CN102178668B - 亚油酸在制备抗hpv药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种亚油酸在制备治疗抗HPV药物中的应用。本发明的亚油酸溶液可以是用亚油酸配置的溶液，也可以是从天然植物中提取出来的提取物。本发明的亚油酸对Hacat细胞增殖有抑制作用的趋势，且随药物的作用时间延长，抑制的趋势增大。从PCR实验和细胞学实验，证明具有抗HPV作用，能起到治疗CA的作用。

Description

亚油酸在制备抗HPV药物中的应用

技术领域

本发明提供了一种亚油酸在制备治疗抗HPV药物中的应用。

背景技术

人类乳突病毒(Human Papillomavirus，简称HPV)是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性，长期以来，已知HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。像乙肝病毒一样，HPV也是一种DNA病毒。它原是多瘤空泡病毒科的一员，1999年国际病毒分类委员会(ICTV)取消多瘤空泡病毒科，代之以乳头瘤病毒科，因此，HPV便归属此门下。

人类乳头状瘤病毒(HPV)引起的性传染极为普遍，单是美国就有两千万人染得此病。HPV(人乳头瘤病毒)是继“世纪绝症”艾滋病后的一种无药可救的性病，不论男女都有可能感染HPV，女性染病后甚至可引致子宫颈癌。由于HPV通过皮肤直接传染，使用安全套也无法预防。

全世界有四亿四千万的人口受到HPV的感染，每年至少有五十万的妇女被诊断有子宫颈癌，这些大部分发生在开发中的国家。HPV是引起子宫颈癌与生殖器疣，俗称“菜花”的元凶，在一百多种的HPV类型当中，已经知道有37种靠性接触传染，能够导致性病。它们广泛存在于成年人族群，来无影去无踪，没有任何症状。第6和第11类型可以引起男女两性的生殖器疣。这种疣本身并非癌症，但是它造成的疼痛和心理创伤非言语所能形容。

但是，迂回感染了高风险的HPV类型就可以导致子宫颈癌、其它生殖器癌或肛门癌。这些高风险的类型大约有19种之多，其中以造成子宫颈癌的第16和第18类型最为常见。

子宫颈癌是一个感染性疾病，它是可以预防，可以治疗、治愈和消灭的。子宫颈癌是由于人乳头瘤病毒感染引起的。如果能够预防HPV感染，就可以说能够预防子宫颈癌；如果没有HPV感染，可以说不会得宫颈癌。这是已有定论的，这是在会上得到公认的。这里讲的宫颈癌，就是指子宫颈的浸润癌，简称CC。一般来讲，宫颈癌就是浸润癌；其他的癌前病变，就叫CIN，包括宫颈的原位癌，把它归在CIN3里面。如果是浸润癌，就叫子宫颈癌了。

亚油酸，英文名称：linoleic acid，学名顺，顺-9，12-十八(碳)二烯酸，是含有18个碳原子和2个双键的不饱和脂肪酸，分子式：C₁₈H₃₂O₂，分子结构简式CH₃(CH₂)₄CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇COOH。亚油酸具有降低血脂、软化血管、降低血压、促进微循环的作用，可预防或减少心血管病的发病率，特别是对高血压、高血脂、心绞痛、冠心病、动脉粥样硬化、老年性肥胖症等的防治极为有利。但是，对于亚油酸的抗HPV作用未见报道。

发明内容

本申请的发明人意外发现，亚油酸具有抗HPV的作用。

因此，本发明提供亚油酸在制备抗HPV药物中的应用。

本发明还提供亚油酸在制备预防或治疗HPV相关疾病的药物中的应用。

本发明中，亚油酸是通过抑制角质形成细胞增殖来预防或治疗HPV相关疾病的。

本发明中，亚油酸是通过抑制成纤维细胞增殖来预防或治疗HPV相关疾病的

本发明所述的HPV相关疾病包括但不限于子宫颈癌、其它生殖器癌或肛门癌或生殖器疣。

本发明所述的亚油酸优选是药学上可接受的纯亚油酸，也可以是重量百分含量为0.45％～99.9％的亚油酸溶液。

本发明的亚油酸可以从市场购置，也可以按照现有技术的方法获得，例如可以以大豆油为原料，经皂化、水解、初馏、精馏制备亚油酸；还可以以红花油为原料制备亚油酸，具体如下：

