CN110368463A - 一种治疗人乳头瘤病毒hpv感染的中药组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药组合物，具体公开了一种治疗人乳头瘤病毒HPV感染的中药组合物及其制备方法与应用。所述中药组合物的有效成分或活性成分来自于如下原料药：桃儿七、厚朴、虎杖、落地生根、甘草、地肤子、鸦胆子、土茯苓和积雪草。本发明结合临床治疗效果，并结合尖锐湿疣动物模型试验，对组方中的各原料药用量进行不断调整，充分发挥中医方剂中各原料药的配伍增效作用。本发明所提供的中药组合物，可有效清除HPV病毒，对HPV低危感染与HR‑HPV阳性伴宫颈鳞状上皮内瘤变低度病变具有显著的治疗作用，并可提高朗格汉斯细胞的数量，从而提高机体的免疫力。

Description

一种治疗人乳头瘤病毒HPV感染的中药组合物及其制备方法 与应用

技术领域

本发明涉及中药组合物，具体地说，涉及一种治疗人乳头瘤病毒HPV感染的中药组合物及其制备方法与应用。

背景技术

HPV即人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，简称HPV)，是一种最小的DNA病毒，主要感染上皮细胞，人是唯一的宿主。到目前为止，经由病毒DNA序列比对，已经鉴定200种以上的HPV亚型。

HPV主要感染宿主的上皮细胞和组织内层细胞，依据感染组织形态可区分为表皮型和粘膜型两种，表皮型主要引起手、脚上皮感染；粘膜型则造成口腔、喉咙、呼吸道和生殖泌尿道感染。HPV主要引起的疾病有：1、尖锐湿疣，多发于男女生殖器、肛周等部位；2、扁平疣寻常疣，多发于面、手、足等部位；3、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌。西医治疗HPV感染主要使用干扰素药物治疗及手术治疗，具有一定创伤性，会影响到患者的机体功能并增加患者的心理负担；HPV感染引起的尖锐湿疣临床治疗方法主要有激光、冷冻、微波、光动力、外用腐蚀剂、干扰素、手术切除等。但是常规的治疗方法常常有局限性，比如说特殊部位的处理、潜伏病毒不易清除。

HPV病毒具有严格的宿主特异性，人是HPV病毒的唯一宿主。HPV病毒既无法在体外培养，又不能在其他动物身上致病，故而为其防治药物的开发和验证带来了极大的困难。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种治疗人乳头瘤病毒HPV感染的中药组合物及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种治疗人乳头瘤病毒HPV感染的中药组合物，所述中药组合物的有效成分或活性成分来自于如下原料药：桃儿七、厚朴、虎杖、落地生根、甘草、地肤子、鸦胆子、土茯苓和积雪草；

或，所述中药组合物的原料药包括：桃儿七、厚朴、虎杖、落地生根、甘草、地肤子、鸦胆子、土茯苓和积雪草。

由于中医对某一疾病的治疗通常为复合配方为主，各味药之间存在配合关系，这种配合关系可以为“相生”，相互增加各自独有的疗效，或降低、消除毒副作用；也可能为“相畏”，相互消弱或完全抵消各自原有的功效；也可能为“相杀”，不仅抵消原有功效，还极可能引出毒素。

本发明基于中药配伍的多种考量，经过多年反复探索，挑选出上述9味原料药进行配合，结合临床治疗效果，并首次结合尖锐湿疣动物模型试验，并对配量进行不断调整，充分发挥中医方剂中各药物的配伍增效作用，从而获得本发明所提供的配方。

进一步地，所述中药组合物的原料药按质量份计包括：桃儿七8-22份、厚朴7.5-30份、虎杖7.5-30份、落地生根10-40份、甘草3-20份、地肤子10-40份、鸦胆子2.5-10份、土茯苓20-55份、积雪草5-20份。

可选地，所述中药组合物的原料药按质量份计包括：所述中药组合物的原料药按质量份计包括：桃儿七14-16份、厚朴17-19份、虎杖17-19份、落地生根24-26份、甘草10-11份、地肤子24-26份、鸦胆子6-7份、土茯苓36-38份、积雪草12-13份；

