KR20170011863A - B형 간염 바이러스의 ｃｃｃＤＮＡ 형성 억제용 약학 조성물 - Google Patents

B형 간염 바이러스의 ｃｃｃＤＮＡ 형성 억제용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스 항체가 B형 간염 바이러스의 표면 항원(HBsAg)이 헤파란 황산 프로테오글라이칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하는 것을 방해함으로써 B형 간염 바이러스의 cccDNA의 형성을 억제한다는 것을 확인한 것에 기초한 것이다. 본 발명의 약학 조성물 및 B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 방법을 활용하면 만성 B형 간염을 근본적으로 치료할 수 있고 B형 간염 환자의 간이식 수술 후 간염 재발을 예방할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명에 따르면 cccDNA 형성 억제 여부 확인을 통해 B형 간염 예방 또는 치료용 물질을 새로이 동정(identify)할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, B형 간염 바이러스 항체와 병용투여 될 수 있는 치료 보조제를 새로이 동정(identify)할 수 있다.

Description

B형 간염 바이러스의 ｃｃｃＤＮＡ 형성 억제용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING cccDNA FORMATION OF HEPATITIS B VIRUS}
본 발명은 B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; HBV)는 헤파드나바이러스(Hepadnaviridae) 패밀리에 속하는 DNA 게놈을 갖는 바이러스로서, 급성 및 만성 간염을 유발한다. 전 세계 인구 중의 약 3.5억 명이 HBV 만성 감염자이며, 특히 한국 및 중국은 만성 감염자가 약 5~8%에 이른다. HBV의 만성 감염은 간염, 간경변 뿐만 아니라 간암을 유발하며 만성 감염자가 비감염자에 비해 간암 발생빈도가 약 300배 높게 나타나는데, WHO의 조사에 따르면 약 80%의 간암은 만성 B형 간염이 원인이라고 한다.
백신의 개발로 B형 간염의 예방이 일부 가능해졌으나, 일단 HBV가 간세포 내로 침투한 후에는 환자의 간세포로 침투한 HBV를 완전히 제거할 수 있는 방법이 없어 B형의 간염의 근본적인 완치는 현재로서는 매우 어렵다. 또한 B형 간염 환자가 건강한 간을 이식 받는 경우에 B형 간염의 재발률이 매우 높은데, 이는 완전히 제거되지 않고 남아있던 HBV가 이식받은 건강한 간세포 내로 침투하기 때문이다.
HBV가 간세포 내로 침투하면, 세포핵 내에 cccDNA(covalently closed circular DNA)를 형성하는데, 일단 형성된 cccDNA는 HBV 게놈 DNA 복제를 위한 주형으로 사용되어, 해당 간세포의 수명이 다 할 때 까지 계속해서 HBV를 생산하게 된다. 현재 사용되는 치료법으로는 HBV 게놈 DNA 복제를 억제함으로서 혈액 내에 HBV 형성을 억제할 수는 있지만 HBV의 복제를 원천적으로 막을 수는 없다.
따라서 HBV의 복제를 원천적으로 차단함으로써 근본적인 만성 B형 간염의 치료가 가능하고, B형 간염 환자의 간 이식 수술 후 간염 재발을 막을 수 있는 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물 및 이를 이용한 치료 방법의 개발이 절실하다.
등록특허공보 제0467706호 (2005. 1. 13) 등록특허공보 제1072895호 (2011.10.06.)
본 발명은 B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 위의 약학 조성물을 이용한 새로운 만성 B형 간염 치료 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 위의 약학 조성물을 이용하여, B형 간염 환자의 간 이식 수술 이후의 간염 재발의 예방 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
1. B형 간염 바이러스 항체를 포함하는, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물.
2. 위 1에 있어서, B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원(HBsAg)이 헤파란 황산 프로테오글라이칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하는 것을 억제하는, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물.
3. 위 1에 있어서, B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체 H 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 1의 아미노산 서열; 및 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 L 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물.
4. 위 1에 있어서, B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체 H 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 3의 아미노산 서열; 및 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 L 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물.
5. 위 1에 있어서, B형 간염 바이러스의 감염 시점으로부터 24 시간 이내에 투여되는, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물.
6. B형 간염 바이러스 항체의 유효량을 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 방법.
7. 위 6에 있어서, B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원(HBsAg)이 헤파란 황산 프로테오글라이칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하는 것을 억제하는, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 방법.