在反应器中，按配比为红花油、水、氢氧化钠＝2.0∶1.1∶1.0，先加入红花油和水，搅拌均匀后，慢慢升温至80℃，再缓慢地滴加氢氧化钠溶液，滴加时间为30min，保温反应6h。反应完毕，静置30mln，分去下层的水，再用20min加入硫酸，加酸温度为95士3℃，硫酸加入量为氢氧化钠的1.2倍，水解时间4h。水解结束后，使水解物降至常温，静置分水。然后进行水洗，水洗次数6～8次.每次加水量为红花油量的2倍，洗至pH＝7，先沉降分水，再用离心机分离有机相和水相。将分离好的有机相，进行冷冻结晶，冷冻降温速度为每小时5℃，冷冻结晶温度为-8～-10℃，时间为48h，再用抽滤法将结晶物滤去，底部滤液为亚油酸产品。

本发明的亚油酸溶液可以是用亚油酸配置的溶液，也可以是从天然植物中提取出来的提取物，例如可以是从鸦胆子提取出来的含亚油酸的鸦胆子脂溶性成分(鸦胆子油)。含亚油酸的鸦胆子油可以按照任何现有技术的方法获得，优选地，可以按照如下方法获得：

(1)鸦胆子油的提取：鸦胆子破碎果壳后，用体积为鸦胆子重量5倍量的石油醚提取2次，每次1小时，以70℃水浴加热挥尽石油醚至恒重；

(2)鸦胆子油的纯化：取步骤(1)的鸦胆子油加入石油醚稀释，再加入活性炭，水浴回流，滤过，回收石油醚得无色鸦胆子油，以95％乙醇萃取3～5次，得95％乙醇萃取物。

本发明发现亚油酸对Hacat细胞增殖有抑制作用的趋势，且随药物的作用时间延长，抑制的趋势增大。表明亚油酸可以通过对人角质形成细胞的增殖抑制作用而抑制HPV-DNA的复制，从而起到治疗CA的作用。

附图说明

图1药理学PCR实验工艺流程图

图2HPV-DNA定量回归直线

图3HPV-DNA扩增阳性标本结果图

图4HPV-DNA扩增阴性标本结果图

图5亚油酸回归曲线

图6MTT法亚油酸对成纤维细胞的增殖影响作用

图7MTT法亚油酸对Hacat细胞的增殖影响作用

图8MTT法亚油酸对Hacat细胞的不同时间作用增殖影响

图A-以不同浓度为横坐标，每一组柱图从左向右分别是培养24小时、48小时和72小时的A值；

图B-以不同作用时间为横坐标

1-1％DMSO，2-0.00156g/ml亚油酸，3-0.00312g/ml亚油酸，4-0.00625g/ml亚油酸，5-0.0125g/ml亚油酸，6-0.025g/ml亚油酸，7-0.05g/ml亚油酸

具体实施方式

为了说明本发明的亚油酸的抗HPV和相关疾病的作用，本发明提供了以下实验：

含亚油酸的鸦胆子的抗HPV作用

本实验研究的亚油酸来源于苦木科植物鸦胆子Brucea javanica(L.)Merr的干燥成熟果实的提取物，具体研究内容如下：

药材鉴定：

鸦胆子的鉴定

基于历代“本草”对中药形态特征的记述往往不十分详尽和准确。致使中药的品种混乱现象相当突出，同名异物，同物异名等始终未能澄清。这对中药的生产、科研均有妨碍。此外，中药市场以次充好、以假乱真现象也较普遍，为了控制中药质量、保证中药研究的可信度，中药材的鉴别有着十分重要的意义，为此，我们根据《中国药典2005年版第一部中鸦胆子的相关内容，对本课题研究中所用的鸦胆子进行品种鉴定。