优选为桃儿七15份、厚朴18份、虎杖18份、落地生根25份、甘草11.5份、地肤子25份、鸦胆子6.5份、土茯苓37.5份、积雪草12.5份。

更进一步地，所述中药组合物的剂型为乳膏剂、软膏剂或酊剂，既可为涂抹剂也可为帖剂。

在本发明的具体实施方式中，作为一种示例性说明，所述中药组合物的剂型为酊剂。术语“酊剂”，指把生药浸在酒精里或把化学药物溶解在酒精里而成的药剂。

第二方面，本发明提供了所述中药组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)醇提浓缩：

称取桃儿七、鸦胆子、虎杖、土茯苓、积雪草和落地生根，使用60％-100％乙醇进行提取，并对醇提取液进行浓缩，获得醇提浓缩液；

(2)水煮浓缩：

称取厚朴、甘草和地肤子，通过水煮提取，并对水提取液进行浓缩，获得水煮浓缩液；

(3)将所得醇提浓缩液和水煮浓缩液混合，加入38％乙醇调配，即得。

在本发明的具体实施方式中，作为一种示例性说明，所述浓缩和调配分别为将醇提取液浓缩至125质量份，将水提取液浓缩至90质量份，将二者混合，加入785质量份的38％乙醇进行调配，获得总质量份为1000份的成品中药组合物。所述质量份与前述中药组合物的原料药质量份相对应。

需要说明的是，本发明提供的浓缩和调配方式为一种较佳的实施方案，在实际应用中，也可根据实际需要对其进行调整，在不改变本发明中药组合物配方的情况下，均属于本发明的保护范围。

在步骤(1)中，可将桃儿七、鸦胆子、虎杖、土茯苓、积雪草和落地生根6味药一同进行乙醇提取，或可将该6味药分别进行乙醇提取，又或可先将该6味药分别进行乙醇提取之后再合并进行乙醇提取。

进一步地，为了更快更高质量地对原料药中的活性成分/有效成分进行提取，本发明对原料药的提取工艺进行了反复探索与优化，改进提取工艺如下：

积雪草用12倍量的60％乙醇，在室温，150W超声条件下提取1h，再浸泡时间15h，可使积雪草甘的提取量达到7mg/g。

虎仗用6倍量的无水乙醇，在80℃、200W超声波功率的超声条件下提取45min，虎杖白藜芦醇的提取率可达到9.4mg/g。

土茯苓用20倍量的60％乙醇，浸泡6h，在80℃、250W超声条件下提取30min，连续提取3次，合并滤液浓缩，可使土茯苓中总黄酮百分含量达到27.2mg/g。

桃儿七用10倍量的80％乙醇，在80-85℃下回流提取2次，每次2h，鬼臼毒素的总提取率可达86.62％，提取液中的含量可达9.57％。

鸦胆子粉碎成粗粉，分别用6倍、5倍、5倍量用95％乙醇热回流提取3次，每次1小时，鸦胆子出油率可达10.62％。

基于上述优化后的改进工艺，优选采用如下方法对需进行醇提取的6味原料药进行有效成分的提取：

将积雪草用12倍量的60％乙醇，在室温、150W超声条件下提取1h，获得提取液；

将虎仗用6倍量的无水乙醇，在80℃、200W超声波功率的超声条件下提取45min，获得提取液；

将土茯苓用20倍量的60％乙醇，在80℃、250W超声条件下提取30min，连续提取3次，合并提取液；

将落地生根用2倍量的95％乙醇，在室温、200W超声条件下提取45min，连续提取3次，合并提取液；

将桃儿七用10倍量的80％乙醇，在80-85℃下回流提取2次，每次2h，合并提取液；

将鸦胆子粉碎成粗粉，分别用6倍、5倍、5倍量的95％乙醇热回流提取3次，每次1小时，获得提取液；

合并上述6味经乙醇提取过的药材，用95％乙醇浸泡5天，提取其他有效成分，获得提取液；

将上述各味药分别获得的提取液，与合并后利用95％乙醇浸提的提取液合并，在65℃，-0.09MPa条件下浓缩至125质量份，获得醇提浓缩液。

同样作为优选，在步骤(2)中，称取厚朴、甘草和地肤子，合并，加入8-10倍量的水，水煮三次，时间分别为2h、1.5h、1h，合并提取液，在65℃，-0.09MPa条件下浓缩至90质量份，获得水煮浓缩液。

第三方面，本发明对所述中药组合物经过临床治疗实验，并首次结合尖锐湿疣动物模型实验，发现了其在清除HPV病毒，提高朗格汉斯细胞的数量，提高机体免疫力方面的作用，以及对HPV低危感染与HR-HPV阳性伴宫颈鳞状上皮内瘤变低度病变的治疗作用。

因此，本发明还进一步提供了所述中药组合物在预防/治疗人乳头瘤病毒HPV感染方面的应用；以及其在提高动物体免疫力方面的应用。

基于上述研究成果，本发明提供了所述中药组合物在制备治疗人乳头瘤病毒HPV感染药物方面的应用；在制备预防人乳头瘤病毒HPV感染药物方面的应用；以及在提高朗格汉斯细胞数量方面，或在制备提高动物体免疫力药物方面的应用。

