CN107635997A - 香豆素衍生物作为抗病毒剂，及其药物组合物、制备方法和用途 - Google Patents

香豆素衍生物作为抗病毒剂，及其药物组合物、制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种新的香豆素衍生物7,9‑二羟基‑3‑(4,5,7‑三羟基‑2‑氧代‑2H‑苯并吡喃‑3‑基)‑4H‑呋喃并[3,2‑c]苯并吡喃‑4‑酮(1)，其合成方法，药物组合物，及其制备方法和用途。该药物组合物包括：(1)作为活性药物成分的7,9‑二羟基‑3‑(4,5,7‑三羟基‑2‑氧代‑2H‑苯并吡喃‑3‑基)‑4H‑呋喃并[3,2‑c]苯并吡喃‑4‑酮(1)；以及(2)一种或多种药物赋形剂，其需要产生适于治疗性给药的最终剂型。该组合物是用于包括获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病毒性疾病的安全、有效的治疗剂。

Description

香豆素衍生物作为抗病毒剂，及其药物组合物、制备方法和 用途
技术领域
本发明涉及一种新的、抗病毒的香豆素衍生物7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)，其合成方法，基于1的新的药物组合物，及其制备方法和用途。
技术问题
技术问题是关于安全有效的疗法，用于治疗病毒性感染和各种各样病毒引起的疾病，包括由1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，在更有效的活性药物成分(API)的基础上进行有效的药物治疗。
本发明所要解决的技术问题是基于新的化合物1及其用途，及不同的药物最终剂型，包括HIV-1的病毒引起的疾病的治疗。
背景技术
众所周知，香豆素衍生物是具有不同药理活性的很多有用的化合物的组合，例如参见参考文件1：
1)F.Borges,F.Roleira,N.Milhazes,L.Santana,E.Uriarte:Simple Coumarinsand Analogues in Medicinal Chemistry:Occurence,Synthesis and BiologicalActivity,Curr.Med.Chem.12(2005)887-916.
4-羟基香豆素与醛进行羟醛缩合反应，在起始4-羟基香豆素的3-位产生相应的母体醛的1-羟烷基衍生物。对这种类型的缩合产物，已经从合成和药理学观点进行了研究。
下列的参考文献公开了本发明的现有技术：
2)M.Mercep,M.Mesic,B.Hrvacic,I.J.Elenkov,I.Malnar,S.Markovic,L.Simicic,A.Cempuh Klonkay:Substituted furochromenes,preparation thereof andtheir anti-inflammatory action,WO2005/010007A1,Pliva–Istrazivacki institutd.o.o.；
3)M.Mercep,M.Mesic,B.Hrvacic,I.J.Elenkov,I.Malnar:Furochromenederivative with anti-inflammatory activity,WO2005/095411A1,Pliva–Istrazivackiinstitut d.o.o.；
4)Z.Ivezic:[Synthesis of novel hydroxycoumarin derivatives aspossible HIV-1protease inhibitors(in Croatian)]Ph.D.Thesis(2000)Pliva Inc.,Zagreb,Croatia；Faculty of Science,University of Zagreb,Croatia.
在普利瓦研究院有限公司(Pliva-Istrazivacki institut d.o.o.)的WO2005/010007A1中，Mercep和他的合作者公开了不同的4-羟基香豆素与乙二醛的缩合产物，生成几种具有抗炎活性的通式I的化合物。此外，在另一申请中，Mercep和他的合作者还描述了2,7,9-三羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-2,3-二氢-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(II)，并报道了它的抗炎活性：
除此之外，Ivezic公开了4-羟基香豆素与不同的二醛生成的几种4-香豆素衍生物III，以及通式Ⅳ相应双缩合产物的烷氧基衍生物。测试后者的抗病毒活性，包括抗HIV活性：
对于药物化学领域的技术人员显而易见的是，化合物I-IV与本发明的化合物1没有太多的联系。最相似的化合物是II和IV，它们是化合物1最接近的衍生物，但是化合物II和通式IV的化合物可以与各种酶活性位点建立更多的相互作用，例如，在相同的情况下，比化合物1多出至少一个氢键；II由于2-羟基-呋喃部分的氢原子而为氢键供体，IV由于2-烷氧基-呋喃部分的氧原子的质子接受电位而为氢键受体。
因此，从药物化学和药理学的观点来看，已知化合物II或IV与本发明化合物1之间存在明显的结构差异。
此外，Kostova描述了几种具有抗HIV活性的替代香豆素衍生物，参见参考文献5：
5)I.Kostova:Coumarins as Inhibitors of HIV Reverse Transcriptase,Curr.HIV Res.4(2006)347-363.
然而，这些香豆素都不是本发明化合物1的结构类似物。
最接近的现有技术
本发明最接近的现有技术似乎是在Z.Ivezic和M.Trkovnik的专利申请中公开，其中报道了7,8-二羟基-3-(4,6,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(2)以及它的抗病毒活性，参见参考文献6：
6)Z.Ivezic,M.Trkovnik:Products of condensations of hydroxycoumarinderivatives with aromatic and aliphatic dialdehydes,their preparation andantiviral action thereof,WO 03/029237 A1,Pliva d.d.,Zagreb,Croatia.
上述化合物2在本文中用作对照化合物。
据我们所知，香豆素衍生物7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)是在我们实验室合成的，其各种药物最终剂型和作为用于治疗病毒或特别是免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染的治疗剂的药理学活性尚未以专利或非专利文献的形式公开。
发明概述
本发明公开了新的香豆素衍生物7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)，其合成方法，基于化合物1的药物组合物，其制备方法和用途。
在另一实施方案中，本发明公开了该药物组合物包括：(1)7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)，或其药学上可接受的盐或水合物作为活性药物成分；以及(2)一种或多种药物赋形剂，其需要产生适于治疗性给药的最终剂型。
该组合物是用于包括获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病毒引起的疾病的安全、有效的治疗剂。
详细说明
本发明公开了新的香豆素衍生物7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)，其合成，药物组合物，制备方法及其用途。
基于新化合物1，本发明公开了药物组合物，其包括：
(1)7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)，或其药学上可接受的盐或水合物作为活性药物成分；以及
(2)一种或多种药物赋形剂，其需要产生适于治疗性给药的最终剂型。
该组合物是用于病毒性感染和病毒引起疾病的安全、有效的治疗剂，包括由人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)，2型(HIV-2)及其亚型引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
本发明的组合物可以通过使用方式选择不同的最终剂型，包括以下形式：(1)口服：片剂，胶囊剂，颗粒剂，粉剂，分散粉剂，泡腾片剂，口服溶液，口服悬浮剂，糖浆剂，锭剂，口香糖；
(2)外用：软膏，霜剂，凝胶，搽剂，洗剂，泥敷剂，治疗贴剂；
(3)注射：注射液；
(4)阴道：灌洗溶液，凝胶，片剂，阴道栓剂；
(5)直肠：直肠栓剂；
(6)眼部：滴眼剂，眼药膏，洗眼剂；
(7)鼻腔：滴鼻剂，鼻喷剂，鼻软膏，鼻洗剂；
(8)耳部：滴耳剂和
(9)吸入：喷雾溶液或悬浮液；以及所有其它常用的药物最终剂型，因为化合物1可以容易地以许多不同的剂型配制。
制备如上所述最终剂型所需的药物赋形剂是选自以下的一种或多种物质：
(1)填料；用于固体剂型如片剂，胶囊剂，粉剂，栓剂等；
(2)稀释剂；用于液体剂型如糖浆，搽剂，洗剂，滴鼻剂，滴眼剂等；
(3)润肤剂；用于局部剂型如乳膏，软膏等；
(4)乳化剂；
(5)粘合剂；
(6)崩解剂；
(7)润滑剂；
(8)润湿剂；
(9)增稠剂；
(10)螯合剂；
(11)防腐剂；这个可以选择性地使用，这取决于包装上使用的容器封闭系统；
(12)抗氧化剂；以及通常用于制药技术的所有其他类型的赋形剂。
填料选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：微晶纤维素，乳糖，蔗糖，菊糖，甘露糖醇，山梨糖醇，麦芽糖醇，木糖醇，糊精，麦芽糖糊精，淀粉，碳酸钙，这些物质的混合物，或其它药学上可接受的填料。
剂型如栓剂的填充剂选自包括以下物质组成的组：甘油；肥皂如硬脂酸钠；氢化椰子油，如合成脂肪酸酯H15(Witepsol H15)；椰子油；天然蜡如蜂蜡或小烛树蜡；矿石蜡如石蜡；合成蜡如蓖麻蜡或固体聚乙二醇(PEG)；这些物质的混合物，或其它药学上可接受的填料。
稀释剂选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：纯化水；乙醇；药用酒；1,2-丙二醇；甘油；聚乙二醇(PEG)如PEG400；植物油如向日葵油，芝麻油或中链甘油三酯；这些物质的相互混溶或可乳化的混合物，或其它药学上可接受的稀释剂。
在本发明的组合物中用作稀释剂的纯化水符合欧洲药典8.0，第3561-3562页对药用水的要求。
润肤剂选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：石油膏；矿物油；植物油如杏仁油，向日葵油或芝麻油；中链甘油三酯；具有高级脂肪酸的一价醇的天然或合成酯如肉豆蔻酸异丙酯，霍霍巴油或蜂蜡；硅油；高级脂肪酸如硬脂酸；高级脂肪醇如鲸蜡醇；这些物质的混合物，或其它药学上可接受的润肤剂。
