CN103127205B - 中药夜关门及其提取物的制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了中药夜关门及其提取物在制备治疗艾滋病的药物中的用途。实验表明夜关门的乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物在0.5mg/mL的浓度下的抑制率分别为96.8％、92.7％和97.9％。

Description

中药夜关门及其提取物的制药用途

技术领域

本发明涉及中药的用途，具体而言，本发明涉及中药夜关门及其提取物的用途，属于中药领域。

背景技术

获得性免疫缺陷综合症(Acquiredlmmune Deficiency Syndrome，简写为AIDS)，也称为艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的传染性疾病。HIV病毒是一种能攻击人体免疫系统的病毒，它把人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏T4淋巴细胞，从而破坏人的免疫系统，最终使免疫系统崩溃，使人体因丧失对各种疾病的抵抗能力而发病，从而发生多种感染或肿瘤，最后导致死亡。

艾滋病的危害席卷全球，蔓延之势十分迅猛。1984年，全世界报告的艾滋病患者不足3000人。联合国艾滋病规划署发布的《2008艾滋病流行状况报告》指出：截至2007年底，艾滋病已经导致2500万人死亡，另有3300万人受感染，其中我国有70万人。我国自1985年首次发现HIV病毒感染者，至今已有60～80万人发生了感染，专家估计，如果不迅速采取有效的预防措施，按目前的年平均30％的增长速度，我国的HIV感染者将超过1000万。在非洲的有些国家，HIV的感染率达总人口30％以上。因此，预防和治疗艾滋病，己不仅仅是挽救个人生命的问题，而是关系到民族存亡的大事。

HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(lentivirus)，目前己发现两种HIV病毒株系，分别为HIV-I和HIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-I广泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-I为主进行的。HIV-I蛋白酶是抗艾滋病药物的有效作用靶点，对它的抑制能有效的阻止HIV-I病毒的复制，从而起到抗艾滋病的作用。根据这一思路人们合成了多种HIV-I蛋白酶抑制剂，已有10个HIV-I蛋白酶抑制剂成功应用于临床，如沙奎那韦、利托那韦、印地那韦、奈非那韦、安普那韦、阿扎那韦、地瑞那韦等。由于HIV-I病毒易变异的特点，耐药性的问题也随之出现，而国际上使用的高效的抗逆转录病毒治疗(HAART，或称“鸡尾酒疗法”)并不能根除体内的病毒，而长期的药物治疗也会带来一些副作用，且价格较高(每人每年高达15000美金)。因此，寻找新型HIV-I蛋白酶抑制剂和找到能有效抑制病毒、修复人体免疫力、低毒、廉价的抗HIV药物仍然是现阶段研究人员急需解决的问题。

利用我国丰富的天然中草药资源，分离提取其中的活性成分，并以此为先导化合物，是发展HIV-1蛋白酶抑制剂的有效途径。

天然产物又称次级代谢产物(Secondary Metabolites)，具有结构多样性和生物活性多样性的特点。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(Newman DJ，Gragg GM，Snader KM.Nat ProdRep，2000，17(3)：215-234；Lee K-H.J Nat Prod，2004，67(2)：273-283)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现提供出来，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。因为中药在我国已有数千年应用的历史，是一个伟大的药物小分子化合物的宝库，因此，从天然资源中发展新的抗艾滋病病毒药物成为研究的一个热点。

刘光明等在CN101982187A中公开核桃壳提取物、周英在CN101507778A中公开了茶叶提取物、戴好富等在CN101411796A中公开了槟榔提取物、陈光英等在CN101254224中公开了青梅提取物、吴南屏等在CN1850144中公开了金银花提取物、张兰珍在CN1255355中公开了叶下珠提取物均具有抗艾滋病病毒作用。

夜关门是豆科蝶形花亚科胡枝子属植物截叶铁扫帚(Lespedeza cuneata(Dum.Cour.)G.Don)的全草或带根全草。生于山坡、荒地或路边。分布东北、山东、江苏、浙江、江西、湖北、湖南、四川、云南、福建、广东、广西、贵州等地。全株夏秋采收，晒干。性平，味微苦。具有平肝明目，祛风利湿，散瘀消肿的功效。临床用于治疗病毒性肝炎、痢疾、慢性支气管炎、小儿疳积、风湿关节、夜盲、角膜溃疡、乳腺炎。