需要说明的是，所述中药组合物的制药用途与其在提高动物体免疫力方面的用途，不属于“疾病的诊断与治疗方法”，提高免疫力并不一定意味着对疾病具有治疗作用。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的乙醇百分比均指体积百分比，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到多种具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明首次采用尖锐湿疣移植的裸鼠动物模型从药物对模型病患部位病毒载量的影响、对小鼠血液抗病毒细胞因子的影响、对病变组织细胞分布的影响等多方面验证了药物的有效性。

本发明基于中药配伍的多种考量，经过多年反复探索，提供了一种治疗人乳头瘤病毒HPV感染的中药组合物配方，结合临床治疗效果，并结合尖锐湿疣动物模型试验，对配量进行不断调整，充分发挥中医方剂中各药物的配伍增效作用。

本发明还对原料药的提取工艺进行了优化与改进，能够更快更高质量地对原料药中的有效成分进行提取。

本发明所提供的中药组合物，可有效清除HPV病毒，提高朗格汉斯细胞的数量，从而提高机体免疫力，并对HPV低危感染与HR-HPV阳性伴宫颈鳞状上皮内瘤变低度病变具有显著的治疗作用。

附图说明

图1为本发明实验例1中免疫组织化学技术检测过程示意图。

图2为本发明实验例1中各实验组小鼠血液种IFN-γ因子的水平比较。

图3为本发明实验例1中不同药物治疗组对小鼠疣体组织中HPV病毒的清除作用比较。

图4为本发明实验例1中不同药物治疗组经药物治疗后小鼠疣体组织中空泡细胞的数量比较。

图5为本发明实验例1中通过免疫组织化学染色检测CD207分子所反映的LCs在小鼠疣体组织内的分布。

图6为本发明实验例1中不同药物治疗组经药物治疗后小鼠疣体组织中朗格汉斯细胞的数量比较。

图中，咪喹莫特代表咪喹莫特治疗组，IFN-a-2b代表重组人干扰素α-2b喷雾剂(假单胞菌)治疗组，中药组合物(1：2)代表中药组合物治疗组(浓度为1：2)，中药组合物(1：20)代表中药组合物治疗组(浓度为1：20)，三白洗液代表三白洗剂治疗组，除疣煎液代表除疣煎液治疗组。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1中药组合物及其制备

1、原料

按质量份计：桃儿七15份、厚朴18份、虎杖18份、落地生根25份、甘草11.5份、地肤子25份、鸦胆子6.5份、土茯苓37.5份、积雪草12.5份。

2、制备方法

(1)醇提浓缩：

称取桃儿七、鸦胆子、虎杖、土茯苓、积雪草、落地生根。

将积雪草用12倍量的60％乙醇，在室温、150w超声条件下提取1h，获得提取液，处理过的药材备用；

将虎仗用6倍量的无水乙醇，在80℃、200W超声波功率的超声条件下提取45min，获得提取液，处理过的药材备用；

将土茯苓用20倍量的60％乙醇，在80℃、250w超声条件下提取30min，连续提取3次，合并提取液，处理过的药材备用；

将落地生根用2倍量的95％乙醇，在室温、200W超声条件下提取45min，连续提取3次，合并提取液，处理过的药材备用；

将桃儿七用10倍量的80％乙醇，在80-85℃下回流提取2次，每次2h，合并提取液，处理过的药材备用；

将鸦胆子粉碎成粗粉，分别用6倍、5倍、5倍量的95％乙醇热回流提取3次，每次1小时，获得提取液，处理过的药材备用；

合并上述6味处理过的药材，用95％乙醇浸泡5天，提取其他有效成分，获得提取液。

将上述各味药分别获得的提取液，与合并后利用95％乙醇浸提的提取液合并，在65℃，-0.09MPa条件下浓缩至125质量份，获得醇提浓缩液。

(2)水煮浓缩：

称取厚朴、甘草和地肤子，合并，加入8-10倍量的水，水煮三次，时间分别为2h、1.5h、1h，合并提取液，在65℃，-0.09MPa条件下浓缩至90质量份，获得水煮浓缩液。