乳化剂选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：羊毛脂；乙氧基化羊毛脂；羊毛脂醇；乙氧基化羊毛脂醇；卵磷脂；氢化卵磷脂；具有高级脂肪酸的甘油的单酯和二酯如单硬脂酸甘油酯；具有高级脂肪酸的脱水山梨糖醇酯如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；乙氧基化高级脂肪醇或酸如聚氧乙烯(23)月桂基醚或聚氧乙烯(2)油酸酯，其中数字23和2表示乙二醇的单元数；乙氧基化脱水山梨糖醇酯如聚山梨醇酯60；水溶性肥皂如硬脂酸钠；这些物质的混合物，或其它药学上可接受的乳化剂。
粘合剂选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：葡萄糖浆；葡萄糖-果糖糖浆；蜂蜜；蔗糖；乳糖；明胶；山梨糖醇；麦芽糖醇；木糖醇；纤维素胶如羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基纤维素(HPC)，羟乙基纤维素(HEC)，甲基纤维素(MC)，羧甲基纤维素钠(NaCMC)；合成聚合物如聚乙烯醇(PVA)，聚丙烯酸(PAA)及其共聚物，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；透明质酸；各种胶如阿拉伯树胶，黄原胶，黄蓍胶；海藻酸及其盐类如海藻酸钠；这些物质的混合物，或其它药学上可接受的粘合剂。
崩解剂选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：交联聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；羟基乙酸淀粉钠；交联羧甲基纤维素钠(NaCMC)；变性淀粉；这些物质的混合物，或其它药学上可接受的崩解剂。
润滑剂选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：镁，钙，铝和锌皂，例如硬脂酸镁；高级脂肪酸如硬脂酸；滑石；胶体氧化硅(二氧化硅)；这些物质的混合物，或其它药学上可接受的润滑剂。
在眼药基最终剂型中，润滑剂选自包括以下物质组成的组：羟丙基甲基纤维素(HPMC)；羟丙基纤维素(HPC)；羟乙基纤维素(HEC)；甲基纤维素(MC)；羧甲基纤维素钠(NaCMC)；聚乙烯醇(PVA)；聚丙烯酸(PAA)及其共聚物；透明质酸；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；甘油；1,2-丙二醇；海藻糖；聚乙二醇(PEG)如PEG 400；这些物质的混合物，或其它药学上可接受的眼药润滑剂。
润湿剂选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：甘油；1,2-丙二醇；己二醇；液体山梨糖醇；d-泛醇；聚乙二醇；其他公知的药学上可接受的润湿剂，或它们的混合物。
增稠剂选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：纤维素胶如羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基纤维素(HPC)，羟乙基纤维素(HEC)，甲基纤维素(MC)，羧甲基纤维素钠(NaCMC)；合成聚合物如聚乙烯醇(PVA)，聚丙烯酸(PAA)及其共聚物，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；各种胶如阿拉伯树胶，黄原胶，黄蓍胶；海藻酸及其盐类，如海藻酸钠；这些物质的混合物，或其它药学上可接受的增稠剂。
螯合剂选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：乙二氨基四乙酸(乙二胺四乙酸)(EDTA)的钠盐或钾盐；二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；次氮基三乙酸(NTA)；水溶性柠檬酸盐如柠檬酸三钠二水合物；这些物质的混合物或其它药学上可接受的螯合剂。这种螯合剂的代表性例子是乙二胺四乙酸二钠二水合物(Na2EDTA·2H2O)。
防腐剂选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：对羟基苯甲酸酯类，如4-羟基苯甲酸甲酯，4-羟基苯甲酸乙酯，4-羟基苯甲酸丙酯，4-羟基苯甲酸丁酯；4-氯代-间-甲酚；三氯生；三氯叔丁醇；氯己定及其盐类；季铵盐如苯扎氯铵或溴化十六烷基铵；苯甲酸；山梨酸；苯甲醇；2-苯氧基乙醇；脱氢乙酸(3-乙酰基-2-羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮)；这些物质的混合物，或其它药学上可接受的防腐剂。
抗氧化剂选自包括以下物质组成的组中的一种或多种物质：抗坏血酸，其盐和酯如抗坏血酸钙或抗坏血酸棕榈酸酯；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)；叔丁基苯甲醚(BHA)；没食子酸丙酯；α-生育酚及其酯类，如α-生育酚乙酸酯；迷迭香(Rosmarinusofficinalis)提取物；这些物质的混合物，或其它药学上可接受的抗氧化剂。
7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c] 苯并吡喃-4-酮(1)的合成
化合物1的合成，在作为催化剂的气态氯化氢(HCl)和作为反应溶剂的回流乙醚的存在下，通过间苯三酚(3)和氰基乙酸(4)的Pechmann缩合反应进行(步骤I)。
由此获得的中间体酮酰亚胺5在反应混合物反应之后进行分离，并通过在含有4,5,7-三羟基-2H-苯并吡喃-2-酮(6)的浓盐酸(HCl)中回流水解(步骤II)。此外，化合物6为市售品。
香豆素衍生物6在回流的丙酮(75℃)中与乙二醛(7)缩合，得到醛醇型缩合的化合物1(步骤III)。
步骤III中化合物1的制备也可以选择在-20℃至+100℃之间的温度下进行，例如，在回流的1,4-二恶烷中。
或者，中间体香豆素6(步骤I和II)和化合物1(步骤III)的合成可以用有机和药物化学领域技术人员已知的其它质子酸或路易斯酸进行。
此外，代替这些反应溶剂：在Pechmann缩合的I反应步骤中的二乙醚；以及醛醇型缩合的III反应步骤中的丙酮；也可以使用其它惰性有机溶剂如四氢呋喃(THF)，1,4-二恶烷，二异丙醚，二氯甲烷。
化合物1的合成示于方案1中。
方案1
化合物1的合成方法及中间体6和最终化合物1的表征数据在实施例1进行了描述。其定性(TLC)，定量(HPLC)，检测和质谱(MS)分析的分析方法在实施例2进行了描述。
由于所述化合物1的游离酚OH基作为酸，因此可以与药学上可接受的无毒碱制备相应的盐。由于最终提高了水溶性，所以这些盐相对于游离酸1具有一定的优势。
可用于制备化合物1的各种药学上可接受的盐的有用碱的例子：氢氧化钠(NaOH)，氢氧化钾(KOH)，氢氧化钙[Ca(OH)2]，氢氧化镁[Mg(OH)2]，氢氧化铵(NH4OH)，四甲基/氢氧化乙基铵[R4N+OH-；R＝CH3，C2H5]，氢氧化胆碱[(CH3)3N(CH2CH2OH)OH]，其它药学上可接受的碱，或这些物质以各种摩尔比的混合物。
化合物1的这些药学上可接受的盐可以通过1与上述碱在惰性反应溶剂中，-20℃至+100℃温度范围内反应来制备，惰性反应溶剂如纯水，甲醇，乙醇，异丙醇，其它惰性有机溶剂或这些物质的混合物。
由此获得的形成的盐的溶液或悬浮液通过结晶，蒸发至干，或通过冷冻干燥或药物化学领域已知的其它常规技术转化为纯无水的或溶剂化的或水合的盐。
通常，这些盐形成各种溶剂化物或水合物，其可以替代性地用作本发明组合物的活性药物成分(API)。
制备化合物1的药学上可接受的代表性单钠盐的方法在实施例3中描述。
本发明中组合物的制备
本发明的组合物包括如上所述的所有药学上可用的最终剂型。
制备各种最终剂型的技术是制药技术领域的技术人员已知的，参见例如参考文献7：
7)J.Swarbrick,J.C.Boylan:Encyclopedia of pharmaceutical technology；New York,M.Dekker(1998-2001).
粉末的最终剂型通过均化粉末状的成分7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)制成，其可用作活性药物成分(API)，与一种或多种粉末赋形剂一起作用，所述粉末赋形剂选自包括填料，润滑剂和任选的其它药物赋形剂组成的组。
可以通过使用一种或多种合适的稀释剂和粘合剂将得到的粉末制造成颗粒状，得到颗粒剂型。用于湿法制粒工艺的稀释剂，例如纯水，可基于适量使用原则(quantum satis(q.s.))被应用。
可以将粉末和颗粒压实以得到片剂的最终剂型，或者填充到明胶或各种植物胶囊中提供胶囊的最终剂型。
通过将化合物1溶解在合适的稀释剂如纯化水或纯化水与保湿剂和增稠剂的混合物中来制备液体剂型，例如口服溶液，悬浮液或糖浆。主要成分为水的液体制剂必须通过添加合适的防腐剂来进行保护，以防止微生物引起的腐败。
通过将细粉末化合物1均化成亲水性或亲油性软膏基质制备软膏的外用剂型。例如前者是固体和液体聚乙二醇(PEG)的混合物，而后者是蜡，植物油，羊毛脂等的各种混合物。
油包水(W-O)或水包油(O-W)乳剂的乳膏和洗剂通过在相应的基础乳剂中均化化合物1来制备。
在所有提及的和其它可能的最终剂型中，本发明的组合物可以有许多其它的制备技术，这是制药技术领域的技术人员已知的。
为了进行说明，本发明组合物的典型最终剂型在实施例8-15中给出。
通过测定最大无毒浓度(MNC)和细胞毒性浓度(CC50)进行7,9-二羟基-3-(4,5,7- 三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的细胞毒性研 究，并与文献类似物2比较
通过检测最大无毒浓度(MNC)和50％细胞活力所需浓度(CC50)的方法研究细胞的生长和活力，进而测定化合物1的细胞毒性。最大无毒浓度(MNC)定义为不会导致被处理细胞的损伤或死亡的被检测物质最高浓度。50％细胞毒性浓度(CC50)定义为由于受试物质毒性而导致50％细胞死亡的被检物质的浓度。
细胞毒性的评估是化合物1的抗病毒活性评估的重要部分，因为其有益的抗病毒效果应该对病毒特异性进程具有选择性，对宿主细胞的代谢几乎没有或没有影响。该研究用参考文献6中描述的7,8-二羟基-3-(4,6,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(2)作为对照化合物。
化合物1和2的细胞毒性研究在MT-4细胞系中进行。
MT-4细胞系没有感染人类免疫缺陷病毒(HIV)，并被用作HIV-1急性感染复制的经典模型，用于研究各种假定的HIV-1抑制剂的作用，通过细胞病变效应滴定病毒感染力；参见参考文献8：
8)D.Montefiori,E.Robinson,Jr.Shirley,S.Schuffman,W.Mitchell:Evolutionof antiviral drugs and neutralizing antibodies by rapid and sensitivemicrotiter infection assay,J.Clin.Microbiol.26(1998)231-235.