1实验药材

鸦胆子(20080410)        广东康美药业股份有限公司

2实验方法

2.1鉴定方法

根据《中国药典》2005年版第一部中鸦胆子的相关内容规定，鸦胆子的品种鉴定主要是从性状和与其它物质鉴别两方面。具体的标准、方法和结果见表1。

表1鸦胆子的鉴定

2.2鉴定结果

符合《中国药典》2005年版第一部中关于鸦胆子的规定，本药材为苦木科植物鸦胆子Brucea javanica(L.)Merr的干燥成熟果实。

3结论

本品完全符合《中国药典》2005年版第一部中关于鸦胆子的规定。

以下所有实验研究所用鸦胆子均为通过本鉴定方法鉴定过的品种，即为：苦木科植物鸦胆子Brucea javanica(L.)Merr的干燥成熟果实。

鸦胆子抗人乳头瘤病毒的PCR检测方法的确立

目前，药效学研究方法，主要包括体内药效学和体外药效学实验，体内药效学实验主要是通过公认的动物模型实现。我们综合国内外的最新的研究进展发现，人是人乳头瘤病毒的唯一的自然宿主，尖锐湿疣尚无动物模型，无法进行体内药效学实验，FQ-PCR技术作为一种体外扩增特异核酸技术，已经广泛应用到临床检测以及科学研究领域，其具有高度敏感性、特异性、操作简便、快速等特点。

本实验对鸦胆子提取液进行提取、分离与纯化的同时，应用此技术对尖锐湿疣做体外药效学实验以追踪其抗HPV-DNA的有效物质。

1材料及与试剂

2实验方法

2.1尖锐湿疣疣体标本的准备

标本采集于广州中医药大学第二附属医院皮肤病性病专科门诊，收集发生于外阴部位的典型新鲜尖锐湿疣疣体标本。精确称其重量后，加入少量的生理盐水，匀浆器匀浆，制成疣体混悬液，用生理盐水将其稀释成不同的比例，分别提取HPV-DNA，用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)仪扩增HPV-DNA，根据扩增结果，选用HPV-DNA拷贝数为10⁶时的疣体混悬液作为疣体标本。

2.2药物的配制

本实验主要由体外药效学实验来追踪鸦胆子抗HPV-DNA的物质基础，因此药物的配置主要是脂溶性成分及水溶性成分，一是不溶于水，但加入乳化剂做成乳剂的药液；一是溶于水，以生理盐水为溶液的药液。该体外药效实验贯彻整个课题，因此具体的药物浓度见各药效结果的表格。

乳剂药液的配制：鸦胆子提取分离得到的脂溶性物质加入终浓度为1％的吐温-80，再以生理盐水溶解(若配制不同浓度则以含1％吐温-80的生理盐水稀释)，充分振荡均匀，必要时加热，使药液为乳白色的乳剂各50μL，配制三组备用。体外药效学PCR实验的具体工艺流程图见图1。

2.3药物与疣体的相互作用

2.3.1鸦胆子脂溶性物质与疣体的相互作用

取出乳剂药液一组，加入尖锐湿疣疣体标本50μL混匀，置于37℃的温育箱，期间经常摇匀，尽可能使药物与疣体组织充分作用，在温育的第1、3、5和7天分别取标本进行FQ-PCR检测。其它2组按照同样的方法操作。以含1％吐温-80的生理盐水做阴性对照。

2.2.4荧光定量PCR检测HPV-DNA含量

2.2.4.1HPV-DNA提取

按照人乳头瘤病毒HPV(6/11型)核酸扩增荧光检测试剂盒附带的HPV-DNA提取方法提取HPV-DNA：取出标本，轻微振荡混匀，13000转/min离心15min，弃上清液，再加入25μLDNA提取液2，充分混匀，100℃干浴10min，13000转/min离心10min，上清液即为HPV-DNA模板。

2.2.4.2定量标准曲线

按照试剂盒要求，设立4个系列浓度的HPV-DNA定量阳性标准品，依次为5×10⁷拷贝数/mL、5×10⁶拷贝数/mL、5×10⁵拷贝数/mL、5×10⁴拷贝数/mL，以起始拷贝数的自然对数为横坐标，循环阈值为纵坐标，得到回归直线见图2和标准曲线，据此对样品的拷贝数进行定量。