8. 위 6에 있어서, B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체 H 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 1의 아미노산 서열; 및 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 L 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 방법.
9. 위 6에 있어서, B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체 H 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 3의 아미노산 서열; 및 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 L 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 방법.
10. 위 6에 있어서, B형 간염 바이러스 항체를 B형 간염 바이러스의 감염 시점으로부터 24 시간 이내에 투여하는, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 방법.
11. 위 1의 조성물을 투여하여 B형 간염 바이러스의 게놈 DNA 복제를 차단하는 단계를 포함하는 만성 간염의 치료 방법.
12. 위 11에 있어서, 만성 간염은 만성 B형 간염인, 치료 방법.
13. 위 11에 있어서, 위 1의 조성물은 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체 H 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 1의 아미노산 서열; 및 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 L 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 B형 간염 바이러스 항체를 유효성분으로 포함하는 것인, 치료 방법.
14. 위 11에 있어서, 위 1의 조성물은 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체 H 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 3의 아미노산 서열; 및 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 L 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 B형 간염 바이러스 항체를 유효성분으로 포함하는 것인, 치료 방법.
15. 간세포에 B형 간염 바이러스를 접종하는 단계; 및 간세포에 대상 물질을 처리한 후 cccDNA 형성 억제 여부를 확인하는 단계를 포함하는, B형 간염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
16. 위 15에 있어서, 간세포는 HepG2-NTCP인, B형 간염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
17. 위 15에 있어서, 대상 물질은 B형 간염 바이러스를 접종한 후 24 시간 이내에 처리하는, B형 간염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
18. 위 15에 있어서, cccDNA 형성 억제 여부 확인은 (a) 대상 물질의 처리 시점으로부터 2 내지 10일 후 에피솜 DNA를 상기 간세포로부터 추출하는 단계; 및 (b) 에피솜 DNA에 포함된 cccDNA의 양을 측정하는 단계를 포함하여 수행되는, B형 간염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
19. 다음의 단계를 포함하는 B형 간염 치료 보조제의 스크리닝 방법: (a) B형 간염 바이러스가 포함된 생물학적 시료에 B형 간염 바이러스 항체 및 대상 물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) cccDNA 형성 억제 여부를 확인하여 상기 cccDNA의 형성이 상기 대상 물질을 접촉시키지 않은 경우에 비하여 감소하는 경우, 상기 대상물질을 상기 B형 간염 바이러스 항체와 병용투여될 수 있는 치료 보조제로 판단하는 단계.
본 발명에 따라, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성이 억제되면 HBV 게놈 DNA의 복제가 이루어지지 않으며, HBV의 재생산이 불가능해지므로, 아직 감염되지 않은 간세포로의 HBV 전파는 더 이상 일어나지 않는다.
한편, 이미 cccDNA가 형성된 간세포의 경우에는, 간세포의 수명(약 5개월)이 다 되어 사멸할 때 cccDNA도 같이 분해되어 없어지게 된다. 따라서 본 발명의 약학 조성물은 환자의 간세포로부터 HBV를 완전히 제거하여 만성 B형 간염을 근본적으로 완치하는 것을 가능하게 하고, B형 간염 환자의 간 이식 수술 이후에 간염이 재발하는 것 또한 근본적으로 차단할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 만성 B형 간염으로 인한 간경변 및 간암의 예방에도 효과가 있다.
또한 본 발명에 따르면, cccDNA 형성 억제 여부 확인을 통해 B형 간염 예방 또는 치료용 물질을 새로이 동정(identify)할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, B형 간염 바이러스 항체와 병용투여 될 수 있는 치료 보조제를 새로이 동정(identify)할 수 있다.
도 1은 써던 블롯 분석과 HBsAg ELISA를 통한 GC1102의 HBV 감염 억제 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 2는 면역 형광법 기법을 통한 GC1102의 HBV 감염 억제 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 3은 GC1102의 HBV cccDNA 형성 억제 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 4는 GC1102에 의한 HBV 감염 억제의 dose-response 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 GC1102의 EC50(effective concentration) 평가 결과를 나타낸다.
도 6은 GC1102(anti-HBsAg)의 처리 시점에 따른 HBV 감염 억제 효능 평가 결과를 나타낸다.