通过修饰3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)测定来估计细胞活力，其在参考文献9中进行了描述：
9)T.Mosmann:Rapid colorimetric assay for cellular growth andsurvival:Application to proliferation and cytotoxicity assays,J.Immunol.Methods 65(1983)55-63.
细胞活力是通过不同浓度试验化合物1处理得到的孔中活细胞数与未用该物质处理的对照组细胞数的百分比(％)来显示的。从构建的“剂量-细胞存活”曲线计算得到最大无毒浓度(MNC)和50％细胞毒性浓度(CC50)。
MNC和CC50值是通过形态学和细胞存活条件共同评价的。我们使用MTT实验，测定存活的和早期凋亡的细胞。在用浓度范围为10mM至0.01mM的试验化合物1和对照化合物2溶液处理72小时后，对单层细胞的形态进行显微观察，以毒性作用为特征的典型的细胞病理学并无记录。只有在最高浓度为100mM的处理孔中，我们发现与对照组细胞相比细胞系有一些形态学变化，其影响可能是由所用稀释剂(DMSO)造成的。
为了评估这种影响是由被测物质1、对照化合物2还是DMSO的毒性所致，测试了补充有2％FBS和DMSO的生长培养基RPMI 1640的对照组。我们进行了与试验化合物1和对照化合物2相同浓度范围的测试。结果表明，DMSO在较低稀释度下的毒性非常小，对两种细胞系均没有毒性作用。
化合物1在MT-4模式细胞系活力方面的细胞毒活性可以从培养72h后获得的剂量-反应曲线看出，见图1。对照化合物2在MT-4模式细胞系活力方面的细胞毒活性可以从培养72h后获得的剂量-反应曲线看出，见图2。
化合物1和2在细胞系中获得的MNC和CC50的结果在表1中给出。化合物1和2的细胞毒性测定的详细实验步骤在实施例4中给出。
表1.7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)和对照化合物2在MT-4细胞培养72小时的细胞毒性作用。
aMNC＝最大无毒浓度(MNC)。
bCC50＝50％细胞毒性浓度(CC50)。
综上所述，结果表明化合物1和对照化合物2对MT-4细胞系表现出低的且实际上相同的细胞毒性。这些结果是剂量依赖性的。
我们得出结论，这些结果强有力地支持化合物1基本上无毒的初步假说，因此可以安全地用作药物活性物质(API)。当然，必须进行进一步的毒理学研究，但这显然对于证明本发明的新颖性和创造性而言并不重要。
7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c] 苯并吡喃-4-酮(1)的抗病毒活性研究，并与文献类似物2比较
化合物1和对照化合物2的抗病毒活性的第一项研究，是通过细胞培养中的微量滴定感染测定法和化合物1或2的浓度评估实验(50％抑制病毒复制的浓度(IC50)以及选择性指数(SI))，研究它们对人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)复制的影响。
本研究中所用的细胞系也是如上所述的MT-4细胞系。
文献中介绍了基于对病毒的细胞病变效应的考虑，进行的细胞培养中感染性微孔板检测实验，参见参考文献8。至少使用4种不同浓度：10xMNC，MNC，MNC-1，MNC-2和MNC-3。MNC的值在表1中给出。
在每次试验中，均设置了以下对照：
(i)细胞对照–仅培养基中未感染病毒的细胞；和
(ii)病毒对照–只加入培养基(200μl)而不加试验化合物1或对照化合物2的一列感染病毒的细胞。
另外，通过MTT法测定细胞培养中HIV-1的复制，并记录培养基(液体)中的RT活性。该试验显示了在合适的实验条件下对病毒逆转录过程的影响。
化合物1或对照化合物2对HIV-1的细胞病变效应的活性以下式定义的细胞保护(存活)百分比(％)表示：
其中：
ODVS＝被感染且用化合物1或2处理的细胞的吸光度
ODVC＝病毒感染细胞(不含有化合物1或2的病毒对照)的吸光度，以及
ODCC＝未被感染细胞(细胞对照)的吸光度
抑制浓度50％(IC50)定义为以mM表示的试验化合物1或对照化合物2能抑制50％的病毒复制的浓度。IC50直接由“剂量(浓度)-反应(抗HIV效应)”曲线确定。IC50表示为以下的百分比(％)：
(i)通过MTT测定获得的细胞活力；或者，
(ii)逆转录(RT)酶活性的抑制百分比(％)。
在试验物质1或对照物质2的CC50和IC50数据的基础上，估计选择性指数(SI)值。
对任何潜在的抗HIV活性物质的影响的研究通常始于物质对病毒的生物活性，而不考虑这种作用的机制或目标。通过MTT实验在MT-4细胞系测试物质1或对照化合物2对HIV-1复制的影响，以记录病毒作用下的细胞病变效应。事实上，该测试报告了用病毒感染并用不同浓度的试验物质1或对照物质2处理的细胞的存活率。期望的是，在抗病毒作用中，相比于病毒对照组，细胞将被保护免受病毒的细胞病变作用。
在所有情况下，我们对未感染病毒且未添加抑制剂的细胞(细胞对照)的存活，和感染了病毒并且未添加抑制剂的细胞(病毒对照)的存活进行了比较。
因此，在每个实验中，抗病毒作用会紧随以下必然状态发生：
(i)未经病毒和物质处理的细胞(对照细胞)；
(ii)病毒处理的细胞，不添加试验物质1或对照物质2(对照病毒)；以及
(iii)病毒感染的细胞，其中，接种后的培养基中会加入适当浓度的试验物质1或对照物质2。
表2和表3给出了实验结果。
表2.在先前确定的MNC＝0.01mM的7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)或7,8-二羟基-3-(4,6,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(2)的作用下，感染HIV-1的MT-4细胞的存活(％保护)。
a相应的浓度是细胞毒性，因此，在这些浓度下的实验没有进行。
表2的结果显示了在用HIV-1感染后并用不同浓度MNC的试验化合物1和对照化合物2处理后的MT-4细胞的存活(保护)。因此不仅测定了化合物1和2的生物学活性，而且通过MTT实验测定了两种化合物的IC50。基于“剂量-抗HIV效应”的数据，可以确定试验化合物1和对照化合物2的IC50值(表3)。
表3.根据MTT实验在被HIV-1感染的MT-4细胞中7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)或7,8-二羟基-3-(4,6,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(2)的MNC，CC50，IC50和SI这些MT-4细胞保护(％存活)数值比较。
比较MNC浓度和IC50的作用，结果显示化合物1在MNC下高度保护细胞，达92％。即使浓度比MNC低10倍(10x)，也能保护60％的细胞。
相比之下，来自现有技术的对照化合物2显示出显著的、较低的抗病毒活性，观察到的细胞的保护仅为55％，而本发明的化合物1观察到的细胞的保护为92％。此外，即使在比MNC低100倍的浓度(0.0001mM)下，现有技术的对照化合物2显示出0％的细胞保护活性，相比之下，本发明的化合物1产生了55％的细胞保护活性。
在化合物1或2的所有浓度下，可观察到不同程度的细胞存活的剂量依赖性降低。这表明，降低化合物1或2的浓度会降低细胞的存活率，因为随后病毒的细胞病变效应增加。
总结来说，与现有技术的对照化合物2相比，试验化合物1保护细胞具有显著的、更强的抗病毒活性。
实施例5给出了化合物1和2的抗病毒活性研究的详细实验步骤。
通过研究逆转录酶(RT)活性进行7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并 吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的抗病毒活性研究，并与文献类似物2比 较
此外，化合物1的抗病毒活性是研究逆转录酶(RT)活性，以阐明其抗病毒作用的潜在机制。这是通过使用未感染HIV-1的MT-4细胞系来完成的。HIV-1培养液的来源是慢性感染并产生HIV-1亚型B细胞系H9/HTLVIII B。
测定逆转录酶(RT)活性：
(a)在感染HIV-172小时后的MT-4细胞培养液中进行(病毒对照)；
(b)在未感染HIV-1且不添加任何物质的细胞培养液中培养72小时后进行(细胞对照)；以及
(c)在感染HIV-172小时后的MT-4细胞培养液中进行，其中加入所需浓度的试验化合物1或对照化合物2于生长培养基中。
RT活性根据生产者的指示确定。分别报告每个试剂盒中可获得的标准重组逆转录酶(rRT)的RT活性。制备标准rRT的12倍稀释液。制造商为每个12倍稀释液提供以pg/孔和pg/ml计的rRT量的数据。所使用的方法表现为用于非放射性测定RT活性的比色法。它包括两个阶段：
(1)在33℃孵育3小时或24小时(由实验确定的)进行反转录合成；以及
(2)所得产物的定量测定。
在使用溴脱氧尿苷三磷酸(Brd UTP)进行DNA合成的过程中，其进入反应混合物的组合物。它被包含在构成DNA链的基质/引物的结构中。通过与碱性磷酸酶偶联的示踪抗体Brd UTP进行掺入的Brd UTP的测定。随后用比色法测定A405nm处的吸光度，其与样品中的RT活性成比例。根据生产商的说法，当样品的A405值超过阴性对照的A405值的至少2倍时，RT活性被认为是阳性的。否则，报告样品缺乏RT活性，即阴性。在对照细胞中严格不存在RT活性的情况下，通过比较不同浓度试验物质处理孔中的RT活性与被报道的病毒对照组(100％)的RT活性进行实验。使用RT测试得到的复制抑制百分数表示为100％(不含抑制剂的阳性病毒对照)与报道的用不同浓度的抑制剂(化合物1或2)处理的孔中RT活性百分数之间的差异。
RT试验是通过使用由Cavidi(瑞典)提供的HS-Lenti RT活性试剂盒试验进行的，以直接研究rRT的抑制作用。HS-Lenti RT活性实验提供了直接测定已知浓度的试验化合物1和对照化合物2对rRT活性影响的机会。这是通过在孵育混合物中确定RT活性来实现的，将试验或对照物质包含在所需的稀释液中，其在初步研究中显示出活性。测试试剂盒制造商提供了这样的机会，参见参考文献10：
10)X.Shao,D.Ekstrand,R.Bhikhabhai,C.Kallander,J.Gronowitz:A non-radioactive microtitre plate reverse transcriptase(RT)assay,based onimmobilized template,for screening of RT activity inhibitors and evaluationof the mode of action,Antiviral Chem.Chemother.8(1997)149-159.