2.2.4.3HPV-DNA扩增

按照试剂盒操作说明，取检测试剂盒中的PCR反应液37.6μL，TaqDNA聚合酶0.4μL，UNG0.03μL于PCR反应管中，再加入HPV-DNA模板2μL，扣严管盖，置于定量FQ-PCR仪上循环扩增。HPV-DNA经高温变性、低温退火及中温延伸进行循环扩增，循环程序设置为：37℃，5min；94℃，1min；95℃，5s；60℃，30s，共作40个循环。反应体系设为20μL。

2.2.4.4结果分析条件设定

在荧光定量PCR技术中，实验结果根据CT值计算，C代表Cycle，T代表了Threshold，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的CT值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

根据试剂盒说明书，使用ABI7700荧光定量PCR仪进行结果分析时，基线(baseline)取为1-10或1-15个循环的荧光信号，阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。同时在扩增开始前或结束后设定内标标准品拷贝数。

3实验结果

当HPV-DNA的扩增结果为阳性(拷贝数的指数≥10³)时，得到标准的S型曲线见图(图3)；当表中HPV-DNA的扩增结果为阴性(拷贝数的指数＜10³时)，得到不规则的曲线见(图4)。当表中HPV-DNA的扩增结果为阴性(拷贝数的指数＜10³)时，说明药物能抑制HPV-DNA扩增；HPV-DNA的扩增结果为阳性(拷贝数的指数≥10³但＜10⁶)时，说明药物对HPV-DNA抑制作用与其指数的变化成反比，当HPV-DNA的拷贝数的指数愈大时，抑制作用愈小，即药物作用愈小；当HPV-DNA的拷贝数的指数愈小时，抑制作用愈大，即药物作用愈大。

鸦胆子油中的有效物质筛选

1方法

取鸦胆子脂溶性成分(鸦胆子油)加入石油醚稀释，再加入活性炭，水浴回流除去色素等，滤过，回收石油醚得无色鸦胆子脂溶性成分(鸦胆子油)，以95％乙醇萃取3～5次，得95％乙醇萃取物，约占总油量的15％。将鸦胆子脂溶性成分(鸦胆子油)乙醇萃取物及乙醇不溶物按照PCR体外药效实验方法进行检测。

取亚油酸的对照品按照PCR体外药效实验的方法，分别与CA混悬液作用1、3、5、7天后进行检测。

2结果

鸦胆子脂溶性成分(鸦胆子油)经脱色后的95％乙醇萃取物具有抗HPV-DNA的作用，95％乙醇不溶物则无效，见表2。同时亚油酸也具有HPV-DNA的作用，且亚油酸最低有效浓度为0.0045g/mL，具体的结果见表3。

表2鸦胆子脂溶性成分(鸦胆子油)95％乙醇萃取后的PCR检测结果

表3亚油酸PCR检测结果

3讨论

对鸦胆子系统提取时，以石油醚提取得到的鸦胆子脂溶性成分(鸦胆子油)通过PCR体外药效实验显示并没有明显抗HPV-DNA的作用，但经95％乙醇萃取后则有抗HPV-DNA的作用，考虑与鸦胆子脂溶性成分(鸦胆子油)中的活性成分含量过少，未进行富集处理，而不能达到有效浓度有关。

通过PCR体外药效实验发现，鸦胆子脂溶性成分(鸦胆子油)中的亚油酸具有抗HPV-DNA的作用。

正交实验优选鸦胆子油的提取工艺

根据前面对鸦胆子油中有效物质的筛选，亚油酸是鸦胆子油中两个抗HPV-DNA的活性成分。为了提高鸦胆子油中亚油酸的提取率，采用L₉(3⁴)正交实验优化鸦胆子油提取工艺。

1正交实验

根据预实验确定影响鸦胆子油提取的因素和水平，按照因素水平表和L₉(3⁴)正交表进行回流提取，HPLC法测定其中亚油酸的含量，以亚油酸的含量为标准，通过统计学计算，得出鸦胆子油的最佳提取工艺。