(3)将醇提浓缩液和水煮浓缩液混合，加入785质量份的38％乙醇获得1000质量份的成品，剂型为酊剂。

实施例2中药组合物及其制备

本实施例与实施例1的区别在于：

原料药按如下质量份称取：桃儿七8份、厚朴30份、虎杖7.5份、落地生根40份、甘草3份、地肤子40份、鸦胆子2.5份、土茯苓55份、积雪草5份。

制备方法与实施例1相同。

实施例3中药组合物及其制备

本实施例与实施例1的区别在于：

原料药按如下质量份称取：桃儿七22份、厚朴7.5份、虎杖30份、落地生根10份、甘草20份、地肤子10份、鸦胆子10份、土茯苓20份、积雪草20份。

制备方法与实施例1相同。

实验例1中药组合物对尖锐湿疣动物模型的疗效与机制研究

1.实验材料

1.1实验试剂

(1)实施例1制备的中药组合物(酊剂)(后文简称中药组合物)；

(2)咪喹莫特乳膏(市售可得)；

(3)重组人干扰素α-2b喷雾剂(市售可得)；

(4)除疣煎液(市售可得)；

(5)三白洗剂(市售可得)。

1.2实验动物

饲养SPF级、雌性，鼠龄4-6周，体重15-20g，随机分成8组(每组5只，1只/笼)，分别为：

(1)空白对照组；

(2)阴性对照组；

(3)-(8)药物治疗组(3)咪喹莫特治疗组，(4)中药组合物治疗组(浓度为1：2)，(5)中药组合物治疗组(浓度为1：20)，(6)三白洗剂治疗组，(7)除疣煎液治疗组，(8)重组人干扰素α-2b喷雾剂(假单胞菌)治疗组。

将饲养动物的房间维持在18-26℃，湿度维持在40-70％，采用自然昼夜照明，确保动物室条件始终稳定。饲料为鼠专用颗粒饲料(由天津奥易德实验用品有限公司提供)，自由进食饮水。

其中，所述空白对照组的实验对象为健康、正常的实验动物，所述阴性对照组与所述药物治疗组的实验对象为利用实验动物构建得到的尖锐湿疣动物模型，所述尖锐湿疣动物模型的构建方法如下：

(1)将临床手术获得的疣体放入含有乳酸林格氏液的EP管中，将EP管至于冰盒中，迅速转运至实验室；

(2)疣体的处理：将疣体放在加入10mL 100×青链霉素的4mL D-hanks溶液中，摇匀；将尖锐湿疣组织用游标卡尺测量剪成若干大小为0.5cm×0.5cm×0.5cm的组织块，将组织块置于混合溶液中浸泡45min；

(3)疣体的移植：1％戊巴比妥钠按50mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，用75％的酒精对小鼠的右侧背部进行三次消毒；无菌手术刀片在裸鼠右侧背部切开皮肤，用无菌镊子夹持疣体，埋入皮肤内，固定；手术线缝合。3周后，尖锐湿疣动物模型构建成功。

2.实验方法

2.1药物处理

对药物治疗组(3)-(8)使用相应的药物进行处理，将药物外涂于裸鼠动物模型的背部移植区，用药频次为一日两次。

其中，药物治疗组(4)和(5)的上药方法为：用棉签蘸取酊剂在裸鼠动物模型的背部移植区薄薄涂抹一层。

药物处理进行2周后处死实验动物，取移植处皮肤泡入福尔马林溶液。取小鼠眶静脉、眶动脉血于5mL灭菌EP管中，放入离心机室温3500rpm/min离心5min，取上清液，存放至-80℃冰箱备用。

2.2疣体样本总RNA进行提取

采用Amyjet Scientigic公司的总RNA提取试剂盒对各实验组小鼠的疣体组织提取组织总RNA，整个实验流程都遵守试剂盒的说明书进行操作。

RNA浓度检测是RNA原液和无酶水以2μL：48μL的比例混匀在比色皿中，然后用分光光度计检测RNA浓度及A/OD，介于1.8-2.0之间视为高纯度，记录下检测到的RNA浓度。最后将检测完毕的RNA样本存放至-80℃低温冰箱中或着在逆转录后放于-20℃中保存。

2.3逆转录合成cDNA

逆转录RNA总质量为3μg体系，根据这个质量体系计算逆转录所需要的RNA原液体积；每一无酶EP管反应体系中加入13μL的荧光底物5×NI-RT Master Mix试剂按顺序；最后加入无酶水补足至20μL；所有的操作都在冰上操作；

然后将离心管管内的混合液振荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液全部收集至管底，再按照以下步骤进行反应：

待反应结束后，短暂离心，放置冰上冷却。逆转录产物cDNA可直接用于PCR反应，或置于-20℃存。

2.4通过PCR检测HPV病毒载量

HPV病毒载量通过硕世21HPV分型定量检测系统(硕世生物科技有限公司)检测。采用多重荧光定量PCR技术，在2.5小时内迅速定量检测反转录的cDNA样本中的HPV病毒载量(copies)。