周春熙在CN1287839A中公开了夜关门作为组方药之一用于治疗癌症。谭高良在CN1330936A中公开了夜关门作为药物配方之一用于治疗烧伤。黄兴在CN1340356中公开了夜关门作为组方药物之一用于治疗肠胃病。韦克仪在CN1600335A中公开了夜关门作为组方药之一用于治疗内痔出血的口服药。邓辛贵等在CN1100649A中公开了夜关门可以作为苏木科中的一味备选药与芸香科和毛茛科的中草药提取物制成解毒止痛中成药。武彪在CN101164565A中公开了夜关门作为组方药之一治疗须发少白、中年早白、脱发的特效中药膏剂。廖力锋在CN101444610A中公开了夜关门作为中药配方中的使药用于治疗遗精病。夏云香在CN101549116A中公开了夜关门作为组方药之一用于治疗乙肝病。宋汝平在CN101485879A中公开了夜关门作为组方药之一用于治疗胆囊炎。赵龙山在CN102178860A中公开了夜关门作为组方药之一用于治疗糖尿病。但是，尚未见对中药夜关门在抗艾滋病方面的报道。

发明内容

本发明提供了中药夜关门在制备治疗艾滋病的药物中的新用途。

本发明还提供了中药夜关门在制备抑制HIV-1蛋白酶的药物中的用途。

所述的中药夜关门是豆科蝶形花亚科胡枝子属植物截叶铁扫帚(Lespedezacuneata(Dum.Cour.)G.Don)的全草或带根全草。

所述的夜关门为夜关门原生药材或有机溶剂提取物。

其中，所述的夜关门有机溶剂提取物为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或石油醚分别提取得到的提取物或者上述溶剂的两种以上先后提取得到的提取物。其中，乙醇优选95％的乙醇。

其中，夜关门的有机溶剂提取物由以下方法制备得到：

(a)取一定量的夜关门，用5-10倍量的95％乙醇回流提取3次，每次1-3小时，合并提取液，浓缩得浸膏。

(b)称取一定量步骤(a)中的浸膏，用蒸馏水分散，分别经过石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物3部分，浓缩以后得相应的粗组分。

(c)取步骤(b)所得的粗组分，置30～50℃下减压烘干1～3小时得干品。

本发明还提供了夜关门的乙醇提取物在制备抑制HIV-1蛋白酶的药物中的用途，即夜关门的乙醇提取物在制备治疗艾滋病的药物中的用途，其中乙醇优选95％的乙醇。

而且，本发明还提供了夜关门的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在制备抑制HIV-1蛋白酶的药物中的用途，即夜关门的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在制备治疗艾滋病的药物中的用途。

本发明还提供了夜关门的乙醇提取物的正丁醇萃取物在制备抑制HIV-1蛋白酶的药物中的用途，即夜关门的乙醇提取物的正丁醇萃取物在制备治疗艾滋病的药物中的用途。

本发明还提供了一种用于制备HIV-1蛋白酶抑制剂的药物组合物，该药物组合物是由所述的夜关门原生药材或其有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

以上述中药夜关门或其提取物为活性成分，与药学上可接受的辅助添加剂成分混合后，按相应的常规药物制剂方法，可以制备抑制HIV-1蛋白酶活性、预防和/或治疗艾滋病的药物。例如，与在口服制剂中可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用辅助添加成分混合后，按常规的操作方法和过程，可以制成为片剂、丸剂、胶囊剂或多种相应的缓释剂、控释剂等固体口服制剂形式的药物；与常规的增溶剂、乳化剂、润饰剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合后，按相应的常规方法，可以制备成为合剂、糖浆、口服液等液体制剂形式的口服药物；与常规的悬浮剂、稳定剂、分散剂或调节溶液渗透压剂混合，按相应的常规方法，配置成注射液。

进一步的，本发明提供了该药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

a)夜关门用5-10倍量的95％乙醇回流提取3次，每次1-3小时，合并提取液，浓缩得浸膏；

b)称取一定量步骤(a)中的浸膏，用蒸馏水分散，分别经过石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物3部分，浓缩以后得相应的粗组分；

c)以夜关门有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂。

按照本发明，可以将上述含有中药夜关门或其提取物，或中药夜关门及其提取物与其它具有预防和/或治疗艾滋病作用的西药或中药活性成分配伍组成的复方制剂，按照常规的制剂技术，制备成口服制剂或注射剂。

对夜关门的乙醇提取物、醇提物的石油醚萃取物、醇提物的乙酸乙酯萃取物以及醇提物的正丁醇萃取物进行HIV-1蛋白酶的抑制率测定，实验表明夜关门的乙醇提取物、醇提物的乙酸乙酯萃取物、醇提物的正丁醇萃取物在0.5mg/mL的浓度下对HIV-1蛋白酶的抑制率分别为96.8％、92.7％和97.9％，均在90％以上。

附图说明

图1示出HIV-1蛋白酶抑制剂筛选模型的示意图。

图2示出在测定HIV-1蛋白酶的抑制率的方法中夜关门的乙醇提取物的剩余活性曲线图。

图3示出在0.5mg/mL的药物浓度下各萃取物在HIV-1蛋白酶的抑制率测定过程中的荧光强度曲线图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1夜关门原生药药品的制备