1.1实验仪器

1.2实验药材与试剂

1.3因素和水平的确定

根据预实验，确定影响鸦胆子油提取的因素和水平，影响因素为提取次数(A)、提取时间(B)、固液比(C)、误差(D)，各因素均分为3个水平，见表4和表5

表4因素水平表

表5正交实验表

1.4回流提取鸦胆子油

精确称取鸦胆子9份，每份20g，破碎果壳，按正交实验表安排实验，以70℃水浴加热挥尽石油醚至恒重。称重，结果见表6。

表6正交实验结果

2HPLC法测定鸦胆子油中亚油酸的含量

植物油中的脂肪酸的含量测定一般采用气相色谱法，但在分析过程中柱温很高(180℃)，易使化合物的双键断裂或产生双键的异构化现象。若用HPLC法进行分析，由于HPLC的检测器应用最多的是紫外检测器(UVD)，而鸦胆子油中亚油酸均属于脂肪酸，是长链烃类，在200～400nm没有最大吸收，无法直接用UVD进行检测，所以要采用柱前衍生化的方法，使脂肪酸带上一个强发色团，在200～400nm有最大吸收。

2.1色谱条件

色谱柱：waters symmetry柱(150mm×3.9mm，5μm)；流动相：甲醇-水(98∶2)；柱温：28.5℃；检测波长：242nm；体积流量：1.0mL/min；进样量：10μL。

2.2供试品溶液的制备

精密称取鸦胆子油32mg，置于5mL量瓶中，丙酮溶解并定容至刻度，摇匀。

衍生化反应：用微量取样器精密量取50μL上述溶液，置于10mL具塞离心管中，精密加入内标溶液50μL，摇匀后N₂吹干。加氢氧化钾-甲醇溶液(0.5mol/L，0.4mL)漩涡振摇1min，于60℃水浴加热30min，冷却至室温后加异丙醇-正庚烷-冰醋酸溶液(40∶10∶1)2.5mL，漩涡振摇1min，间断超声2min(间断30s，强度500W)，室温下放置10min。再精密加入正庚烷1mL，双蒸水1.5mL，漩涡振摇1min，间断超声2min(间断30s，强度500W)，离心(2500r/min)10min后精密吸取上清液1mL，精密加入内标溶液50μL，N2吹干。精密加入20mg/mLω-溴代苯乙酮和25mg/mL三乙醇胺丙酮溶液各50μL，乙腈300μL，试管加塞密封，混合摇匀，于100℃加热15min，冷却至室温后，精密加入10mg/mL醋酸溶液75μL，于100℃加热5min，N₂吹干，备用。

2.3标准曲线的绘制

对照品溶液的制备：分别精密称取十七烷酸对照品各20mg，亚油酸10mg，置于10mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。

精密量取对照品溶液各10、25、50、75、100、150、200、300μL，置于5mL具塞离心管中，分别精密加入内标溶液50μL，N₂吹干。精密加入20mg/mLω-溴代苯乙酮和25mg/mL三乙醇胺丙酮溶液各50μL，乙腈300μL，试管加塞密封，混合摇匀，于100℃加热15min，冷却至室温后，精密加入10mg/mL醋酸溶液75μL，于100℃加热5min，N₂吹干。精密加入甲醇500μL，振摇1min，0.45μm滤膜过滤，取滤液于样品瓶中，以10μL进样，记录色谱图。以质量浓度C和对应的峰面积比Y计算回归方程见表7(n＝7)。亚油酸回归曲线见图5。

表7标准曲线

2.4专一性实验

精密吸取鸦胆子油溶液100μL按照供试品测定方法进行操作，对照品溶液、甲醇各100μL，分别按照标准曲线的制备方法进行操作，即得鸦胆子油、对照品的衍生化产物及空白溶液，在上述色谱条件下进样，记录色谱图。可见在空白中亚油酸、十七烷酸处均无干扰，并且在鸦胆子油色谱中内标无干扰。

2.5精密度实验

精密吸取亚油酸对照品溶液100μL，按照标准曲线的制备进行操作，在上述色谱条件下重复进样5次，记录峰面积，由回归曲线计算亚油酸的质量浓度，结果见表8。表明仪器精密度良好。