用于研究化合物1和2对逆转录酶(RT)活性的作用的详细实验步骤在实施例6中描述。
RT活性的测量是定量测定逆转录病毒复制的广为流传的方法。在本实验设置中，主要测量上清液中的内源活性，即在病毒感染的细胞的培养液中，并在培养72小时后用抑制剂处理/未处理。
作为对照，使用经证实具有抗病毒活性的常用物质；在我们的例子中，我们使用克为滋(Kivexa)，其含有600mg阿巴卡韦和300mg拉米夫定，其在临床实践中被用作RT的核苷抑制剂。在测试中存在RT抑制的情况下，结论是不仅病毒的复制被抑制，而且抑制作用的目标可能是RT本身。为了证实这个结论，RT抑制的百分比(％)必须与微量滴定MTT实验中的％抑制一致。为了充分证明这一点，制造公司提供了一种测试方法和外源RT活性测定。以所需浓度制备补充有抑制剂的反应混合物用于实验测定，然后向该混合物中加入已知活性和浓度的重组RT。孵育之后，我们测定酶的活性，确定其是否被化合物1或2的作用修改(抑制)。表4显示了通过测量内源性和外源性RT活性得到的不同浓度的试验化合物1和对照化合物2对HIV-1复制的影响。
表4.在被感染的MT-4细胞中，不同浓度(第3列)的克为滋(阿巴卡韦和拉米夫定)，7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)和7,8-二羟基-3-(4,6,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(2)对HIV-1复制的影响。这种影响是通过培养液中的RT活性(内源RT)测定(第4列)和对rRT的直接影响(外源的重组RT；第5列)测定的。
克为滋(600mg阿巴卡韦+300mg拉米夫定)＝参考RT抑制剂。n.a.＝没有分析；因为缺少阿巴卡韦三磷酸盐。
a用于内源性RT活性测试的阴性对照，是A405＝0.212。阳性对照是A405＝1.000。实验结果为3-6个孔的平均值；这些是以MTT测定法(A540)中的消光值差异不超过10％的方式进行选择得到的。
b用于rRT活性测试的阴性对照是A405＝0.232。测试的阳性对照是rRT A405＝2.964。
c由于之前的稀释结果的强度，这些没有分析。
有一点是至关重要的，如果该物质是RT的核苷抑制剂，为了执行该活性，需要细胞激酶的磷酸化。后者在“无细胞”系统中，即在执行外源性RT反应中是不可能的。后者只有在使用试验物质的三磷酸盐的情况下才有可能。由于这个原因，阿巴卡韦的外源性RT没有实施。然而，这只适用于核苷类似物而不适用于试验化合物1或2。
化合物1在MT-4细胞中抑制>89％的HIV-1感染性(表4)，这与上清液中的RT抑制(内源性RT)一致。类似的情况是针对rRT，与内源性RT的抑制相比略低。
从该研究中，可以得出结论，来自本发明的化合物1通过抑制RT显示出强的抗病毒活性，而来自现有技术的对照化合物2是较次要的或完全失活的(内源性或外源性)RT抑制剂。以此方式，如先前观察到的现有技术对照化合物2的抗病毒活性可能不基于RT抑制。
化合物1的RT抑制活性与已知的抗病毒剂克为滋(阿巴卡韦+拉米夫定)相似或略强。
因此，与内源性RT的抑制相比，化合物1的抗病毒活性确实靶向人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的逆转录酶(RT)，尽管对rRT的抑制略低。
通过FDA批准测试确定7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3- 基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的病毒载量的研究，并与文献类似物2比较
MT-4细胞系和HIV-1培养物的制备与先前描述的研究相同。通过用FDA批准的测试方法测量病毒载量来监测病毒体在抗病毒分析期间的量，实施如下：使用实时聚合酶链式反应(PCR)测试进行HIV-1的体外定量测定，利用美国食品和药品管理局(FDA)批准的自动化系统Abbott分子m2000(Abbott Molecular’s m2000)并带有CE标志。用带有磁性颗粒的自动提取器-Abbott分子m2000sp(Abbott Molecular’s m2000sp)和Real-Time扩增仪进行病毒核酸的提取；用m2000rt进行检测。通过提取1ml样品，测试的灵敏度和范围是40(1.6log拷贝/ml)至10,000,000(7.0log拷贝/ml)拷贝/ml。病毒基因组的目标区域是整合酶基因pol.的片段。该测试旨在检测HIV-1亚型A-H，组P和N。在每个试验样品中，设置内部对照。
该研究包括三个对照：阴性，低阳性和高阳性，结果如下：
(i)阴性对照-结果阴性(未检出)；
(ii)低阳性对照-结果938拷贝/ml(2.97log)的对照水平；和
(iii)高阳性对照-结果92,927拷贝/ml(4.97log)的对照水平。
对照在允许的范围内，研究是有效的。
除了病毒和细胞对照外，还测试了两个样品：
(1)病毒对照：感染了HIV-1培养液的MT-4细胞，HIV-1培养液来自慢性感染并产生HIV-1亚型B细胞系。将感染细胞的烧瓶在37℃和CO2含量5％的条件下孵育5天(120小时)。孵育期结束后，收集上清液并于-70℃冷冻进行研究；
(2)细胞对照：培养基中只有MT-4细胞，未感染HIV-1；
(3)样品1：用HIV-1急性感染的MT-4细胞，并用现有技术的最大无毒浓度(MNC)0.01mM的对照化合物2处理；和
(4)样品2：用HIV-1急性感染的MT-4细胞，用本发明的最大无毒浓度(MNC)0.01mM的化合物1处理。
该研究的结果在表5中给出。该研究的实验步骤在实施例7中描述。
表5.通过在MT-4细胞系中利用FDA批准的测试方法测定病毒载量，对7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)和7,8-二羟基-3-(4,6,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(2)的抗HIV-1抗病毒作用进行比较。
在这项研究中，与病毒对照的结果相比，更低的病毒载量意味着更强的抗病毒活性。化合物1显示最低的病毒载量，低于病毒对照实验的结果，清楚地表明其抗病毒活性。此外，用化合物1得到的病毒载量明显低于现有技术的对照化合物2的病毒载量，证明前者相对于后者的化合物具有更强的抗病毒活性。
综上所述，7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)具有低毒性和高抗病毒活性的特征。
该研究显示，本发明化合物1的抗病毒活性显著强于现有技术的对照化合物2(表2，3和5)，与已知的基于药用活性成分阿巴卡韦+拉米夫定固定组合成的抗病毒剂克为滋相比相似或略强(表4)。
化合物1的抗病毒作用的初步暂定机制是基于逆转录酶(RT)的抑制，但这可能不是其抗病毒作用的唯一方面。
本发明组合物的用途
由于7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)所示的显著的抗病毒活性，来自1的本发明的组合物，以其各种最终剂型用于治疗各种病毒感染和病毒引起的疾病。
本发明的组合物可以用于对抗以下病毒：肠道病毒A-J；鼻病毒A-C；轮状病毒A-C；诺如病毒；流感病毒A-C及其多个分型，例如H1N1，H2N2，H3N2，H5N1，H7N7，H1N2，H9N2，H7N2，H7N3，H10N7，H7N9及它们的其他亲缘病毒；人乳头瘤病毒(HPV)；多瘤病毒如约翰·坎宁安病毒(JCV)和默克尔细胞病毒(MCV)；痘病毒；疱疹病毒如人疱疹病毒1(HSV-1)，人单纯疱疹病毒2(HSV-2)，水痘带状疱疹病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒(人疱疹病毒4；EBV/HHV-4)，人巨细胞病毒(HHV-5)和卡波西肉瘤相关疱疹病毒(HHV-8)；甲型肝炎A-C病毒(HAV，HBV，HCV)；逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)，2型(HIV-2)及其亚型；SARS冠状病毒；埃博拉病毒(EBOV)；马尔堡病毒(MARV)；版纳病毒(Banna)；风疹病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；人副流感病毒(hPIV1-4)；狂犬病病毒；环状病毒；以及对抗影响人类或动物有机体的其他病毒。