본 발명은 B형 간염 바이러스 항체를 포함함으로써 B형 간염 바이러스의 표면 항원(Hepatitis B surface antigen; HBsAg)이 간세포의 헤파란 황산 프로테오글라이칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하는 것을 억제하고, B형 간염 바이러스가 간세포 내로 침투하는 것을 차단하며, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성을 억제함을 확인한 것에 기초한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예는 B형 간염 바이러스 항체를 포함하는 B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물을 제공한다.
B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; HBV)는 헤파드나바이러스(Hepadnaviridae) 패밀리에 속하는 바이러스로 간세포에 침투하여 급성 및 만성 간염을 유발한다.
HBV의 생활사는 간세포 표면에 달라붙어 세포 내로 들어오는 침투 과정, 세포질에서 껍질을 벗겨내고 세포핵 안으로 침입해 DNA 복제를 하는 증식 과정, 세포질에서 껍질을 쌓아 완전한 바이러스 형태로 재조합하는 조립 과정, 간세포 밖으로 빠져나가는 배출 과정, 그리고 또 다시 다른 간세포에 달라붙어 반복해서 증식하는 과정를 포함한다.
HBV는 부분적으로 이중가닥인 DNA 게놈(partially double-stranded DNA genome)을 가지고 있는데, HBV 게놈 DNA는 갭(gap)이 존재할 뿐만 아니라 양 말단에 단백질(oval shape) 혹은 RNA(wavy line)가 공유결합으로 연결되어 있고 양 말단이 연결되어 있지 않아 비틀림 응력(torsional stress)이 없어 Relaxed Circular DNA(RC DNA)라고도 부른다.
간세포 내에서 HBV가 증식하려면 HBV의 DNA 게놈(RC DNA)이 간세포의 세포핵 내로 주입되고 이로부터 cccDNA(covalently closed circular DNA)가 생성되어야만 한다. 일단 cccDNA가 생성되면 그 세포의 수명이 다 할 때 까지 계속 HBV의 증식이 이루어질 수 있다.
cccDNA 생성을 위해서는 우선 HBV가 간세포로 침투하는 것이 선행되어야 한다.
HBV의 외피(envelope)는 표면 항원(Hepatitis B surface antigen; HBsAg)을 포함하고 있는데, HBV가 간세포로 침투하기 위해서는 HBsAg가 간세포 표면의 헤파란 황산 프로테오글라이칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하여 HBV가 간세포 표면에 부착하는 단계가 필수적이다. HBV가 간세포 표면에 부착하면 HBsAg의 Pre-S1 도메인이 간세포 표면에 존재하는 수용체인 나트륨 타우로콜레이트 코트랜스포트 폴리펩타이드(Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide, NTCP)에 결합함으로써 HBV가 간세포로 침투하게 된다.
B형 간염 바이러스 항체는 천연 또는 재조합 항체일 수 있으며, 바람직하게는 세포주 HBAb-49(KCLRFBP-00054)로부터 생산되는 HBV의 표면항원에 대한 항체(HBIG-Gene)일 수 있다.
본 발명의 B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체 H 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 1의 아미노산 서열; 및 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 L 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 항체일 수 있다.
또한, 본 발명의 B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체 H 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 3의 아미노산 서열; 및 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 L 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 항체일 수 있다.
B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성을 억제한다. B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원(HBsAg)이 헤파란 황산 프로테오글라이칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하는 것을 억제한다. HBsAg가 헤파란 황산 프로테오글라이칸에 결합하는 것이 억제되면 HBV의 간세포 침투가 억제되고 cccDNA의 형성이 억제된다.
B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제는 바이러스 생활사에 직접 작용하는 치료법의 일종이다. 이는 인터페론 치료, 싸이토카인 치료, 바이러스 특이성 T 세포 면역 회복 등과 같은 면역 치료법과는 구별된다.
또한, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제는 감염된 B형 간염 바이러스 cccDNA의 소멸법과는 차이가 있다. B형 간염 바이러스의 cccDNA 소멸법은 임상에 적용하기 위해 적절한 운반체 개발이 동반되어야 하는 문제가 있다.