2.5动物实验的HE染色实验过程

遵循现有技术常规方法进行：组织的脱水和透明—浸蜡包埋—切片、粘片及烤片—脱蜡—染色—脱水透明封片—进行镜检。

2.6免疫组织化学技术检测过程

遵循现有技术常规方法进行，如图1所示。

2.7炎性因子检测

(1)准备IFN-γ标准品：

稀释液41(MSD超敏多因子电化学发光仪中的自带稀释液，产品货号R50AH-1)加1mL到IFN-γ标准品中，充分振荡，室温放置15-20min，作为最高的浓度点，依次做4倍稀释；

(2)准备检测抗体稀释液：吸取检测抗体60μL，并用稀释液45(MSD超敏多因子电化学发光仪中的自带稀释液，产品货号R50AH-1)补足3mL体积；

准备清洗液：配置1×的PBS(0.05％吐温-20)待用；

准备读板液：配置2×的读板液；

(3)清洗MSD板3次，每次150μL的清洗液；

(4)每孔加入50μL的样本和标准品，并用封口膜封上，室温振荡2小时；

(5)清洗MSD板3次，每次150μL的清洗液；

(6)每孔加入配置好的25μL检测抗体，并用封口膜封上，室温振荡2小时；

(7)清洗MSD板3次，每次150μL的清洗液；

(8)每孔加入150μL配置好的读板液，上机检测。

3.实验结果

3.1小鼠血液中细胞IFN-γ因子的水平

如图2所示，空白对照组和阴性对照组IFN-γ因子的水平最低，比较接近，而六个药物治疗组的IFN-γ因子水平明显高于空白对照组和阴性对照组，且从高到低依次为中药组合物治疗组(浓度为1：2)(P<0.001)、除疣煎液治疗组、中药组合物治疗组(浓度为1：20)(P<0.001)、咪喹莫特治疗组(P<0.001)、重组人干扰素α-2b喷雾剂(假单胞菌)治疗组(P<0.01)和三白洗剂治疗组(P<0.01)。

图2还对六个药物治疗组的IFN-γ因子水平相互比较的结果进行了分析，可以看到中药组合物治疗组(浓度为1：2)的IFN-γ因子水平最高，并且与咪喹莫特治疗组、重组人干扰素α-2b喷雾剂(假单胞菌)治疗组和三白洗剂治疗组比较结果有统计学意义(分别为P<0.01，P<0.01，P<0.01)；中药组合物治疗组(浓度为1：20)的IFN-γ因子水平在六个药物治疗组中也比较高，并且和咪喹莫特治疗组、重组人干扰素α-2b喷雾剂(假单胞菌)治疗组和三白洗剂治疗组比较结果有统计学意义(分别为P<0.01，P<0.01，P<0.01)。

3.2药物治疗前后HPV病毒载量的变化

本实验例将种植疣体的小鼠(尖锐湿疣动物模型)进行了7组不同的处理(不进行药物治疗的阴性对照组，和6个药物治疗组)，每组五个重复样本，处理结束后取出小鼠皮下的疣体组织，通过多重PCR技术进行了HPV病毒载量检测，统计学分析结果提示量与阴性对照组相比，经过咪喹莫特、重组人干扰素α-2b喷雾剂(假单胞菌)、中药组合物(浓度为1：20)、中药组合物(浓度为1：2)、三白洗剂和除疣煎液治疗后，HPV病毒载均明显降低，见下表：

表1

而其中咪喹莫特治疗组、中药组合物治疗组(浓度为1：20)、中药组合物治疗组(浓度为1：2)和除疣煎液治疗组的差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.05)，而重组人干扰素α-2b喷雾剂(假单胞菌)治疗组、三白洗剂治疗组与阴性对照组相比差异没有统计学意义。

因此认为，咪喹莫特、本发明所述中药组合物和除疣煎液都具有清除HPV病毒的作用，并且本发明所述中药组合物对HPV的清除效果优于现有药剂咪喹莫特和除疣煎液(图3)。

3.3药物治疗对小鼠疣体组织中空泡细胞(Koilocyte cells)数量的影响

HPV病毒感染皮肤和皮下组织会在组织学中出现典型的改变，其中空泡细胞增多是一个明显的特征，因此空泡细胞的减少可以反映HPV病毒的清除效果。

本节通过观察和分析HE染色结果中空泡细胞的数量来比较不同药物对尖锐湿疣中HPV病毒的清除效果。

在每个组的3张切片组织的HE染色结果中，每张切片组织随机选取5个视野，每一组总共选取15个视野，统计每个视野的空泡细胞数量，做成柱状图，并对各个组的结果进行量化分析，结果见图4。