以这种方式，本发明的组合物用于治疗由上述病毒引起的疾病，所述疾病选自包括如下组成的组：
(i)非癌症疾病：肠炎(肠道病毒A-J)；普通感冒(鼻病毒A-C)；胃肠炎，腹泻(轮状病毒A-E，诺如病毒)；胃肠炎(诺如病毒)；流感(A-C型流感病毒)；慢性进行性多灶性白质脑病(JCV)，肾病，梅克尔细胞癌(MCV)，天花病(天花)(痘病毒)；疱疹(HSV-1，HSV-2)；水痘，带状疱疹(带状疱行疹)(水痘带状疱疹病毒)；传染性单核细胞增多症(HHV-4)；甲型肝炎(甲型肝炎病毒)；乙型肝炎(乙型肝炎病毒)；丙型肝炎(丙型肝炎病毒)；后天免疫机能丧失综合症(HIV-1，HIV-2及其亚型)；严重急性呼吸系统综合症(SARS)；埃博拉(EBOV)；马尔堡病毒病(MARV)；发热和脑炎(版纳病毒)；风疹(风疹病毒)；麻疹(麻疹病毒)；腮腺炎(腮腺炎病毒)；副流感(hPIV1-4)；狂犬病(狂犬病病毒)；
(ii)病毒相关的癌症疾病：何杰金淋巴瘤，鼻咽癌，伯基特淋巴瘤(EBV/HHV-4)；粘液表皮样癌(HHV-5)；肝细胞癌(HBV，HCV)；宫颈癌，肛门癌，阴茎癌，阴道癌和口咽癌(HPV)；原发性渗出性淋巴瘤，卡波西肉瘤(HHV-8)；以及
(iii)通常与各种病毒相关的自身免疫性疾病：皮肌炎，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，多发性硬化症，舍格伦综合征；以及人类和动物的各种其他病毒性疾病。
取决于最终剂型的种类，本发明的组合物可以通过眼睛，鼻子，或耳朵，或通过吸入，口服，局部外用，肠胃外，阴道，直肠给药。所述疗法包括每天一次或多次施用，药物有效剂量为0.1-15mg/kg体重，代表性的每75kg体重的成年人平均为7.5-1.125mg活性化合物1。
附图的简要说明
图1、根据MT-4模式细胞系的活力检测7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的细胞毒活性，培养72h后得到剂量-反应曲线。
图2、根据MT-4模式细胞系的活力检测对照化合物7,8-二羟基-3-(4,6,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(2)的细胞毒活性，培养72h后得到剂量-反应曲线。
具体实施方式
实施例
总论
薄层色谱(TLC)在德国达姆施塔特默克公司的铝箔60HF254硅胶板上进行。
高效液相色谱(HPLC)在安捷伦1260Infinity仪器上进行。
红外(IR)光谱在布鲁克阿尔法FT-IR光谱仪上以钻石-ATR取样模式记录，波数(ν)以cm-1表示。
核磁共振波谱在布鲁克Avance III核磁共振分光光度计上以500MHz(1H)或125MHz(13C)记录。化学位移(δ)以四甲基硅烷作为内标物，以ppm表示，偶联常数以Hz表示。
质谱在具有以下特征的安捷伦6224精确质量TOF LC-MS系统上记录：双重AP-ESI(在大气压力下的电喷雾)源；针对25-20.000的正负离子质量分析仪；整个质量区域的质量分辨率>10.000；准确度>2ppm。
室温(r.t.)表示20℃-25℃的温度区间。
本发明化合物1和现有技术对照化合物2的抗病毒活性研究是与保加利亚索非亚国家传染病和寄生虫病中心(NCIPD)病毒学系合作进行的；P.Genova-Kalou教授，博士；D.Pencheva博士；A.Tchorbanov博士；I.Alexiev教授，博士和T.Kantardjiev教授，博士。
实施例1.7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并 [3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的合成
(a)4,5,7-三羟基-2H-苯并吡喃-2-酮(6)的制备：向3颈3l反应烧瓶中加入乙醚(900ml)，然后加入间苯三酚(3；126.00g；1mol)和氰基乙酸(4；85.00g；1mol)。将反应混合物在气体氯化氢(HCl)存在下，冷却并保持温度在30-35℃之间，剧烈搅拌6小时。反应进行6小时。然后将混合物放置过夜。将有机层轻轻倒出并将残余产物倒入水(3l)和冰(1kg)的混合物中。将如此获得的悬浮液搅拌1小时，并用布氏漏斗过滤。中间产物是酰基酮亚胺5，其从50％乙醇水溶液中进一步结晶。
这样纯化的酰基酮亚胺5在36％盐酸(1l)和蒸馏水(500ml)的混合物中在回流温度(130℃)下水解90分钟。然后，将反应混合物冷却至室温，通过过滤分离出沉淀形式的产物，并用水(3×100ml)洗涤。粗产物在真空烘箱(60℃，过夜)中干燥并通过水-乙醇(V/V)9:1结晶纯化。将分离的产物在真空烘箱中于60℃干燥过夜，得到174.60g(90％)呈黄色晶体形式的纯的化合物6，m.p.为325℃(dec.)。
薄层色谱上的单点，Rf＝0.40；苯/甲醇/乙酸乙酯＝3：4：5，V/V/V。
MS m/z：193.03[M-H+]；Mr(5)＝194.02。
FT-IR(KBr)ν(cm-1)：3502,3411,3258,3082,2631,1608,1565,1470,1426,1358,1296,1266,1211,1160,1075,806。
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm)：5.90(s，1H，H-6)，6.05(s，1H，H-8)，6.10(s，1H，H-3)，10.50(s，3H，4,5,7-OH)。
13C-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):89.9,96.0,97.2,102.0,155.0,157.1,159.0,162.0,168.0。
(b)7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2- c]苯并吡喃-4-酮(1)的制备：向三颈烧瓶(250ml)中加入丙酮(75ml)，4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-2-酮(6；4.74g；0.022mol)和乙二醛(7；0.93ml的40％溶液)。将反应混合物加热回流(75℃)1小时。然后，将反应混合物蒸发至干燥。将粗产物(3.07g)在苯/甲醇/乙酸乙酯(30ml；3:4:5，V/V/V)的回流混合物中研磨，过滤分离，用相同的溶剂混合物洗涤，在40℃的真空烘箱中干燥过夜。这样得到的产物1呈淡褐色粉末状晶体(2.95g；72％)，m.p.>300℃(dec.)。
MS m/z:409.08[M-H+]；Mr(1)＝410.29.
FT-IR(KBr)ν(cm-1):3163,3088,2680,2642,1604,1578,1473,1406,1364,1334,1287,1149,1080,829.
1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):6.12(d,1H,J＝2.2Hz),6.14(d,1H,J＝2.1Hz),6.32(d,1H,J＝2.1Hz),6.35(d,1H,J＝2.1Hz),6.89(s,1H),10.6(bs,5H).
13C-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):88.6,91.3,93.1,95.1,97.1,97.3,98.4,105.1,108.4,150.4,153.8,154.0,154.6,155.7,157.3,158.6,159.5,160.1,161.5,170.1.