B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성이 억제되면 HBV 게놈 DNA의 복제가 이루어지지 않고 HBV의 재생산이 불가능해지므로 아직 감염되지 않은 간세포로의 HBV 전파는 더 이상 일어나지 않는다. 이미 cccDNA가 형성된 간세포는 그 수명(약 5개월)이 다 되어 사멸될 때 B형 간염 바이러스의 cccDNA도 같이 분해되어 없어지게 된다.
따라서 본 발명의 약학 조성물은 보다 포괄적이고 근본적인 B형 간염의 치료를 가능하게 한다. 또한, 오랜 기간의 치료가 요구되는 만성 B형 간염의 치료에 보다 적합하다.
본 발명의 약학 조성물은 투여 시기가 정해져 있는 것은 아니지만 B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 약효를 보다 극대화시키기 위해서는 B형 간염 바이러스에 감염된 후 가능한 신속히 투여하는 것이 좋다. 예컨대 B형 간염 바이러스의 감염 시점으로부터 72 시간 이내, 48 시간 이내, 24 시간 이내에 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적인 방법에 따라 약학 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, B형 간염 바이러스 항체를 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나 용기 형태의 담체 내에 봉입시킬 수 있다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 항체에 대한 담체, 부형제 또는 매질(medium)로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다.
제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다.
적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 항체의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 인터페론, 항-HBV 단일클론 항체, 항-HBV 폴리클로날 항체, 뉴클레오시드 유사체, DNA 폴리머라제 저해제, siRNA 제제 또는 치료 백신을 항바이러스제로서 추가 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 B형 간염 바이러스 항체의 유효량을 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 방법을 제공한다.
본 발명의 B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 방법은 위 약학 조성물을 예방학적으로 또는 치료학적으로 투여하여 구성될 수 있다. 위에서 설명한 B형 간염 바이러스 항체를 B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 방법에 동일하게 사용할 수 있다.
B형 간염 바이러스 항체의 유효량은 B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 약효가 발현되기에 충분한 양을 의미한다. 예컨대 B형 간염 바이러스 항체를 적당한 제형에 0.1 내지 50 ㎎/㎖, 바람직하게는 2 내지 10 ㎎/㎖, 가장 바람직하게는 3 내지 7 ㎎/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제 약효를 극대화하기 위해 B형 간염 바이러스 항체를 B형 간염 바이러스에 감염된 후 가능한 신속히 투여되도록 하는 것이 좋다. 예컨대 B형 간염 바이러스 항체가 B형 간염 바이러스의 감염 시점으로부터 72 시간 이내, 48 시간 이내, 24 시간 이내에 투여되도록 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 위에서 설명한 약학 조성물을 투여하여 B형 간염 바이러스의 게놈 DNA 복제를 차단하는 단계를 포함하는 B형 간염, 특히 만성 B형 간염의 치료 방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 간세포에 B형 간염 바이러스를 접종하는 단계 및 상기 간세포에 대상 물질을 처리한 후 cccDNA 형성 억제 여부를 확인하는 단계를 포함하는 B형 간염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
일 실시예에 따르면, 위의 간세포는 HepG2-NTCP일 수 있다.
대상 물질은 B형 간염 바이러스를 접종한 후 24 시간 이내에, 보다 바람직하게 12 시간 이내에, 더욱 바람직하게 6 시간 이내에 처리하는 것이 좋다.
대상 물질은 B형 간염 바이러스가 간세포에 침투하는 것을 억제하는 물질일 수 있고, 또한 대상 물질은 B형 간염 바이러스의 표면 항원(HBsAg)이 헤파란 황산 프로테오글라이칸(heparan sulfate proteoglycan) 또는 나트륨 타우로콜레이트 코트랜스포트 폴리펩타이드(Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide, NTCP)에 결합하는 것을 억제하는 물질일 수 있다.
또한, 예컨대, 위의 cccDNA 형성 억제 여부 확인은 대상 물질의 처리 시점으로부터 2 내지 10일 후 에피솜 DNA를 간세포로부터 추출하고 그 에피솜 DNA에 포함된 cccDNA의 양을 측정함으로써 이루어질 수 있다.
에피솜 DNA를 간세포로부터 추출하는 방법과 그 에피솜 DNA에 포함된 cccDNA의 양을 측정하는 방법은 통상적으로 본 발명이 속하는 분야에서 사용되는 다양한 방법으로 수행될 수 있다.