结果发现，与HE染色图片直接观察到的结果一致，空白对照组中并没有发现空泡细胞，而阴性对照组的空泡细胞是最多的，而六个药物治疗组的空泡细胞数量与阴性对照组比较，从多到少分别为重组人干扰素α-2b喷雾剂(假单胞菌)治疗组、三白洗剂治疗组、中药组合物治疗组(浓度为1：20)、除疣煎液治疗组、咪喹莫特治疗组、中药组合物治疗组(浓度为1：2)(P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.001，P<0.001，P<0.001)。

因为空泡细胞的数量可以反映这些药物尖锐湿疣中HPV病毒的清除效果，所以我们在六个治疗组的HE量化结果分析中与HPV病毒载量的结果相比较，结果发现在HE结果中，中药组合物治疗组(浓度为1：2)的空泡细胞数量最少，并且与重组人干扰素α-2b喷雾剂(假单胞菌)治疗组、中药组合物治疗组(浓度为1：20)、三白洗剂治疗组、除疣煎液治疗组的结果比较有统计学意义(P<0.001，P<0.001，P<0.05，P<0.001)，这说明它对HPV病毒的清除作用最强，并且重组人干扰素α-2b喷雾剂(假单胞菌)空泡细胞数量最多，也说明它对HPV病毒的清除作用最弱，这个结果与HPV病毒载量检测的结果也是一致的。

3.4通过免疫组化染色发现六种药物治疗后增加了疣体朗格汉斯细胞(LCs，Langerhans cells)的数量

过免疫组织化学染色检测CD207分子来反映LCs在小鼠疣体组织内的分布。如图5所示，黑色箭头指向的是LCs，可以从免疫组化结果的图片中直接观察到，空白对照组和阴性对照组LCs的数量较少，而六个治疗组的LCs数量显着高于空白对照组和阴性对照组。

和前述3.3中的HE结果分析方法类似，在每个组的3张切片组织的免疫组化染色结果中每张切片组织随机选取3个视野，每一组总共9个视野，统计每个视野的空泡细胞数量，做成柱状图，并对各个组的结果进行量化分析，结果见图6。

结果发现，空白对照组的LCs数量少于阴性对照组(5.33±0.94vs6.33±1.25)，六个药物治疗组的LCs数量显着高于空白对照组和阴性对照组，其中与阴性对照组比较，药物治疗组LCs数量从多到少分别是：咪喹莫特治疗组(28±1.70，P<0.001)，中药组合物治疗组(浓度为1：2)(24±1.63，P<0.01)，中药组合物治疗组(浓度为1：20)(21±1.25，P<0.01)，重组人干扰素α-2b喷雾剂(假单胞菌)治疗组(14±1.70，P<0.05)，除疣煎液治疗组(13±2.05，P<0.05)，三白洗剂治疗组(1±0.82，P<0.01)。

尽管在免疫组化结果中咪喹莫特的效果最强，但是本发明所述中药组合物的效果仅次于咪喹莫特，且浓度为1：2的中药组合物治疗组的LCs数目也显著高于除了咪喹莫特治疗组之外的其他药物治疗组。因此认为，在免疫作用中咪喹莫特和中药组合物的效果是优于其他药物的。

实验例2中药组合物治疗HPV低危感染(尖锐湿疣)

1.实验样本

选择20-65岁男、女外生殖器部位尖锐湿疣共100例，分为实验组50例与对照组50例。

2.实验方法

实验组：用棉棒蘸取本发明实施例1所制备的中药组合物(酊剂)涂于皮损部位，每日2次，连续使用3天，停4天，7天为一疗程。连续使用4个疗程去除皮损及亚临床病毒。

对照组：用棉棒将5％咪喹莫特乳膏涂于皮损部位，每日1次，连用5天为一疗程，共使用8周。

分别与疗程结束后观察两组的脱疣效果。

3.实验结果

实际完成受试者100例，实验组50例，对照组50例。

3.1疗程结束有效率比较

有效：疣体完全脱落，并通过HPV分型检测病毒标志物，能够有效清除HPV；

无效：疣体未脱落，或通过HPV分型检测病毒标志物，未有效清除HPV。

表2：两种不同药物疗程结束尖锐湿疣治疗有效率比较

	总例数	有效	无效
				实验组	50	44	6
对照组	50	8	42

通过对本发明所提供的中药组合物与现有药物咪喹莫特乳膏的比较可以看出，本发明所提供的中药组合物在治疗尖锐湿疣方面效果显著，有效率高。

实验例3中药组合物作用于HR-HPV持续感染引发的宫颈鳞状上皮内瘤变低度病变的观察

1.实验样本

由医院随机选择120例HR-HPV持续阳性，伴宫颈鳞状上皮内瘤变低度病变(CIN1)。

所有病例均由基于PCR技术的HPV分型检测、液基细胞学(TCT)、阴道镜下组织病理学确诊。

将实验样本分为2组，实验组60例，对照组60例。

2.实验方法

实验组使用本发明实施例1制备的中药组合物(酊剂)宫颈局部给药，将3mL的所述中药组合物(酊剂)浸入带尾线无菌棉球上，内置于宫颈处，3小时后由患者自行取出。每日1次，连续使用3天，停4天为一疗程，共使用5个疗程(共计用药15次)。停药1个月后复查。