表8精密度考察结果

2.6重复性实验

按照供试品测定项下方法进行平行操作，制备5份样品，在上述色谱条件下进样，记录峰面积，由回归曲线计算亚油酸的质量浓度，结果见表9。表明方法重复性良好。

表9重复性考察结果

2.7稳定性实验

按照供试品测定项下方法进行操作制备1份样品，在上述色谱条件下，分别在制备0、2、6、20、22、24h进样，记录峰面积，由回归曲线计算亚油酸的质量浓度，结果见表10。表明供试品溶液在24h内稳定。

表10稳定性考察结果

2.8加样回收率实验

精密称取已知亚油酸含量的鸦胆子油，分别加入亚油酸对照品溶液适量，按供试品测定项下方法测定，结果见表11。

表11亚油酸加样回收率实验结果(n＝5)

2.9样品测定

取正交实验提取的9份鸦胆子油按供试品测定项下方法测定。由回归方程计算亚油酸的质量浓度，并由此浓度计算出20g鸦胆子中所含亚油酸的重量，结果见正交实验结果表。

3实验结果及分析

根据正交实验结果表12的极差R值直观分析结果可以看出，3个因素对亚油酸的含量的影响均为C(固液比)＞A(提取次数)＞B(提取时间)。考虑到实际生产效率和成本，所以有必要对各因素水平的显著性进行方差分析，数据由SPSS软件处理，结果分别见表12及13。

表12正交实验结果

表13亚油酸方差分析表

从以上两表可以看出，最佳的提取条件是C₂A₂B₃，即提取的固液比是1∶5，提取次数是2次，提取时间是1小时，方差分析可以看出提取的固液比(P＜0.05)，是影响鸦胆子油提取工艺的显著因素。

4验证实验

按上述最佳提取工艺条件提取鸦胆子油，分别提取了3批样品，精密称重，再按照供试品测定项下方法测定，进样10μL，测定计算结果见表14。

表14鸦胆子油中亚油酸的测定结果(n＝3)

由表14可知，按正交实验所优选而得的最佳工艺进行提取实验，鸦胆子油中亚油酸的含量处于较高水平，且重现性较好。

亚油酸对成纤维细胞、Hecat细胞的增殖影响的作用及人正常包皮表皮细胞的培养1亚油酸对成纤维细胞的增殖影响作用的研究

HPV主要感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，而构成皮肤表皮和真皮的分别是角质形成细胞和成纤维细胞。成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。本实验以真皮取材分离培养成纤维细胞，以MTT比色测定的方法考察不同浓度的亚油酸对成纤维细胞增殖生长的影响。

1.1试剂与仪器

RPMI 1640培养基(20090612GIBCO公司)，加10％灭活的胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、青霉素100U/ml、链霉素100μg/L，谷氨酰胺2mmol/L配成完全培养液；四氮甲基唑蓝(MTT，20090316 Sigma公司)；0.2μm过滤器(GIBCO公司)、96孔板(GIBCO公司)；多功能分析仪(VICTOR.×5)，美国Froma Scientific CO₂无菌培养箱。

1.2药物

亚油酸(购自Sigma公司)以含1％二甲基亚砜(DMSO)的1640培养基配成不同浓度的乳剂药液0.2μm过滤器过滤后备用。

1.3方法

1.3.1成纤维细胞的原代、传代培养

健康男性包皮环切术后，取包皮组织，完全培养液反复冲洗，剪碎：1mm×1mm，按0.5cm间隔置T25的无菌培养瓶中，固定翻转培养瓶，使有组织小块的一面向上，加入完全培养液1.5mL并保持培养液与组织小块不接触，拧紧瓶塞，置37℃、5％CO₂培养箱中，静置3～4h后，轻轻翻转，使培养液与组织小块接触，每2天换液1次，14d后待细胞贴满瓶底后即传代培养，如此培养至第3代。