또한 본 발명은, B형 간염 바이러스 항체와 병용투여 될 수 있는 치료 보조제의 스크리닝 방법을 제공한다. 일 실시예에 따르면, B형 간염 바이러스가 포함된 생물학적 시료에 B형 간염 바이러스 항체 및 대상 물질을 처리 한 후 cccDNA 형성 억제 여부를 확인하여, 위의 cccDNA의 형성이 위의 대상 물질을 접촉시키지 않은 경우에 비하여 감소하는 경우, 위의 대상 물질을 위의 B형 간염 바이러스 항체와 병용투여 될 수 있는 치료 보조제로 판단할 수 있다. 위의 스크리닝 방법에서 B형 간염 바이러스 항체란, 앞서 설명한 B형 간염 바이러스 항체를 포함하여, B형 간염의 예방 및 치료 효과를 갖는 항체를 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 한정하지 않음은 당연하다.
실시예 : HBsAg에 대한 인간 HBV 항체(GC1102)에 의한 HBV 감염 억제 효능 평가
<1> 재료 및 방법
1) anti-HBsAg 항체. 본 실험에 사용한 항체(GC1102)는 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 H chain의 가변영역을 암호화하는 서열번호 1의 아미노산 서열(HBAb-H4) 및 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 L chain의 가변영역을 암호화하는 서열번호 2의 아미노산서열(HBAb-L9)로 표시되는 인간 항체이다.
2) 대조군. 실험 진행 시에 음성 대조군(negative control)으로 IgG를 처리한 샘플과, 양성대조군(positive control)으로서 Myrcludex B (MyrB)를 처리한 샘플을 함께 준비하여 실험적 오류의 발생을 최소화하였다. 양성대조군으로 사용된 MyrB는 HBsAg pre-S1 domain에 위치한 47개의 아미노산으로 구성된 lipo-peptide이며 현재 HBV entry inhibitor로서 임상실험이 진행 중이다.
3) Cell culture. 본 실험에 사용한 HepG2-NTCP 세포주는 human NTCP를 안정적으로 발현하는 세포주로서 본 실험실에서 발표된 논문을 통하여 확립되어있다(Ko et al., 2014). 또한 HepAD38 세포주는 HBV inoculum을 지속적으로 생산하는 세포주로서 infection 실험에 필요한 HBV inoculum을 얻는 데에 사용하였다.
4) 써던 블롯 분석. 본 실험에 사용한 써던 블롯 분석는 세포 내에 존재하는 HBV capsids로부터 분리한 viral DNA를 분석하는 방법으로, 본 실험실에 이미 확립되어 있다(Ko et al., 2014).
5) ELISA. HBV 감염 여부를 측정할 수 있는 또 다른 방법으로 culture supernatant로 분비되는 HBsAg 또는 HBeAg을 직접 측정하는 것이다. 구체적으로, infection 후 5-7일째 해당하는 supernatant를 수득하여, B형간염 진단시약 “제네디아 HBsAg 엘리자 3.0”을 이용해서 조사하였다. 실험을 수행할 때, HBV international standard를 이용해서 standard curve를 그린 후, 이를 측정값과 비교해서 supernatant로 분비되는 HBsAg의 절대량을 구하였다.
6) 면역 형광법. 면역 형광법 기법을 이용하면 cell lysis 과정 없이 직접 형광현미경을 통해서 HBV 감염 여부를 관찰할 수 있다는 큰 장점이 있다. Infection한 cell을 paraformaldehyde로 고정한 후 triton X-100을 이용 permeablization 과정을 거친 다음 HBcAg antibody를 이용하여 infection여부를 확인하였다.
7) HBV 감염. HepG2-NTCP 세포주에 HBV 감염을 수행하였다. 구체적으로 HepG2-NTCP cell을 culture dish에 seeding하고, 24시간 후 HBV inoculum을 HepG2-NTCP cell에 infection 하였다. Infection 16-24시간 후 2.5% DMSO가 들어간 media로 바꿔주었다. Media는 2일마다 교체하며, infection 후 8-10일후에 infection 유무를 다양한 실험 기법을 활용하여 확인하였다.
<2> GC1102의 HBV 감염 억제 효능 평가
먼저, GC1102가 HBV 감염을 억제할 수 있는가를 써던 블롯 분석과 HBsAg ELISA를 측정하여 조사하였다.
