,腊肠豆的乙醇提取物由以下方法制备得到:取一定量的腊肠豆药材用95%乙醇进行回流提取,料药比例为2∶1~20∶1(L/Kg),每次提取1~8小时,共计提取三次。将提取液经过滤后减压蒸干得浸膏。
本发明以HIV-1蛋白酶为靶点,从腊肠豆提取物中分离提纯出HIV-1蛋白酶抑制剂。本发明提供的HIV-1蛋白酶抑制剂为自皮杉醇,其中自皮杉醇来自腊肠豆的95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物。
本发明还提供了一种用于制备HIV-1蛋白酶抑制剂的药物组合物,该药物组合物是由所述的腊肠豆原生药材或其有机溶剂提取物为活性成分,加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
以上述中药腊肠豆或其提取物为活性成分,与药学上可接受的辅助添加剂成分混合后,按相应的常规药物制剂方法,可以制备抑制HIV-1蛋白酶活性、预防和/或治疗艾滋病的药物。例如,与在口服制剂中可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用辅助添加成分混合后,按常规的操作方法和过程,可以制成为片剂、丸剂、胶囊剂或多种相应的缓释剂、控释剂等固体口服制剂形式的药物;与常规的增溶剂、乳化剂、润饰剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合后,按相应的常规方法,可以制备成为合剂、糖浆、口服液等液体制剂形式的口服药物;与常规的悬浮剂、稳定剂、分散剂或调节溶液渗透压剂混合,按相应的常规方法,配置成注射液。
进一步的,本发明提供了该药物组合物的制备方法,包括以下步骤:
(a)取一定量的腊肠豆,用1-3倍量的95%乙醇回流提取3次,合并提取液,浓缩得浸膏。
(b)称取一定量步骤(a)中的浸膏,用蒸馏水分散,分别经过石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层4部分,浓缩以后得相应的粗组分。
(c)取步骤(b)所得的粗组分,进行HIV-1蛋白酶的抑制率测定。
(d)利用硅胶柱层析、sephadex LH-20凝胶柱层析色谱法对步骤(c)测得的具有高活性的粗组分,做进一步分离。分离过程中遵循活性跟踪的原则只对有活性的部分进行分离纯化。
(e)将纯化的单一组分进行核磁共振分析确认结构。
(f)对步骤(e)确认的单一组分进行HIV-1蛋白酶抑制活性测定,确定IC50值。
通过本发明的HIV-1蛋白酶抑制剂的筛选方案从腊肠豆中提取分离出了HIV-1蛋白酶抑制剂,其中乙酸乙酯萃取层对HIV-1蛋白酶有明显的抑制活性,从中分离的二苯乙烯类化合物自皮杉醇对HIV-1蛋白酶的抑制活性IC50达59μM。
按照本发明,可以将上述含有中药腊肠豆或其提取物,或中药腊肠豆及其提取物与其它具有预防和/或治疗艾滋病作用的西药或中药活性成分配伍组成的复方制剂,按照常规的制剂技术,制备成口服制剂或注射剂。
附图说明
图1示出HIV-1蛋白酶抑制剂筛选模型的示意图。
图2示出腊肠豆的95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物的分离纯化流程图。
图3示出腊肠豆的95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物经过分离纯化后得到的八个部分的活性筛选结果。
图4示出自皮杉醇抑制HIV-1蛋白酶的IC50曲线图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例1腊肠豆原生药药品与浸膏制备
取中药腊肠豆为原生药,按常规方法粉碎,过筛,制成粒度为60~80目的腊肠豆细粉,灭菌,分装即成。
称取2公斤腊肠豆细粉,用8升95%乙醇提取三次,每次回流3小时,合并有机相,浓缩后的浸膏165克。备用。
实施例2HIV-1蛋白酶的表达、纯化、蛋白活性检测以及IC50值的测定
1)HIV-1蛋白酶的表达、纯化:
a)HIV-1蛋白酶片段的扩增及表达载体的构建
设计引物PCR将HIV-1蛋白酶编码片段扩增,回收PCR产物及pET-11a载体用Nde I和BamH I酶切,回收目的片段,将酶切后的片段与线性化载体进行连接后转化E.coli.DH5α感受态细胞。挑取转化的克隆进行PCR鉴定,阳性克隆进行DNA测序。