实施例2.7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并 [3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的分析
用于分析化合物1的薄层色谱(TLC)方法：硅胶铝箔板默克60HF254(达姆施塔特，德国)；洗脱液：苯/甲醇/乙酸乙酯＝3：4：5，V/V/V；斑点的显色在254nm的紫外灯下进行；Rf(1)＝0.12。
用于分析化合物1的高效液相色谱(HPLC)方法：柱：ZORBAX Extend C18,2.1x50mm，1.8μm；流动相：水(A)：乙腈(B)，梯度程序：t0＝80％A+20％B，t10min＝10％A+90％B；柱温：40℃；检测：通过206nm的PDA检测器进行；保留时间tR(1)＝1.20min。
实施例3.7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并 [3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)单钠盐的制备
向96％乙醇(100ml)中加入粉末状化合物1(1.00g；2.44mmol)并在室温下搅拌15分钟。然后，加入氢氧化钠(0.10g；2.44mmol；1当量)并在氮气(N2)的惰性气体环境下搅拌1小时。将由此获得的反应混合物蒸发至干，并在60℃深度真空下进一步干燥20小时。由此获得的产物(1.05g；定量)为化合物1的无味细粉形式的单钠盐。
实施例4.在MT-4模式细胞培养物中研究7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代- 2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的细胞毒性，并与现有技术中的 对照化合物2比较
通过测定最大无毒浓度(MNC)和50％细胞活力所需浓度(CC50)的方法进行细胞生长和活力的研究，从而测定化合物1和对照化合物2的细胞毒性。
化合物1和化合物2的细胞毒性的研究在人源的MT-4细胞系中进行；由人类T细胞亲淋巴病毒-1(HTLV-1)转化而来的细胞系。
悬浮培养的细胞呈簇状生长。将它们在补充有15％胎牛血清(FBS；Sigma-Aldrich，美国)，100U/ml青霉素G钠(Sigma-Aldrich，美国)和100μg/ml硫酸链霉素(Sigma-Aldrich，美国)的RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640型(Sigma-Aldrich，美国)生长培养基中培养。以约6-8×104个细胞/ml的密度按1：3-1：5传代，传代需要反复重悬。
通过修改参考文献9中描述的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)实验来评估细胞活力。
MTT还原实验是测量细胞增殖和细胞毒性最常用的方法之一。通过分光光度法测量由活的、代谢活性细胞主要位于线粒体中的琥珀酸脱氢酶活性产生的MTT甲臜的颜色强度，其与现存的活细胞数成比例。
MTT是一种黄色水溶性四唑染料，被活细胞而非死细胞还原成不溶于水溶液的紫色甲臜产物。
由于我们使用的细胞培养物是悬浮液，因此使用聚-L-赖氨酸(PLL；Mw＝90,000；Sigma-Aldrich，美国)的溶液将细胞附着在96孔板的底部。用100μl被pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS；Sigma-Aldrich，美国)溶解的浓度为50μg/ml的PLL处理平板，然后在室温下孵育1小时。随后吸走PLL溶液并用无菌PBS洗涤平板两次。然后将细胞以7-8×104个细胞/100μl的浓度接种到所有实验中。由于每孔中培养基的最终体积为200μl，因此需添加额外100μl的10％FBS(不含细胞)。为了实验目的，不需要形成致密的细胞单层，24小时后，当贴壁细胞粘附在塑料上时，将上清液轻轻倒出并加入50μl事先制备的试验化合物稀释液。用培养基(150μl)补充至最终体积200μl。将平板在37℃和CO2含量5％条件下孵育3天(72小时)。在不含试验化合物的培养基中生长的细胞用作对照。
孵育72小时后，将培养基换成MTT(Sigma-Aldrich，美国)，并以终浓度5mg/ml溶于无血清培养基中，再孵育3小时。然后，将MTT-甲臜产物溶于乙醇/二甲基亚砜(DMSO；Sigma-Aldrich，美国)(1:1，V/V)中，并在540nm的测试波长下测量光密度。每个实验一式三份进行。
细胞存活被记录为用不同浓度的试验物质处理的孔中的活细胞与未用该物质处理的对照细胞的百分比(％)。从构建的“剂量-细胞存活”曲线计算最大无毒浓度(MNC)和50％细胞毒性浓度(CC50)。
通过形态学和细胞存活标准同时评估MNC和CC50值。我们使用MTT试验确定活细胞和早期凋亡细胞。当用浓度范围为10mM至0.01mM的试验化合物1和对照化合物2溶液处理后72小时后，进行单层细胞形态的显微观察时，没有典型的表征毒性效应的细胞病理学记录。与细胞对照相比，我们仅在最高浓度为100mM的处理孔中发现一些形态变化，其影响可能是由于所用稀释剂(DMSO)的含量所致。
为了评价这种效应是否是由试验化合物1，对照化合物2或DMSO的毒性所致，测试了补充有2％FBS和DMSO的生长培养基RPMI 1640的对照。我们进行了与化合物1和化合物2具有相同浓度范围的测试，结果显示DMSO在较低稀释度下的毒性非常小，并且对两种细胞系都没有毒性作用。
化合物1和化合物2对MT-4模式细胞系活力的细胞毒活性可以从培养72小时后的剂量-反应曲线中看出，见图1和2。
表1中给出了化合物1和2获得的MNC和CC50结果。
实施例5.7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并 [3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的抗病毒活性研究，并与现有技术的对照化合物2比较
将化合物1或2溶于二甲基亚砜(DMSO；Sigma-Aldrich，美国)中至1mol/l(1M)的浓度，并用加入了2％热灭活胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich，美国)的细胞生长培养基RPMI1640稀释。进一步地化合物1或2的所有溶液都是临时制备的。
MT-4细胞系未感染HIV-1，并被用作HIV-1急性感染繁殖的典型模型。将细胞在补充有15％胎牛血清(FBS；Sigma-Aldrich，美国)，100U/ml青霉素G钠(Sigma-Aldrich，美国)和100μg/ml硫酸链霉素(Sigma-Aldrich，美国)的RPMI 1640生长培养基中培养。
HIV-1培养液被慢性感染并产生HIV-1亚型B细胞系H9/HTLV III B。将培养液离心并收集作为病毒原液。被用于实验的后者，根据通过摄取含有蛋白质24抗原(p24)和逆转录酶(RT)的MTT实验，并且基于HIV的细胞病变效应的微量滴定感染性实验，发现其具有2×106个感染性病毒粒子/ml的预定感染性。
文献中描述了基于病毒的细胞病变效应的考虑，在细胞培养中实施的感染性微孔板实验，参见参考文献8。
细胞计数之后，将它们以6-8×104个细胞/100μl的浓度重悬于生长培养基中。随后筛选细胞悬浮液(如上述的100μl/孔)到用聚-L-赖氨酸(PLL)预处理的无菌96孔板中。由于每孔中培养基的最终体积为200μl，因此添加额外100μl的10％FBS(不含细胞)。在行和列的末尾不是种子细胞，而是不含FBS的培养基。
24小时后，将上清液轻轻倒出并添加50μl稀释度为10-1的HIV-1。一个列或两列没有被感染，当作对照细胞。将平板置于37℃和CO2含量5％的培养箱中1小时。然后除去病毒，在一列或两列感染细胞中加入含有适当浓度的试验物质1或对照物质2的200μl培养基。至少4种不同的浓度：10×MNC，MNC，MNC-1，MNC-2和MNC-3。MNC的值在表1中给出。
在每次试验中，均设置了以下对照：
(i)细胞对照-仅培养基中未感染病毒的细胞；和
(ii)病毒对照–仅加入培养基(200μl)而不加试验化合物1或对照化合物2的一列感染病毒的细胞。
平板在37℃和CO2含量5％的条件下孵育5天(120h)。
孵育期结束后，将每个孔的上清液倒入未消毒的96孔板的孔(镜子)中。这是为了仅研究具有平行存活的孔的上清液，例如相互间难以分辨的超过±10％，相同病毒稀释度/相同浓度的试验物质。随后，如上所述进行MTT试验。
甲瓒晶体孵育4小时后的活细胞和早期凋亡细胞，其吸收光的波长为540-570nm。在从未消毒的96孔板的孔中分别测定细胞的存活之后，收集上清液用于进一步研究，例如，确定逆转录酶(RT)活性时，仅从具有平行存活的孔中收集培养基，即相互间难以分辨的超过±10％，相同的病毒稀释度/相同浓度的试验化合物1。
通过MTT试验测量细胞培养物中HIV-1的复制，此外，在培养基(液体)中记录RT活性。该试验显示了在适当的实验条件下对病毒中逆转录过程的影响。
化合物1或对照化合物2对HIV-1的细胞病变效应的活性以下式定义的细胞保护(存活)百分比(％)表示：
其中：
ODVS＝被感染且用化合物1或2处理的细胞的吸光度
ODVC＝病毒感染细胞(不含有化合物1或2的病毒对照)的吸光度，以及
ODCC＝未被感染细胞(细胞对照)的吸光度
抑制浓度50％(IC50)定义为以mM表示的试验化合物1(或2)能抑制50％的病毒复制的浓度。IC50直接由“剂量(浓度)-反应(抗HIV效应)”曲线确定。IC50表示为以下的百分比(％)：
(i)通过MTT测定获得的细胞活力；或者，
(ii)逆转录(RT)酶活性的抑制百分比(％)。
在试验物质1或对照物质2的CC50和IC50数据的基础上，估计选择性指数(SI)值。
对任何潜在的抗HIV活性物质的影响的研究通常始于物质对病毒的生物活性，而不考虑这种作用的机制或目标。通过MTT实验在MT-4细胞系测试物质1或对照化合物2对HIV-1复制的影响，以记录病毒作用下的细胞病变效应。事实上，该测试报告了用病毒感染并用不同浓度的试验物质1或对照物质2处理的细胞的存活率。期望的是，在抗病毒作用中，相比于病毒对照组，细胞将被保护免受病毒的细胞病变作用。
在所有情况下，我们对未感染病毒且未添加抑制剂的细胞(细胞对照)的存活，和感染了病毒并且未添加抑制剂的细胞(病毒对照)的存活进行了比较。
表2和表3给出了这些实验的结果。
实施例6.通过测定逆转录酶(RT)活性进行7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧 代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的抗病毒活性研究，并与现 有技术中的对照化合物2比较
如之前所述，将化合物1或2溶于二甲基亚砜(DMSO；Sigma-Aldrich，美国)中至1mol/l(1M)的浓度，并用加入了2％热灭活胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich，美国)的细胞生长培养基RPMI 1640稀释。化合物1或2的所有其他溶液都是临时制备的。