取中药夜关门全草为原生药，按常规方法粉碎，过筛，制成粒度为60～80目的夜关门细粉，灭菌，分装即成。

实施例2夜关门有机溶剂提取物的制备

将2kg夜关门药材用5-10倍量95％乙醇提取3次，每次1-3小时，合并提取液，减压浓缩得粗提物，用1.4倍量双蒸水超声2小时使其分散后，倒入分液漏斗中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，充分振摇，静置6个小时，每种溶剂萃取3次，分离有机相和水相，萃取液用EYELAN1001型旋转蒸发仪浓缩，得到的干膏状夜关门石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取样品以及乙醇粗提物作为HIV-1蛋白酶体外抑制剂的筛选样品。

以下详细描述HIV-1蛋白酶体外抑制剂的筛选方案。

1)HIV-1蛋白酶的表达、纯化：

a)HIV-1蛋白酶片段的扩增及表达载体的构建

设计引物PCR将HIV-1蛋白酶编码片段扩增，回收PCR产物及pET-11a载体用Nde I和BamH I酶切，回收目的片段，将酶切后的片段与线性化载体进行连接后转化E.coli.DH5α感受态细胞。挑取转化的克隆进行PCR鉴定，阳性克隆进行DNA测序。

HIV-1蛋白酶的基因序列：

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b)HIV-1蛋白酶的表达和纯化

培养经测序正确的克隆菌株，提取质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在37℃培养至OD600nm≈0.4-0.6，加入1mmol/L IPTG，诱导5h。离心收集菌体，以溶液A(20mMTris-HCl，pH8.0，500mM NaCl，2mMEDTA)重悬菌体，超声破菌。离心收集包涵体。用溶液B(20mMTris-HCl，pH8.0，500mM NaCl，2mM EDTA，2％TritonX-100，2％Tween20)重悬包涵体，重复3次。用溶液C(20mM Tris，pH8.0，10mM NaCl，8M Urea)溶解包涵体。16000rpm/min离心20min，取上清。将上清用30KD浓缩管浓缩，收集膜下溶液稀释至0.1mg/mL，加入截留分子量为3kD的透析袋中，放入4℃预冷的透析缓冲液A(20mMNaH2PO4-Na2HPO4，pH7.2，25mMNaCl，10％甘油，0.2％beta-巯基乙醇)中，透析过夜，将透析袋转移入4℃预冷的透析缓冲液B(20mM NaAc-HAc，pH5.2，0.2％beta-巯基乙醇)中，透析4-5小时。取出透析袋中溶液，12000rpm/min离心20min，收集上清，测定复性后蛋白的活性，把得到的有活性的蛋白浓缩至5mg/mL。

2)HIV-1蛋白酶抑制剂筛选模型的建立：

利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技术测定针对HIV-1蛋白酶的抑制剂的活性，根据HIV-1蛋白酶识别位点设计底物：MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp，当抑制剂对HIV-1蛋白酶没有作用时，HIV-1蛋白酶可以切割底物，淬灭基团(Dnp)远离荧光基团(MCA)，荧光基团吸收320nm波长，激发出405nm的波长，通过检测器检测荧光强度，如果抑制剂对HIV-1蛋白酶有作用，淬灭基团不会被切去，荧光基团吸收320nm波长后一部分能量会转移给淬灭基团，405nm的激发光强度就会减弱，以此来检测抑制剂对HIV-1蛋白酶的抑制效果。

根据待测样品存在或不存在时的荧光强度变化，可以待测样品对HIV-1蛋白酶活性的抑制程度或者剩余活性，从而完成对HIV-1蛋白酶抑制剂的初步筛选。从而建立了HIV-1蛋白酶抑制剂筛选模型(如图1所示)，利用该模型可以在短时间内完成对大量样品的筛选工作，该模型也可以用于已知有HIV-1蛋白酶活性的物质，以检验其作用位靶点是否是HIV-1蛋白酶。

3)HIV-1蛋白酶抑制剂的筛选方法：

将蛋白浓度稀释至500nM，底物20μM，检测荧光强度。每个反应体系100μL，先加入蛋白97μL与1μL待测样品混匀，然后加入2μL底物启动反应，并立即测定荧光强度，每隔3秒测一次，测3分钟，同时设计阴性及阳性对照实验。阳性对照：将1μL待测样品改为1μL 50mg/mLPeptatinA，其余不变；阴性对照：将1μL待测样品改为1μL 95％DMSO，其余不变。针对每种药物平行测定三次。酶促反应中，根据产物的生成量(即荧光强度)随着反应时间的变化，绘制酶促反应过程曲线。曲线的斜率表示单位时间内产物生成量的变化，所以曲线上任何一点的斜率就是该相应时间的反应速率，在底物消耗量小于10％(反应开始很短的时间内)的范围内，曲线斜率为酶反应的速率。根据反应过程曲线的初速度来计算药物对酶的抑制效果。阴性对照，反应速率定为V0，实验组反应的初速度定为Vi。Vi/V0则反映蛋白的剩余活性，(1-Vi/V0)则为待测样品对蛋白的抑制率。