실험 결과를 도 1에 정리하였다. (A) 써던 블롯 분석. HepG2-NTCP 세포에 HBV를 감염시킨 후, 9일이 지난 시점에서 캡시드 DNA를 써던 블롯으로 측정하였다. HBV 감염을 수행할 때 MyrB (1 μg/ml), IgG (1 μg/ml), GC1102 (1 μg/ml)을 같이 처리하였다. 3.2kb HBV DNA는 size marker로서 사용하였다. RC: relaxed circular DNA; DL: double-stranded linear DNA; (B) HBsAg ELISA. HBV 감염 수행 후, 5-7일, 7-9일 동안 각각 이틀간 배양한 culture supernatant에 존재하는 HBsAg의 농도를 측정하였다. 농도를 알고 있는 HBsAg 표준품을 사용하여 culture supernatant에 존재하는 HBsAg의 절대량 (IU/ml)을 측정하였다.
실험 결과, GC1102 (1μg/ml)는 HBV replication intermediates(복제중간생성물; RC and DL DNA)의 생성을 효과적으로 억제함을 확인하였다. 또한, culture supernatant에 존재하는 HBsAg를 ELISA로 정량하였을 때 GC1102를 처리한 샘플에서는 HBsAg의 생성이 매우 낮음을 관찰하였다. 양성대조군인 MyrB를 처리한 샘플에서는 복제중간생성물 및 HBsAg이 관찰되지 않았고, 음성대조군인 IgG를 처리한 샘플에서는 복제중간생성물 및 HBsAg이 HBV 감염만을 수행한 샘플과 유사하게 관찰되었다. 상기 실험결과를 통해, GC1102가 효과적으로 HBV 감염을 억제함을 관찰하였다.
또한, GC1102에 의한 HBV 감염의 억제 효과를 면역 형광법 기법을 통하여 관찰하였다. 보다 구체적으로는 HepG2-NTCP 세포주에 HBV를 감염시킨 후 7일이 지난 시점에서 HBV core protein을 confocal microscopy로 관찰하였다. HBV 감염을 수행할 때에 MyrB (1 μg/ml, 2 μg/ml)와 GC1102 (100ng/ml, 200ng/ml)을 함께 처리하였다. 세포의 핵은 DAPI(blue)로 염색되었으며, core 단백질은 anti-HBcAg(red)로 염색되었다.
실험 결과를 도 2에 정리하였다. 그림에서 보이는 것과 같이, GC1102를 HBV 감염과 동시에 세포에 농도를 증가시키며 처리한 결과, GC1102의 농도에 비례하여 세포내 core protein의 발현량이 확연하게 감소하였다. 또한, 양성 대조군인 MyrB를 처리한 실험군에서 역시 HBV core protein의 발현량이 MyrB의 농도에 비례하여 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 결국, 그림1과 그림2에서 나타난 결과를 통하여 GC1102는 HBV 감염을 억제하여 복제 중간 생성물뿐만 아니라 HBV 단백질 발현도 효과적으로 억제한다고 해석할 수 있다.
<3> GC1102의 HBV cccDNA 형성 억제 효능 평가
상기 결과를 토대로 더 나아가 GC1102가 HBV 만성감염의 결정인자인 cccDNA(covalently closed circular DNA)의 형성에 미치는 영향을 조사하기 위한 실험을 진행하였다.
간단하게, HBV의 cccDNA는 HBV 개체가 표적세포인 간세포에 진입한 후 HBV 게놈 DNA가 플라스미드 형태의 에피솜 DNA로 전환된 것을 지칭하는데, 이는 전사의 주형으로 작용한다. 즉, HBV 게놈 DNA의 cccDNA로의 전환과정은 HBV의 게놈 복제에 필수적이다.
위의 이론을 바탕으로, GC1102가 HBV 만성감염의 결정인자인 cccDNA(covalently closed circular DNA)의 형성에 미치는 영향을 조사하기 위한 실험을 진행하였다. 보다 구체적으로는 HepG2-NTCP 세포에 GC1102 (100ng/ml, 200ng/ml)와 MyrB(1 μg/ml)를 처리한 후, 3일이 지난 시점에서 hirt DNA extraction으로 DNA를 얻어 써던 블롯 분석를 통하여 PF-RC DNA와 cccDNA를 측정하였다. 3.2kb, 2.1kb, 1.9kb 그리고 1.4kb HBV DNA는 size marker로서 사용하였다.