对照组使用辛复宁(重组人干扰素α2b阴道泡腾胶囊，市售可得)，每日1次1粒塞入阴道内，连续使用10天为一疗程，共使用3个疗程(共计用药30次)，停药1个月后复查。

3.实验结果

3.1HPV疗效判定

治愈：HPV转阴；

有效：HPV亚型减少或原亚型消失又出现新亚型；

无效：原亚型不变。

表3：两种不同药物疗程结束HPV转阴效果比较

	总例数	治愈	有效	无效
					实验组	60	49	7	4
对照组	60	29	13	18

3.2鳞状上皮内瘤变(CIN1)疗效判定

治愈：CIN1转阴

有效：CIN1降低为ASC-US。

无效：CIN原级别不变或升高。

表4：两种不同药物疗程结束CIN1转阴效果比较

4.实验结论

本发明所提供的中药组合物对HR-HPV阳性伴宫颈鳞状上皮内瘤变低度病变的治疗效果显著。

实验例4

本实验例通过调整厚朴、积雪草、落地生根的用量，比较中药组合物的效果差异。

组方1：桃儿七15份、厚朴6份、虎杖18份、落地生根12份、甘草11.5份、地肤子25份、鸦胆子6.5份、土茯苓37.5份、积雪草4份。

组方2：桃儿七15份、厚朴18份、虎杖18份、落地生根25份、甘草11.5份、地肤子25份、鸦胆子6.5份、土茯苓37.5份、积雪草12.5份。

利用组方1和组方2分别对HR-HPV持续感染引发的宫颈鳞状上皮内瘤变低度病变进行治疗，均于宫颈局部给药，将3mL的中药组合物(酊剂)浸入带尾线无菌棉球上，内置于宫颈处，3小时后由患者自行取出。每日1次，连续使用3天，停4天为一疗程，共使用5个疗程(共计用药15次)。停药1个月后复查。

跟踪并记录患者情况对比发现：

组方1的病例156例，出现4例临床使用后第一周出现体温升高较多，体温范围在37.8℃-38.4℃之间。体温升高持续2-3小时，由使用药物引起的发热率约为2.56％。

组方2的病例180例，出现1例临床使用后第一周出现体温升高，体温在37.5℃-38℃。体温升高持续1-2小时，由使用药物引起的发热率约为0.56％。

可见，增加厚朴、积雪草、落地生根组方量，能够降低临床不良反应发生率。

实验例5中药组合物安全性实验(腔道毒理研究)

本实验例用于评价本发明所述中药组合物通过阴道处理方式对家兔重复给药的毒性作用及恢复情况。

1.实验方法

选取4-5月龄、体重2.4-3.0kg的健康大耳雌性家兔15只，按照体重随机分为3个实验组，各实验组如下表所示：

表5

检查要点：

一般症状观察；给药部位刺激性；体重、摄食量测定；并于给药4周(每组2只)、给药13周(每组2只)、末次给药后2周(每组1只)对动物实施安乐死，采集血液进行血液学和血生化指标测定；进行大体解剖检查、脏器体重，并采集脏器进行组织病理学检测。

每次解剖前1天对动物进行尿液采集和尿液指标测定。

2.实验结果

表6

3.实验结论

低剂量组给药剂量相当于人体给药剂量的14.2倍；高剂量组给药剂量相当于临床的85.2倍。(低剂量组1mL/次/天，按体表面积折算相当于人临床拟用剂量1mL/次/天的14.2倍；高剂量组浓缩液3mL次/天，按体表面积折算相当于人临床拟用剂量1mL/次/天的85.2倍，算法参考徐淑云等《药理实验方法学》第三版，北京：人民卫生出版社，2003:1861)。