1.3.2药液作用细胞

取第3代的对数生长期的成纤维细胞，经0.25％胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，计数板计数后加入新鲜的1640完全培养液调整细胞密度为1×10⁵/mL，向96孔培养板每孔加入100μL细胞悬液，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞贴壁后弃培养液。实验组加入不同浓度备用的亚油酸药液每孔100μL，设立0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125g/mL6个浓度组；对照组仅加入100μL含1％DMSO的1640培养基；调零组为等量1％DMSO的1640培养基，不含细胞及药物。每组设4个复孔。

1.3.3MTT比色法检测

培养48h后吸弃含药液的培养液，每孔加入新鲜的1640完全培养液100μL，再加入0.5％MTT20μL/孔，继续培养4h，弃上清液，每孔加入二甲亚砜150μL，振荡10min摇匀，酶标仪测定各孔于570nm波长处的吸光度值A(OD值)。

1.4结果

1.4.1培养的人成纤维细胞形态学观察

人成纤维细胞为贴壁依赖型细胞，其倍增时间较短，一般3～4天即可传代1次。培养的人成纤维细胞经体外传代3次后，倒置显微镜下观察，细胞胞体透明，结构清晰，呈梭形，有分支状突起，细胞呈放射状或漩涡状生长，具有典型的成纤维细胞特征。

1.4.2亚油酸对人成纤维细胞生长的影响

分别以不同浓度的亚油酸作用于成纤维细胞2天后，用MTT比色法测定细胞活性，以不加药物的含1％DMSO的1640培养基作为对照组，结果显示二者均对人成纤维细胞的生长有抑制作用。具体结果见表15和图6。

表15MTT法亚油酸对成纤维细胞的增殖影响作用

由表15及图6可以看出，亚油酸对人成纤维细胞的增殖有抑制作用的趋势。

根据前面PCR体外抗HPV的药效实验结果，药物浓度围绕最低有效浓度进行配制。结果表明随亚油酸浓度的增大，其抑制成纤维细胞增殖作用的趋势增强，且与PCR体外药效实验结果一致。

2亚油酸对Hacat细胞的增殖影响作用的研究

人角质形成细胞(Hacat)是表皮细胞的主要组成部分，其增殖、分化维系着表皮正常结构和生理功能。角质形成细胞的凋亡对表皮平衡和损伤细胞的更新时关键环节，它的紊乱已是多种皮肤疾病的症兆，其中也包括皮肤的过度增殖失调。人表皮角质形成细胞是HPV感染的天然靶细胞，HPV的复制，高度依赖于皮肤上角质细胞的分化。本实验以MTT比色测定的方法考察不同浓度的亚油酸对Hacat细胞增殖作用的影响。

2.1试剂与仪器

RPMI 1640培养基(20090612GIBCO公司)，加10％灭活的胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、青霉素100U/ml、链霉素100μg/L，谷氨酰胺2mmol/L配成完全培养液；四氮甲基唑蓝(MTT，20090316 Sigma公司)；人角质形成细胞株(HaCaT)；0.2μm过滤器(GIBCO公司)、96孔板(GIBCO公司)；多功能分析仪(VICTOR.×5)，美国Froma Scientific CO₂无菌培养箱。

2.2药物

亚油酸以含1％二甲基亚砜(DMSO)的1640培养基配成不同浓度的乳剂药液以0.2μm过滤器过滤后备用。

2.3方法

2.3.1药液作用细胞

取第4代对数生长期的hacat细胞，经0.25％胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，计数板计数后加入新鲜的1640完全培养液调整细胞密度为1×10⁵/mL，向96孔培养板每孔加入100μL细胞悬液，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞贴壁后弃培养液。实验组加入不同浓度备用的亚油酸药液每孔100μL，设立0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125g/mL6个浓度组；对照组仅加入100μL含1％DMSO的1640培养基；调零组为等量1％DMSO的1640培养基，不含细胞及药物。每组设4个复孔。

2.3.3MTT比色法检测

培养48h后，吸弃培养液；另外分别培养24、72h后弃培养液，每孔加入新鲜的1640完全培养液100μL，再加入0.5％MTT 20μL/孔，继续培养4h，弃上清液，每孔加入二甲亚砜150μL，振荡10min摇匀，酶标仪测定各孔于570nm波长处的吸光度值A(OD值)。