실험 결과를 도 3에 정리하였다. 실험 결과, HBV 감염만을 진행한 lane 2와 비교하였을 때, 양성 대조군으로 사용한 MyrB를 처리한 샘플과, GC1102를 처리한 샘플에서는 cccDNA가 전혀 관찰되지 않았다. 이는 GC1102의 처리에 의해 HBV 게놈 DNA의 PF-RC DNA에서 cccDNA로의 conversion이 저해되었다는 것을 의미한다.
<4> GC1102에 의한 HBV 감염 억제의 dose-response 분석
다음으로, 다양한 HBV 연구기법을 이용해서 GC1102의 농도별 HBV 감염 억제 정도를 조사하여 약효를 평가하였다. HepG2-NTCP세포에 GC1102를 6.25 200 ng/ml 농도까지 그 농도를 2배씩 증가시키면서 총 6개의 points에 대한 dose-response를 조사하였다. 본 실험에 앞서 실험을 수행한 농도에서는 세포독성이 없음을 cell viability assay를 통하여 확인하였다(data not shown).
실험 결과를 도 4에 정리하였다. (A) Southern blot; (B) Western blot; (C) HBsAg ELSIA; 및 (D) HBeAg ELISA를 수행하였다. Southern blot 및 ELISA는 도 1의 경우와 동일하게 수행하였으며, Western blot (B)는 Southern blot을 수행하기 위해 얻은 cell lysate의 일부(6% input)를 사용해서 세포내의 core protein양을 측정한 결과이다. β-actin은 동일한 양의 cell lysate가 사용되었음을 나타내는 loading control이다.
실험 결과, 증가된 GC1102의 양에 비례하여 복제 중간생성물과 세포 내 바이러스 core 단백질의 발현량, culture supernatant에 secretion된 HBsAg 및 HBeAg이 dose-dependent manner로 감소하였다. 상기 실험 결과를 통하여 GC1102는 세포 독성이 없고 농도에 따른 dose-response를 보이는 효과적인 HBV 항바이러스제임을 확인하였다.
<5> GC1102의 EC50(effective concentration) 평가
도 4의 실험에서 얻어진 결과 값 정량을 통해서 EC50 값을 계산하였다. HBV 감염을 수행할 때, IgG 만을 처리한 sample에서 얻어진 HBV 감염 수행 정도를 100 %로 정하고, GC1102를 농도별로 처리한 sample들의 값을 상대적인 값으로 조정해서 inhibition curve(%)를 그렸다.
분석 결과를 도 5에 정리하였다. GC1102을 14.97ng/ml의 농도로 세포에 처리하였을 경우, HBV 감염이 50% 억제되었다. 이렇게 처리된 농도는 GC1102의 분자량(150kDa)을 적용하여 몰농도로 환산하였을 때 대략 100pM에 해당하는 값이다. 상기 실험 결과를 통하여, GC1102가 매우 낮은 농도(EC50=100pM)에서도 효과적으로 HBV 감염을 억제함을 알 수 있다.
<6> GC1102(anti-HBsAg)의 처리 시점에 따른 HBV 감염 억제 효능 평가
다음으로, HBV 감염이 가장 효과적으로 억제되는 GC1102(anti-HBsAg)의 처리 시점을 알아보기 위한 실험을 진행하였다.
실험 결과를 도 6에 정리하였다. (A) GC1102의 HBV 감염에 작용하는 단계를 조사하기 위한 실험 일정을 나타내었다. HBV 감염과 GC1102의 처리 일정이 실선으로 표시되었다. (B) 써던 블롯 분석. HepG2-NTCP 세포에 HBV를 infection과 GC1102의 처리를 (A)와 같이 진행한 후, 9일이 지난 시점에서 캡시드 DNA를 southern blot으로 측정하였다. 6% input은 southern blot을 수행하기 위해 얻은 cell lysate의 일부를 사용하여 세포내의 core 단백질의 양을 측정한 결과이다. β-actin은 동일한 양의 cell lysate가 사용되었음을 나타내는 loading control이다.