(1)本发明提供的中药组合物对实验动物的体重、摄食量、血液学指标、血生化、尿液分析、脏器系数无明显影响；

(2)阴道粘膜虽可见与供试品作用有关的病理改变，但在停止给药2周后即可恢复正常；其他脏器未见异常；

(3)连续给药可能会对活化部分凝血活酶时间产生影响，停药2周后该影响消失。

因此，本发明所提供的中药组合物，安全性良好。

本发明同时针对实施例2和实施例3提供的配方制备中药组合物，并对所得进行了如实验例1-实验例4的药效评价与安全性检验，实验结果证明，实施例2和实施例3所制备的中药组合物，在清除HPV病毒、治疗HPV低危感染、治疗HR-HPV阳性伴宫颈鳞状上皮内瘤变低度病变方面，与实施例1所制备的中药组合物具有相似且水平相当的作用，为了节约篇幅，在此不再赘述。

综上所述，本发明所提供的中药组合物，可有效清除HPV病毒，并能够显著提高朗格汉斯细胞的数量，从而提高机体免疫力，对HPV低危感染与HR-HPV阳性伴宫颈鳞状上皮内瘤变低度病变可实现有效且快速的治疗。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种治疗人乳头瘤病毒HPV感染的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物的有效成分或活性成分来自于如下原料药：桃儿七、厚朴、虎杖、落地生根、甘草、地肤子、鸦胆子、土茯苓和积雪草；

或，所述中药组合物的原料药包括：桃儿七、厚朴、虎杖、落地生根、甘草、地肤子、鸦胆子、土茯苓和积雪草。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物的原料药按质量份计包括：桃儿七8-22份、厚朴7.5-30份、虎杖7.5-30份、落地生根10-40份、甘草3-20份、地肤子10-40份、鸦胆子2.5-10份、土茯苓20-55份、积雪草5-20份。

3.根据权利要求2所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物的原料药按质量份计包括：桃儿七14-16份、厚朴17-19份、虎杖17-19份、落地生根24-26份、甘草10-11份、地肤子24-26份、鸦胆子6-7份、土茯苓36-38份、积雪草12-13份；

优选为桃儿七15份、厚朴18份、虎杖18份、落地生根25份、甘草11.5份、地肤子25份、鸦胆子6.5份、土茯苓37.5份、积雪草12.5份。

4.根据权利要求1-3任一项所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物的剂型为乳膏剂、软膏剂或酊剂。

5.权利要求4所述中药组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)醇提浓缩：

称取桃儿七、鸦胆子、虎杖、土茯苓、积雪草和落地生根，使用60％-100％乙醇进行提取，并对醇提取液进行浓缩，获得醇提浓缩液；

(2)水煮浓缩：

称取厚朴、甘草和地肤子，通过水煮提取，并对水提取液进行浓缩，获得水煮浓缩液；

(3)将所得醇提浓缩液和水煮浓缩液混合，加入38％乙醇调配，即得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将桃儿七、鸦胆子、虎杖、土茯苓、积雪草和落地生根6味药一同进行乙醇提取，或将该6味药分别进行乙醇提取，又或先将该6味药分别进行乙醇提取之后再合并进行乙醇提取；

作为优选，采用如下方法对该6味药进行乙醇提取：

将积雪草用12倍量的60％乙醇，在150W超声条件下提取1h，获得提取液；

将虎仗用6倍量的无水乙醇，在80℃、200W超声波功率的超声条件下提取45min，获得提取液；

将土茯苓用20倍量的60％乙醇，在80℃、250W超声条件下提取30min，连续提取3次，合并提取液；

将落地生根用2倍量的95％乙醇，在200W超声条件下提取45min，连续提取3次，合并提取液；

将桃儿七用10倍量的80％乙醇，在80-85℃下回流提取2次，每次2h，合并提取液；

将鸦胆子粉碎成粗粉，分别用6倍、5倍、5倍量的95％乙醇热回流提取3次，每次1小时，获得提取液；

合并上述6味经乙醇提取过的药材，用95％乙醇浸泡5天，提取其他有效成分，获得提取液；

将上述各味药分别获得的提取液，与合并后利用95％乙醇浸提的提取液合并，在65℃，-0.09MPa条件下浓缩至125质量份，获得醇提浓缩液。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，称取厚朴、甘草和地肤子，合并，加入8-10倍量的水，水煮三次，时间分别为2h、1.5h、1h，合并提取液，在65℃，-0.09MPa条件下浓缩至90质量份，获得水煮浓缩液。

8.权利要求1-4任一项所述的中药组合物在制备治疗人乳头瘤病毒HPV感染药物方面的应用。

9.权利要求1-4任一项所述的中药组合物在制备预防人乳头瘤病毒HPV感染药物方面的应用。

10.权利要求1-4任一项所述的中药组合物在提高朗格汉斯细胞数量方面，或在制备提高动物体免疫力药物方面的应用。