CN108136009A - 用于防止乙型肝炎病毒的cccDNA形成的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明基于以下发现：乙型肝炎病毒抗体抑制乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合，由此防止乙型肝炎病毒的cccDNA形成。期望利用本发明的药物组合物和防止乙型肝炎病毒的cccDNA形成的方法，可根本性地治疗慢性乙型肝炎，并且还预防肝移植手术后的乙型肝炎患者中的肝炎的复发。此外，根据本发明，可通过确认cccDNA形成是否受到抑制来新识别用于预防或治疗乙型肝炎的材料。此外，根据本发明，可新识别与乙型肝炎病毒抗体组合施用的治疗补充剂。

Description

用于防止乙型肝炎病毒的cccDNA形成的药物组合物
技术领域
本发明涉及用于防止乙型肝炎病毒的cccDNA形成的药物组合物。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是属于嗜肝病毒科(Hepadnaviridae family)的具有DNA基因组的病毒，并且诱导急性和慢性肝炎。约3.50亿的世界人口为慢性HBV阳性者，并且特别地，韩国和中国具有约5至8％的慢性感染者。这类慢性HBV感染可诱导肝炎、肝硬化和甚至肝癌。慢性感染者显示比正常人高约300倍的肝癌发病率。根据WHO研究，80％的肝癌由慢性HBV导致。
由于疫苗的发展，已部分预防乙型肝炎病毒。然而，一旦HBV侵入肝细胞，没有方法完全移除进入患者肝细胞的HBV。因此，目前完全治愈乙型肝炎是非常困难的。此外，当乙型肝炎患者具有肝移植时，他们显示乙型肝炎的高复发率。原因是，未完全移除但保留在细胞中的HBV侵入移植的健康肝细胞。
如果HBV侵入肝细胞，共价闭合环状(covalently closed circular，ccc)DNA在所述肝细胞中形成。然后，形成的cccDNA用作HBV基因组DNA复制的模板，并且连续生成HBV，直到相应肝细胞的寿命结束。目前使用的任何治疗方法可抑制HBV基因组DNA复制从而因此抑制血液中的HBV形成，然而，不可根本性地阻断HBV复制。
因此，仍强烈需要发展可根本性地阻断HBV复制从而使得能够主要治疗慢性乙型肝炎、并且预防对乙型肝炎患者肝移植手术后肝炎的复发的用于防止cccDNA形成的药物组合物以及使用其的治疗方法。
[现有技术文献]
[专利文献]
专利文献1韩国专利注册号0467706(2005.1.13)
专利文献2韩国专利注册号1072895(2011.10.06.)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供用于预防乙型肝炎病毒的cccDNA形成的药物组合物。
本发明的另一目的是提供使用上述药物组合物治疗慢性乙型肝炎的新型方法。
此外，本发明的另一目的是提供预防在肝移植手术后的乙型肝炎患者中的肝炎复发的方法。
用于解决问题的方案
本发明的上述目的将通过以下特征实现：
(1)一种用于防止乙型肝炎病毒的cccDNA形成的药物组合物，其包括乙型肝炎病毒抗体。
(2)根据上述(1)所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒抗体适用于抑制乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。
(3)根据上述(1)所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒抗体包括：编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:1；和编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
(4)根据上述(1)所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒抗体包括：编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:3；和编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NOs:4至6的任一种。
(5)根据上述(1)所述的组合物，其中所述组合物在从乙型肝炎病毒感染时间起24小时内施用。
(6)一种防止乙型肝炎病毒的cccDNA形成的方法，其包括施用预防或治疗有效量的乙型肝炎病毒抗体。
(7)根据上述(6)所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗体适用于抑制乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。
(8)根据上述(6)所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗体包括：编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:1；和编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