MT-4细胞系未感染HIV-1，并被用作HIV-1急性感染繁殖的典型模型。将细胞在补充有15％胎牛血清(FBS；Sigma-Aldrich，美国)，100U/ml青霉素G钠(Sigma-Aldrich，美国)和100μg/ml硫酸链霉素(Sigma-Aldrich，美国)的RPMI 1640生长培养基中培养。由于该细胞系为悬浮状态，因此我们使用聚-L-赖氨酸(PLL；Mw＝90,000；Sigma-Aldrich，美国)的溶液将细胞附着在96孔板的底部。将100μl被PBS溶解的浓度为50μg/ml的PLL滴入平板，然后在室温下孵育1小时。吸走PLL溶液之后，用无菌PBS洗涤平板两次。然后在使用之前将处理后的平板储存在+4℃。
HIV-1：HIV-1培养液的来源是被慢性感染并产生HIV-1亚型B细胞系H9/HTLV IIIB。将培养液离心并收集作为病毒原液。被用于实验的后者，根据基于MTT实验记录的HIV细胞病变效应的微量滴定感染性实验，预定其具有2×106个感染性病毒粒子/ml，参见参考文献8和9。
测定逆转录酶(RT)活性：
(a)在感染HIV-172小时后的MT-4细胞培养液中进行(病毒对照)；
(b)在未感染HIV-1且不添加任何物质的细胞培养液中培养72小时后进行(细胞对照)；以及
(c)在感染HIV-172小时后的MT-4细胞培养液中进行，其中加入所需浓度的试验化合物1或对照化合物2于生长培养基中。
将培养液收集在Eppendorf管中并以10.000rpm/min的速度离心10分钟，然后将上清液转移到另一个Eppendorf管中，并保存在-70℃直到测定RT活性的时间。
根据制造商的说明进行离心以消除上清液中的单个细胞。RT活性根据生产者的指示确定。分别报道了每个试剂盒中可获得的标准重组逆转录酶(rRT)的RT活性。它制备了标准rRT的12倍稀释液。制造商为每个12倍稀释液提供每pg/孔和pg/ml的rRT量数据。所使用的方法代表非放射性RT活性测定的比色法。它包括两个阶段：
(1)在33℃孵育3小时或24小时(其通过实验确定)进行逆转录合成；和
(2)所得产物的定量测定。
在使用溴脱氧尿苷三磷酸(Brd UTP)进行DNA合成的过程中，其进入反应混合物的组合物。它被包含在构成DNA链的基质/引物的结构中。通过与碱性磷酸酶偶联的Brd UTP示踪抗体进行掺入的Brd UTP的测定。随后用比色法测定A405nm处的吸光度，其与样品中的RT活性成比例。根据生产商的说法，当样品的A405值超过阴性对照的A405值的至少2倍时，RT活性被认为是阳性的。否则，报告样品缺乏RT活性，即阴性。在对照细胞中严格不存在RT活性的情况下，通过比较不同浓度试验物质处理孔中的RT活性与被报道的病毒对照组(100％)的RT活性进行实验。使用RT试验得到的复制抑制百分数表示为100％(不含抑制剂的阳性病毒对照)与报道的用不同浓度的抑制剂(化合物1或2)处理的孔中RT活性百分数之间的差异。
RT试验是通过使用由Cavidi(瑞典；cat.no.52010)提供的HS-Lenti RT活性试剂盒试验进行的，以直接研究rRT的抑制作用。HS-Lenti RT活性实验提供了直接测定已知浓度的试验化合物1和对照化合物2对rRT活性影响的机会。这是通过在孵育混合物中确定RT活性来实现的，将试验或对照物质包含在所需的稀释液中，其在初步研究中显示出活性。测试试剂盒制造商提供了这样的机会，具体参见参考文献10：
程序如下：在包被有poly-rA基质的平板的孔中，将反应混合物添加到RT，含有oligo-dT的引物，作为dNTP的来源的Brd UTP，并在比测试物质稀释液的10x更浓的商业试验缓冲液中制备(反应混合物的体积为100μl)。对照仅仅是没有活性物质的反应混合物。在33℃孵育30分钟后，向各孔添加已知浓度的rT标准品。在随后的孵育中，rRT通过形成逆转录-RT-产物来显示其活性。随后洗涤并用与碱性磷酸酶偶联90分钟的BrdU抗体测定RT产物。使用碱性磷酸酶的合适底物进行酶反应30分钟，然后在405nm波长处检测吸光度。为了选择合适的稀释度的重组酶，我们预先准备了12个稀释度，并根据所得结果建立了标准回归曲线。我们选择了曲线上吸收的减少与重组酶稀释度的增加成正比的稀释度，在该区域回归曲线具有线性形式。
结果：RT活性的测量是定量测定逆转录病毒复制的普遍方法。在实验设置中，主要测定上清液中的内源活性，即在病毒感染的细胞的培养液中，并在培养后72小时用抑制剂处理/未处理。
作为对照，使用经证实具有抗病毒活性的常用物质；在我们的例子中，我们使用克为滋(600mg阿巴卡韦+300mg拉米夫定)，其在临床实践中被用作RT的核苷抑制剂。在测试中存在RT抑制的情况下，结论是不仅病毒的复制被抑制，而且抑制作用的目标可能是RT本身。为了证实这个结论，
RT抑制的百分比(％)必须与微量滴定MTT实验中的％抑制一致。为了充分证明这一点，制造公司提供了一种测试方法和外源RT活性测定。以所需浓度制备补充有抑制剂的反应混合物用于实验测定，然后向该混合物中添加已知活性和浓度的重组RT。孵育之后，我们测定酶的活性，确定其是否被化合物1或2的作用修改(抑制)。表4给出了结果。
实施例7.通过FDA批准测试确定7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并 吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的病毒载量的研究，并与现有技术对照 化合物2比较
MT-4细胞系和HIV-1培养物的制备与先前描述的研究相同。通过用FDA批准的测试方法测量病毒载量来监测病毒体在抗病毒分析期间的量，预实验实施如下：使用实时聚合酶链式反应(PCR)测试进行HIV-1的体外定量测定，利用美国食品和药品管理局(FDA)批准的自动化系统Abbott分子的m2000和CE标志。用带有磁性颗粒的自动提取器-Abbott分子公司的m2000sp和Real-Time扩增仪进行病毒核酸的提取；用m2000rt进行检测。通过提取1ml样品，测试的灵敏度和范围是40(1.6log拷贝/ml)至10,000,000(7.0log拷贝/ml)拷贝/ml。病毒基因组的目标区域是整合酶基因pol.的片段。该测试旨在检测HIV-1亚型A-H，组P和N。在每个试验样品中，设置内部对照。
该研究包括三个对照：阴性，低阳性和高阳性，结果如下：
(i)阴性对照-结果阴性(未检出)；
(ii)低阳性对照-结果938拷贝/ml(2.97log)的对照水平；和
(iii)高阳性对照-结果92,927拷贝/ml(4.97log)的对照水平。
对照在允许的范围内，研究是有效的。
还测试了以下样品：
(1)病毒对照：感染了HIV-1培养液的MT-4细胞，HIV-1培养液来自慢性感染并产生HIV-1亚型B细胞系。将感染细胞的烧瓶在37℃和CO2含量5％的条件下孵育5天(120小时)。孵育期结束后，收集上清液并于-70℃冷冻进行研究；
(2)细胞对照：培养基中只有MT-4细胞，未感染HIV-1；
(3)样品1：用HIV-1急性感染的MT-4细胞，并用现有技术的最大无毒浓度(MNC)0.01mM的对照化合物2处理；和
(4)样品2：用HIV-1急性感染的MT-4细胞，用本发明的最大无毒浓度(MNC)0.01mM的化合物1处理。
该研究的结果在表5中给出。
实施例8.含有20％7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)- 4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的本发明粉剂剂型组合物的制备
组合物(100g的粉末)
-------------------------------------
(1)20.00g化合物1
(2)1.00g胶体二氧化硅
(3)10.00g木糖醇
(4)69.00g麦芽糖糊精
-------------------------------------
制备：将先前称重的成分(1-4)解团聚并在V-混合器中匀化15分钟。该产品呈白色至浅棕色细流动粉末的形式。这样的粉末可以被制粒以产生可以作为唯一最终剂型使用的各种尺寸的颗粒。
粉末或颗粒以散装形式或分散形式使用，其中称取正确的单次剂量填充到合适的容器中，例如小袋。
实施例9.每片含有100mg 7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃- 3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的本发明片剂剂型组合物的制备
组合物(1000g的片剂)
-------------------------------------
(1)100.00g化合物1
(2)6.00g甲基纤维素
(3)50.00g交联的聚乙烯吡咯烷酮
(4)15.00g硬脂酸镁
(5)829.00g乳糖一水合物
(6)基于适量使用原则(q.s.)的纯化水
-------------------------------------
制备：粉状化合物1和乳糖一水合物在V-混合器中匀化15分钟，随后用甲基纤维素水溶液造粒。湿物质被迫通过筛子并在烘箱中干燥颗粒。干燥后，将颗粒与聚乙烯吡咯烷酮和硬脂酸镁混合，并在V-混合器中匀化15分钟。将所得混合物压制成片芯。片剂含量：每片100mg±15％化合物1。
实施例10.每个胶囊含有25mg7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡 喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的本发明胶囊剂型组合物的制备
组合物(1000g均质混合物的胶囊填料)
-------------------------------------
(1)62.50g化合物1
(2)10.00g硬脂酸镁
(3)927.50g玉米淀粉
-------------------------------------
制备：将先前称重的成分(1-3)解团聚并在V-混合器中匀化20分钟。由此获得的均匀粉末使用手动胶囊填充机填充到尺寸为1的植物(HPMC)无色胶囊中。获得的胶囊平均重量为400mg。胶囊含量：每个胶囊25mg±15％的化合物1。
实施例11.含有2％7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)- 4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的本发明糖浆悬浮液剂型组合物的制备
组合物(100g糖浆)
-------------------------------------
(1)2.00g化合物1
(2)5.00g甘油
(3)30.00g蔗糖
(4)0.50g山梨酸钾
(5)0.25g苯甲酸钠
(6)1.00g柠檬酸，无水
(7)0.80g黄原胶
(8)0.10g柠檬味香料
(9)60.35g纯化水
(10)基于适量使用原则(q.s.)的1％酒石黄染料水溶液
-------------------------------------
制备：将山梨酸钾，苯甲酸钠和甘油溶解在纯化水中，在室温下搅拌10分钟。然后添加黄原胶和蔗糖，在40-50℃下搅拌溶解15-20分钟。然后，添加化合物1并搅拌10分钟使其均匀。之后，添加橙味香料，柠檬酸和少量的酒石黄染料的水溶液，并搅拌30分钟从40℃至室温，使得到的浆液均匀化。产品呈黄色粘稠的橙味糖浆悬浮液形式。用标记声明：“使用前摇匀”。