2.4结果

2.4.1培养的Hacat细胞形态学观察

Hacat细胞亦为贴壁细胞，但其增长较慢，所需倍增时间较长，一般5～7天传一代。细胞呈圆形，随时间延长，细胞伸展成椭圆形，体积变大。细胞渐聚集形成细胞集落，并以此为中心逐渐向外扩增，逐渐延伸形成单层细胞。当细胞完全融合成片状，形态呈扁平不规则多边形，状似铺路石，核为卵圆形。此时即可进行传代培养。

2.4.2不同浓度亚油酸对Hacat细胞生长的影响

分别以不同浓度的亚油酸作用于Hacat细胞2天后，用MTT比色法测定细胞活性，以不加药物的含1％DMSO的1640培养基作为对照组，结果显示二者均对Hacat细胞的生长有抑制作用的趋势。具体结果见表16和图7。

表16MTT法亚油酸对Hacat细胞的增殖影响作用

由表16及图7可以看出，亚油酸对Hacat细胞的生长增殖也有抑制作用的趋势。

2.4.3亚油酸不同作用时间对Hacat细胞生长的影响

分别以不同浓度的亚油酸分别作用于Hacat细胞1、2及3天后，用MTT比色法测定细胞活性，以不加药物的含1％DMSO的1640培养基作为对照组，结果显示随作用时间的增加，二者对Hacat细胞生长的抑制作用有增强的趋势。具体结果见表17和图8。

表17MTT法亚油酸对Hacat细胞不同作用时间增殖影响

由表17及图8可以看出，亚油酸随作用时间的增加，抑制Hacat细胞的增殖生长的趋势也有增大。

2.5讨论

人表皮角质形成细胞是HPV感染的天然靶细胞，HPV的复制，高度依赖于皮肤上角质细胞的分化。从以上实验结果可以看出亚油酸对Hacat细胞增殖有抑制作用的趋势，且随药物的作用时间延长，抑制的趋势增大。表明亚油酸可以通过对人角质形成细胞的增殖抑制作用而抑制HPV-DNA的复制，从而起到治疗CA的作用。

五、结语

本实验以苦木科植物鸦胆子Brucea javanica(L.)Merr的干燥成熟果实为药材，通过PCR体外药效实验追踪到抗HPV的有效物质，实验发现鸦胆子脂溶性成分(鸦胆子油)中亚油酸具有HPV-DNA的作用，且对成纤维细胞及人角质形成细胞的增殖均有抑制作用的趋势，PCR体外药效实验结果显示其最低有效浓度为0.0045g/mL。这些发现初步明确了鸦胆子治疗尖锐湿疣的物质基础，为尖锐湿疣的临床新药开发提供了基本资料。

本发明中，亚油酸可以根据需要加入药物可接受的载体制成药物制剂。

本发明所述的制剂，是单位剂量的药物制剂形式，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋等。

本发明所述的制剂其中的亚油酸，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9％，其余为药物可接受的载体。

本发明所述的制剂，通过将亚油酸和药物可接受的载体混合制备得到。

本发明亚油酸，其药物制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是注射剂，更优选的是冻干粉针。

本发明亚油酸，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

本发明中的亚油酸，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：葡甲胺、甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量。

Claims (9)

1.亚油酸作为唯一活性成分在制备抗HPV药物中的应用。

2.亚油酸作为唯一活性成分在制备预防或治疗HPV相关疾病的药物中的应用。

3.如权利要求2的应用，其中亚油酸是通过抑制角质形成细胞增殖来预防或治疗HPV相关疾病的。

4.如权利要求2的应用，其中亚油酸是通过抑制成纤维细胞增殖来预防或治疗HPV相关疾病的。

5.如权利要求2的应用，其中所述的HPV相关疾病是子宫颈癌。

6.如权利要求2的应用，其中所述的HPV相关疾病是子宫颈癌以外的其它生殖器癌。

7.如权利要求2的应用，其中所述的HPV相关疾病是肛门癌。

8.如权利要求2的应用，其中所述的HPV相关疾病是生殖器疣。

9.如权利要求1-8的应用，其中所述的亚油酸是重量百分含量为0.45％～99.9％的亚油酸溶液。

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