HIV-1蛋白酶的基因序列:
cctcagatcactctttggcaacgacccctcgtcacaataaagataggggg
gcaactaaaggaagctctattagatacaggagcagatgatacagtattag
aagaaatgagtttgccaggaagatggaaaccaaaaatgatagggggaat
tggaggttttatcaaagtaagacagtatgatcagatactcatagaaatctg
cggacataaagctataggtacagtattagtaggacctacacctgtcaacat
aattggaagaaatctgttgactcagattggatgcactttaaatttt
b)HIV-1蛋白酶的表达和纯化
培养经测序正确的克隆菌株,提取质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取单克隆在37℃培养至OD600nm≈0.4-0.6,加入1mmol/L IPTG,诱导5h。离心收集菌体,以溶液A(20mMTris-HCl,pH8.0,500mM NaCl,2mMEDTA)重悬菌体,超声破菌。离心收集包涵体。用溶液B(20mMTris-HCl,pH8.0,500mM NaCl,2mM EDTA,2%TritonX-100,2%Tween20)重悬包涵体,重复3次。用溶液C(20mM Tris,pH8.0,10mM NaCl,8M Urea)溶解包涵体。16000rpm/min离心20min,取上清。将上清用30KD浓缩管浓缩,收集膜下溶液稀释至0.1mg/ml,加入截留分子量为3kD的透析袋中,放入4℃预冷的透析缓冲液A(20mMNaH2PO4-Na2HPO4,pH7.2,25mMNaCl,10%甘油,0.2%beta-巯基乙醇)中,透析过夜,将透析袋转移入4℃预冷的透析缓冲液B(20mM NaAc-HAc,pH5.2,0.2%beta-巯基乙醇)中,透析4-5小时。取出透析袋中溶液,12000rpm/min离心20min,收集上清,测定复性后蛋白的活性,把得到的有活性的蛋白浓缩至5mg/ml。
2)HIV-1蛋白酶抑制剂筛选模型的建立:
利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术测定针对HIV-1蛋白酶的抑制剂的活性,根据HIV-1蛋白酶识别位点设计底物:MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp,当抑制剂对HIV-1蛋白酶没有作用时,HIV-1蛋白酶可以切割底物,淬灭基团(Dnp)远离荧光基团(MCA),荧光基团吸收320nm波长,激发出405nm的波长,通过检测器检测荧光强度,如果抑制剂对HIV-1蛋白酶有作用,淬灭基团不会被切去,荧光基团吸收320nm波长后一部分能量会转移给淬灭基团,405nm的激发光强度就会减弱,以此来检测抑制剂对HIV-1蛋白酶的抑制效果。
根据待测样品存在或不存在时的荧光强度变化,可以待测样品对HIV-1蛋白酶活性的抑制程度或者剩余活性,从而完成对HIV-1蛋白酶抑制剂的初步筛选。从而建立了HIV-1蛋白酶抑制剂筛选模型(如图1所示),利用该模型可以在短时间内完成对大量样品的筛选工作,该模型也可以用于已知有HIV-1蛋白酶活性的物质,以检验其作用位靶点是否是HIV-1蛋白酶。
3)HIV-1蛋白酶抑制剂的筛选方法:
将蛋白浓度稀释至500nM,底物20μM,检测荧光强度。每个反应体系100μL,先加入蛋白97μL与1μL待测样品混匀,然后加入2μL底物启动反应,并立即测定荧光强度,每隔3秒测一次,测3分钟,同时设计阴性及阳性对照实验。阳性对照:将1μL待测样品改为1μL50mg/mLPeptatinA,其余不变;阴性对照:将1μL待测样品改为1μL95%DMSO,其余不变。针对每种药物平行测定三次。酶促反应中,根据产物的生成量(即荧光强度)随着反应时间的变化,绘制酶促反应过程曲线。曲线的斜率表示单位时间内产物生成量的变化,所以曲线上任何一点的斜率就是该相应时间的反应速率,在底物消耗量小于10%(反应开始很短的时间内)的范围内,曲线斜率为酶反应的速率。根据反应过程曲线的初速度来计算药物对酶的抑制效果。阴性对照,反应速率定为V0,实验组反应的初速度定为Vi。Vi/V0则反映蛋白的剩余活性,(1-Vi/V0)则为待测样品对蛋白的抑制率。