실험 결과, GC1102의 투여가 HBV 감염과 동시에 진행될 때에 GC1102에 의한 HBV 감염 저해가 가장 효과적으로 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 GC1102가 HBV 감염 시에 HBV의 S ORF의 특정한 에피토프에 직접적으로 결합함으로서 HBV의 hepatocyte와의 attachment를 저해하고 결과적으로 infection effectivity를 감소시키기 때문인 것으로 해석할 수 있다
<7> 결론
위의 실험을 통하여, 본 발명의 인간 B형 간염 바이러스 항체(GC1102)가 HBV 감염을 근본적으로 억제하는 기존에 없던 매우 효과적인 HBV 항바이러스제임을 입증하였다. GC1102는 매우 낮은 농도에서 EC50 값을 가지며, HBV의 게놈 DNA 복제뿐만 아니라, HBV 게놈의 전사 주형으로 알려져 있는 cccDNA의 형성까지 효과적으로 저해하였다. 이는 GC1102가 간이식 환자에게 HBV 감염을 효과적으로 억제함으로써 간이식 이후 HBV 재발을 매우 효과적을 억제할 수 있으며, 또한, GC1102의 단독 투여 또는 기존의 항바이러스 치료제와 병용 투여를 통해 만성간염환자를 효과적으로 치료할 수 있는 길이 열릴 수 있음을 제시한다.
<110> MOGAM BIOTECHNOLOGY INSTITUTE <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING cccDNA FORMATION OF HEPATITIS B VIRUS <130> 15P06024 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H chain variable region(HBAb-H4) of GC1102 antibody <400> 1 Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Lys Tyr 20 25 30 Lys Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Thr Ser Arg Asp Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Gly Trp Leu Trp Gly Trp Asp Val Arg Ser Asn Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Asn Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain variable region(HBAb-L9) of GC1102 antibody <400> 2 Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Asn Ser 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe Val Thr Pro Glu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 3 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H chain variable region of HB48-33, HB48-35 or HB48-59 antibody <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly His Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Trp Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Pro Thr Trp Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain variable region of HB48-33 antibody <400> 4 Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain variable region of HB48-35 antibody <400> 5 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Asn 20 25 30 Val Asn Trp Phe Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser Val Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 6 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L chain variable region of HB48-59 antibody <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Lys Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser 85 90 95 Thr Gln Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg

Claims (10)

  1. B형 간염 바이러스 항체를 포함하는, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원(HBsAg)이 헤파란 황산 프로테오글라이칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하는 것을 억제하는, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체 H 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 1의 아미노산 서열; 및 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 L 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 항체는 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체 H 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 3의 아미노산 서열; 및 B형 간염 바이러스의 표면항원에 대한 인간항체 L 사슬의 가변영역을 암호화하는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스의 감염 시점으로부터 24 시간 이내에 투여되는, B형 간염 바이러스의 cccDNA 형성 억제용 약학 조성물.
  6. 간세포에 B형 간염 바이러스를 접종하는 단계; 및 상기 간세포에 대상 물질을 처리한 후 cccDNA 형성 억제 여부를 확인하는 단계를 포함하는, B형 간염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 간세포는 HepG2-NTCP인, B형 간염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 대상 물질은 상기 B형 간염 바이러스를 접종한 후 24 시간 이내에 처리하는, B형 간염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 cccDNA 형성 억제 여부 확인은 (a) 상기 대상 물질의 처리 시점으로부터 2 내지 10일 후 에피솜 DNA를 상기 간세포로부터 추출하는 단계; 및 (b) 상기 에피솜 DNA에 포함된 cccDNA의 양을 측정하는 단계;를 포함하여 수행되는, B형 간염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법.
  10. 다음의 단계를 포함하는 B형 간염 치료 보조제의 스크리닝 방법:
    (a) B형 간염 바이러스가 포함된 생물학적 시료에 B형 간염 바이러스 항체 및 대상 물질을 접촉시키는 단계; 및
    (b) cccDNA 형성 억제 여부를 확인하여 상기 cccDNA의 형성이 상기 대상 물질을 접촉시키지 않은 경우에 비하여 감소하는 경우, 상기 대상물질을 상기 B형 간염 바이러스 항체와 병용투여될 수 있는 치료 보조제로 판단하는 단계.
KR1020150105277A 2015-07-24 2015-07-24 B형 간염 바이러스의 ｃｃｃＤＮＡ 형성 억제용 약학 조성물 KR101771309B1 (ko)

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