初次筛选出剩余活性低于50％的待测样品为阳性结果，还需要通过荧光淬灭的方法排除假阳性。采用的方法是先将蛋白与底物混匀，反应完全，荧光值达到最大值时，在体系中加入待测样品，再次测定荧光值。通过待测样品加入反应体系前后荧光值的变化计算待测样品对产物荧光的淬灭率。将反应达到最大值的荧光值定为Q，加入化合物后，荧光值定为Qi，待测样品对产物荧光的淬灭率为(Q-Qi)/Q。针对剩余活性低于50％，淬灭率低于30％的药物进行复测其IC₅₀值。将待测样品用95％DMSO以2倍浓度梯度进行稀释，测定待测样品对蛋白的抑制率。

实施例3测定夜关门提取物对HIV-1蛋白酶的抑制率

夜关门的乙醇提取物以1mg/mL为起始浓度，用95％DMSO以2倍浓度梯度进行稀释，将实施例2中得到的乙醇粗提物用95％DMSO溶解配制成1.00mg/mL的浓度，用95％DMSO以2倍浓度梯度进行稀释，配制成1.00、0.500、0.250、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.00780、0.00390、0.00195、0.000977、0.000488、0.000244、0.000122、0.0000610、0.0000305和0.0000153mg/mL的浓度下的待测样品，根据上述HIV-1蛋白酶体外抑制剂的筛选方案测定待测样品对HIV-1蛋白酶的抑制率。具体方法：每个反应体系100μL，加入蛋白97μL与1μL不同浓度的夜关门乙醇提取物，混匀，然后加入2μL底物启动反应，并立即测定荧光强度，使用Thermo Scientific Fluoroskan Ascent FL，每隔3秒测一次，测定60个点，重复测定三次。根据不同浓度待测样品对HIV-1蛋白酶的抑制活性，计算相应的HIV-1蛋白酶的剩余活性，利用GraphPad Prism5软件，进行非线性分析，拟合出剩余活性与待测样品浓度对数值的曲线。实验结果显示，当待测样品的浓度为0.500mg/mL、0.250mg/mL、0.125mg/mL时，对HIV-1蛋白酶的抑制率分别为96.8％、78.7％和56.9％。图2表明，夜关门乙醇提取物浓度低于0.062mg/mL，其对HIV-1蛋白酶的抑制率低于50％。

在0.5mg/mL的药物浓度下测试夜关门醇提物的各萃取物下对HIV-1蛋白酶的抑制活性，实验表明其石油醚萃取物(PE)、乙酸乙酯萃取物(ET)、正丁醇萃取物(BA)的抑制率分别为39.8％、92.7％和97.9％，正丁醇层经聚酰胺色谱法除去鞣质类成分后(BA-1)其抑制率降低为79.7％。具体方法：每个反应体系100μL，加入97μL蛋白与1μL夜关门醇提物的各萃取物，混匀，然后加入2μL底物启动反应，并立即测定荧光强度，使用Thermo ScientificFluoroskan Ascent FL，每隔3秒测一次，测定60个点，重复测定三次，根据酶活反应过程曲线，拟合出各萃取组分的初速率，石油醚萃取物(PE)为19.60，乙酸乙酯萃取物(ET)为2.37，正丁醇萃取物(BA)为0.69，正丁醇层经聚酰胺色谱法除去鞣质类成分后(BA-1)为6.59，阴性对照酶活反应的初速率为32.6，根据1-Vi/V0，计算石油醚萃取物(PE)、乙酸乙酯萃取物(ET)、正丁醇萃取物的抑制率分别为39.8％、92.7％和97.9％，正丁醇层经聚酰胺色谱法除去鞣质类成分后(BA-1)其抑制率降低为79.7％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.中药夜关门的有机溶剂的提取物在制备治疗艾滋病的药物中的用途，其中，所述有机溶剂的提取物包括乙醇提取物的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。

2.中药夜关门的有机溶剂的提取物在制备抑制HIV-1蛋白酶的药物中的用途，其中，所述有机溶剂的提取物包括乙醇提取物的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其特征在于：所述中药夜关门为豆科蝶形花亚科胡枝子属植物截叶铁扫帚(Lespedeza cuneata)的全草或带根全草。

4.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其特征在于：所述中药夜关门为夜关门原生药材。

5.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中乙醇浓度为95％。