实施例12.含有3％(w/w)7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3- 基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的本发明软膏剂型组合物的制备
组合物(100g软膏)
-------------------------------------
(1)3.00g化合物1
(2)3.00g羊毛脂醇
(3)2.00g鲸蜡硬脂醇
(4)20.00g矿物油，重的
(5)72.00g凡士林
-------------------------------------
制备：将凡士林，重矿物油，羊毛脂醇和鲸蜡硬脂醇的混合物在50℃-55℃下搅拌融化，直到获得澄清的淡黄色液体。然后加入化合物1，搅拌均匀，1小时内从50℃逐渐冷却至30℃-35℃，并在此温度下装入30ml罐中。由此得到的软膏为稍微有羊毛脂余味的淡黄色闭塞性油脂形式。
实施例13.含有2％(w/w)7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3- 基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的本发明乳膏剂型组合物的制备
组合物(100g乳膏)
-------------------------------------
(1)2.00g化合物1
(2)5.00g 1,2-丙二醇
(3)4.00g鲸蜡醇
(4)4.00g单硬脂酸甘油酯
(5)5.00g聚山梨醇酯60
(6)5.00g十六烷基棕榈酸酯
(7)10.00g肉豆蔻酸异丙酯
(8)0.25g柠檬酸，无水
(9)0.50g柠檬酸铵
(10)0.20g甲基4-羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸甲酯)
(11)0.10g丙基4-羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸丙酯)
(12)63.95g纯化水
-------------------------------------
制备：在70℃-75℃下，通过熔化肉豆蔻酸异丙酯，十六烷基棕榈酸酯，聚山梨醇酯60，单硬脂酸甘油酯和鲸蜡醇来制备油相。通过在45-50℃下在搅拌将对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，柠檬酸和柠檬酸铵溶解在纯化水和1,2-丙二醇的混合物中来制备水相。将由此获得的溶液加热至70℃
-75℃。然后在30分钟内将强烈搅拌的热水相(70℃-75℃)逐滴加入到油相(70℃-75℃)中。将混合物在70℃-60℃下搅拌30分钟，在60℃-50℃下再搅拌30分钟。这样得到的乳液通过搅拌进一步均化，在1小时内由50℃下降至25℃。将产品装入合适的容器中，例如，罐子或管子。该产品呈几乎无臭的轻油包水(O-W)乳膏。
实施例14.每个栓剂含有100mg 7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并 吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的本发明栓剂剂型组合物的制备
组合物(100g栓剂)
-------------------------------------
(1)3.50g化合物1
(2)96.50g氢化椰子油，型号Witepsol H15
-------------------------------------
制备：将Witepsol H15在40℃-45℃下搅拌融化，直到获得无色粘稠液体。然后，加入化合物1并在40℃-45℃下搅拌匀化15分钟。将如此得到的悬浮液填充到A3型(内容积3mL)的PE HD栓剂模具中，然后冷却并密封。该产品呈淡黄色硬质栓剂形式。分析显示每剂栓剂中化合物1的含量为100mg±10mg(10％)。这些栓剂可以用于阴道或直肠。
实施例15.含有0.01％7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3- 基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的本发明液体鼻腔喷雾剂型组合物的制备
组合物(100g的液体喷雾)
-------------------------------------
(1)0.01g化合物1
(2)0.90g氯化钠
(3)0.10g磷酸二氢钠
(4)0.05g磷酸氢钠
(5)0.05g乙二胺四乙酸二钠二水合物
(6)2.00g甘油
(7)96.89纯化水
-------------------------------------
制备：将氯化钠，磷酸钠，乙二胺四乙酸二钠二水合物添加到水和甘油的混合物中，在室温下搅拌溶解15分钟。然后，加入化合物1并在室温下搅拌均化30分钟。由此获得的溶液通过以下过滤：
(1)1.2μm的聚丙烯(PP)过滤器；
(2)0.2μm过滤器以减少生物负荷；和
(3)通过0.1μm过滤器。
该产品呈淡黄色几乎无臭的液体形式。分析显示化合物1的含量为0.1mg/ml±10％。将该溶液填充到含有喷雾装置的10ml塑料(PE-HD)瓶中，或者替代地装入用于通过吸入装置给药的鼻用或口服(肺)气雾剂的容器。
结论
A.7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)是新的、以前未知的化合物，其特征是具有意义深远的抗病毒(HIV-1)活性：
B.据我们所知，最接近的现有技术结构类似物是7,8-二羟基-3-(4,6,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(2)，在参考文献6中公开：
C.本发明公开的实验结果强烈支持权利要求：化合物1显示出比现有技术的对照化合物2显著的更强抗病毒(HIV-1)活性。这个说法被不同的抗病毒模式所证明：
(a)确定MT-4细胞系中针对HIV-1病毒的细胞保护百分比(％)；结果见表2和表3；和
(b)通过利用FDA批准的实时PCR试验进行HIV-1的体外定量测定实验，进而测量病毒载量，进行抗病毒分析；结果见表5。
此外，推测为通过抑制逆转录酶(RT)的化合物1和2(结果参见表4)的潜在抗病毒作用机理的研究表明，本发明的化合物1是强的RT抑制剂，而来自现有技术的对照化合物2是次要的或完全失活的RT抑制剂。
D.总之，本发明的化合物1的特征在于比现有技术中的化合物2具有更强的抗病毒(HIV-1)活性，同时其基于不同的机制。化合物1的抗病毒活性可能涉及RT抑制作为其作用的主要方式。
以这种方式，这些事实支持权利要求，本发明的化合物1出乎意料地是比最接近的现有技术中对照化合物2更有效的抗病毒剂。
因此，化合物1，其制备方法，药物组合物和用途是具有创造性的。
工业应用
化合物7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)或其药学上可接受的盐或水合物作为活性药物成分(API)用于生产通过本发明公开的组合物。组合物用于制造治疗病毒感染和病毒引起的疾病的药物，包括由1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。

Claims (10)

1.一种式(1)化合物，该化合物为7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮，或其药学上可接受的盐或水合物。
2.一种制备7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的方法，其中该方法包括在-20℃至+100℃下，4,5,7-三羟基-2H-苯并吡喃-2-酮(5)与乙二醛(6)在惰性反应溶剂中产生化合物1。
3.根据权利要求2所述的一种制备7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的方法，其中惰性反应溶剂选自丙酮，四氢呋喃，1,4-二恶烷，二异丙醚，二氯甲烷。
4.根据权利要求3所述的一种制备7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮(1)的方法，其中在75℃时惰性反应溶剂选择丙酮。
5.一种药物组合物，其包含：
(1)作为活性药物成分的7,9-二羟基-3-(4,5,7-三羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基)-4H-呋喃并[3,2-c]苯并吡喃-4-酮或其药学上可接受的盐或水合物；和
(2)一种或多种药物赋形剂，其需要产生适于治疗性给药的最终剂型。
6.权利要求1所述的化合物，或权利要求5所述的其药物制剂在治疗人和动物的病毒感染和病毒引起的疾病中的应用。
7.根据权利要求6所述的权利要求1所述的化合物，或权利要求5所述的药物制剂在治疗中的应用，其中病毒感染和病毒引起的疾病是由一种或多种选自以下的病毒引起的：肠道病毒A-J；鼻病毒A-C；轮状病毒A-C；诺如病毒；流感病毒A-C及其分型，例如H1N1，H2N2，H3N2，H5N1，H7N7，H1N2，H9N2，H7N2，H7N3，H10N7，H7N9；人乳头瘤病毒；多瘤病毒如约翰·坎宁安病毒和默克尔细胞病毒；痘病毒；疱疹病毒如人单纯疱疹病毒1，人单纯疱疹病毒2，水痘带状疱疹病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒或人疱疹病毒4；人巨细胞病毒，和卡波西肉瘤相关疱疹病毒；甲型肝炎A-C病毒；SARS冠状病毒；埃博拉病毒；马尔堡病毒；版纳病毒；风疹病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；人副流感病毒；狂犬病病毒和环状病毒。
8.根据权利要求6所述的权利要求1所述的化合物或权利要求5所述的药物制剂在治疗中的应用，其中病毒引起的疾病是选自以下组中的一种：
(i)非癌症疾病：肠炎，普通感冒，胃肠炎，腹泻，胃肠炎，流感，进行性多灶性白质脑病，肾病，梅克尔细胞癌，天花，疱疹，水痘，带状疱疹，传染性单核细胞增多症，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，严重急性呼吸系统综合症，埃博拉，马尔堡病毒疾病，发热和脑炎，风疹，麻疹，腮腺炎，副流感，狂犬病；
(ii)病毒相关的癌症疾病：何杰金氏淋巴瘤，鼻咽癌，伯基特氏淋巴瘤，粘液表皮样癌，肝细胞癌；宫颈癌，肛门癌，阴茎癌，阴道癌和口咽癌；原发性渗出性淋巴瘤，卡波西肉瘤；
(iii)与各种病毒相关的自身免疫性疾病：皮肌炎，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，多发性硬化症，舍格伦综合征。
9.根据权利要求6所述的权利要求1所述的化合物或权利要求5所述的药物制剂在治疗中的应用，其中病毒感染是人类免疫缺陷病毒感染。
10.根据权利要求6所述的权利要求1所述的化合物或权利要求5所述的药物制剂在治疗中的应用，其中病毒感染是人类免疫缺陷病毒1型感染。
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