初次筛选出剩余活性低于50%的待测样品为阳性结果,还需要通过荧光淬灭的方法排除假阳性。采用的方法是先将蛋白与底物混匀,反应完全,荧光值达到最大值时,在体系中加入待测样品,再次测定荧光值。通过待测样品加入反应体系前后荧光值的变化计算待测样品对产物荧光的淬灭率。将反应达到最大值的荧光值定为Q,加入化合物后,荧光值定为Qi,待测样品对产物荧光的淬灭率为(Q-Qi)/Q。针对剩余活性低于50%,淬灭率低于30%的药物进行复测其IC50值。将待测样品用95%DMSO以2倍浓度梯度进行稀释,测定待测样品对蛋白的抑制率。
实施例3从腊肠豆中分离HIV-1蛋白酶抑制剂
将实施例1所获得的浸膏作为样品用1.4倍量双蒸水超声2小时使其分散后,倒入分液漏斗中,用乙酸乙酯和正丁醇进行萃取,充分振摇,静置6个小时,每种溶剂萃取3次,分离有机相和水相,萃取液用EYELAN1001型旋转蒸发仪浓缩,得到的干膏状腊肠豆乙酸乙酯和正丁醇萃取样品,作为HIV蛋白酶体外抑制剂的筛选及分离样品。
在0.5mg/mL的药物浓度下测试以上的萃取物对HIV蛋白酶的抑制效果,发现乙酸乙酯萃取物有较好的抑制活性,抑制率为83.4%。故选择乙酸乙酯萃取物为下一步的分离纯化样品。
将上述的乙酸乙酯萃取物用等重量的硅胶拌样,研磨粉碎且均匀后,选择10倍于样品重量的正相色谱硅胶用常压柱进行分离,分别得到F1-F8八个部分(如图2所示)。对F1-F8进行活性测定,在0.5mg/mL下对HIV蛋白酶的抑制率依次是32.9%、46.5%、49.9%、82.9%、72.6%、95.0%、105%、107%(如图3所示)。选取F6用sephadex LH-20凝胶柱层析色谱法做进一步的分离纯化,得到一个单体化合物,该化合物为白色粉末(甲醇),熔点为227℃,其核磁共振数据为1H-NMR((CD3)2CO,400MHz,δ,ppm):7.09(1H,d,J=1.6Hz,H-2),6.99(1H,d,J=16Hz,-CH=CH-),6.93(1H,dd,J1=8HzJ2=2Hz,H-6),6.86(1H,d,J=16Hz,-CH=CH-),6.83(1H,d,J=8Hz,H-5),6.55(2H,d,J=2Hz,H-2′,6′),6.29(1H,t,J=2Hz,H-4′);ESI-MS(m/z,%):M+244(100%)。以上核磁与质谱数据与文献(N.R.Ferrigni andJ.L.McLaughlin,Use Of Potato Disc And Brine Shrimp Bioassays To DetectActivity And Isolate Piceatannol As The Antileukemic Principle From The SeedsOf Euphorbza Lagascae,Journal of Natural Products,1984,47(2):347-352.)中的自皮杉醇的数据基本一致,因此推断该化合物为自皮杉醇。自皮杉醇的结构式如下:
利用实施例2所描述的方法测定自皮杉醇对HIV-1蛋白酶的抑制活性。
以10为底的对数值作为X轴,对应的剩余活性值为Y轴,用GraphPad Prism 5作图计算出相应的IC50值(如图4所示),腊肠豆提取物对HIV-1蛋白酶抑制活性的IC50值为59μM。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.中药腊肠豆的果实的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在制备治疗艾滋病的药物中的用途。
2.中药腊肠豆的果实的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在制备抑制HIV-1蛋白酶的药物中的用途。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的用途,其中所述腊肠豆为腊肠豆的原生药材。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的用途,其中乙醇浓度为95%。
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