(9)根据上述(6)所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗体包括：编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:3；和编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NOs:4至6的任一种。
(10)根据上述(6)所述的方法，其中所述组合物在从乙型肝炎病毒感染时间起24小时内施用。
(11)一种治疗慢性肝炎的方法，其包括施用根据上述(1)所述的药物组合物从而阻断乙型肝炎病毒的基因组DNA复制。
(12)根据上述(11)所述的方法，其中所述慢性肝炎为慢性乙型肝炎。
(13)根据上述(11)所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗体包括：编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:1；和编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
(14)根据上述(11)所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗体包括编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:3；和编码针对乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NOs:4至6的任一种。
(15)一种筛选用于预防或治疗乙型肝炎的材料的方法，其包括：接种乙型肝炎病毒至肝细胞；和在用受试材料(subject material)处理肝细胞后，确认cccDNA形成是否受到抑制。
(16)根据上述(15)所述的方法，其中所述肝细胞为HepG2-NTCP。
(17)根据上述(15)所述的方法，其中在乙型肝炎病毒的接种后24小时内处理所述受试材料。
(18)根据上述(15)所述的方法，其中cccDNA形成是否受到抑制的确认通过包括以下来进行：(a)在从使用所述受试材料的处理时间起2至10天后从肝细胞提取附加体DNA；和(b)测量附加体DNA中包含的cccDNA的量。
(19)一种筛选乙型肝炎治疗补充剂的方法，其包括：(a)使乙型肝炎病毒抗体和受试材料与包括乙型肝炎病毒的生物样品接触；和(b)确认cccDNA形成是否受到抑制，如果cccDNA形成比受试材料不与样品接触的情况减少，确定受试材料作为与乙型肝炎病毒组合施用的治疗补充剂。
发明的效果
根据本发明，如果防止乙型肝炎病毒(HBV)cccDNA形成，HBV基因组DNA复制不进行，并且HBV的复制是不可能的，因此，HBV进入未感染的肝细胞的进一步传播不会发生。
同时，在具有已在其中形成的cccDNA的肝细胞的情况下，当肝细胞的寿命(约5个月)结束从而达到细胞死亡，cccDNA也降解和消失。因此，本发明的药物组合物可从患者的肝细胞完全地移除HBV，从而使得可以根本性地和完全地治愈慢性乙型肝炎。此外，还可根本性地阻断肝移植手术后的乙型肝炎患者中的肝炎的复发。
本发明的药物组合物可有效用于慢性乙型肝炎引起的肝硬化和肝癌的预防。
根据本发明，可通过确认cccDNA形成是否受到抑制而新识别用于预防或治疗乙型肝炎的材料。
此外，根据本发明，可以新识别可与HBV抗体组合施用的治疗补充剂。
附图说明
图1是示出通过DNA印迹分析(Southern blot analysis)和HBsAg ELISA的GC1102的HBV感染抑制效力的评估结果的图。
图2是示出根据免疫-荧光技术的GC1102的HBV感染抑制效力的评估结果的照片。
图3是示出GC1102的HBV cccDNA形成抑制效力的评估结果的图。
图4是示出GC1102的HBV感染抑制的剂量-反应的分析结果的图。
图5是示出GC1102的EC50(有效浓度)的评估结果的曲线图。
图6是示出根据GC1102(抗-HBsAg)的处理时间的HBV感染抑制效力的评估结果的图。
具体实施方式
本发明基于以下发现：使用乙型肝炎病毒抗体可抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)与肝细胞的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合；阻断HBV的肝细胞侵入；并且防止HBV的cccDNA形成。
以下，将更详细地描述本发明。
本发明的一个实施方案提供用于防止HBV的cccDNA形成的药物组合物，所述药物组合物包括HBV抗体。
乙型肝炎病毒(HBV)是属于嗜肝病毒科的病毒，并且侵入肝细胞从而诱导急性和慢性肝炎。
HBV具有包括以下的生活史：粘附至肝细胞的表面和进入细胞的侵入过程；细胞质(cytoplasm)剥离外壳(skin)、穿透至细胞核然后复制DNA的增殖过程；在细胞质中堆叠外壳从而重组为完整病毒形式的装配过程；逃离肝细胞的释放过程；和粘附至另一肝细胞并重复如上所述的相同增殖过程的过程。
HBV具有部分双链的DNA基因组，并且HBV基因组DNA具有在DNA两端通过共价键连接的缺口(gap)和蛋白质(椭圆形)或RNA(波形线)。因为所述DNA的两端不用扭转应力连接，上述DNA还称为松环DNA(RC DNA)。
为了在肝细胞中增殖HBV，HBV的DNA基因组(RC DNA)应注射至肝细胞的细胞核，然后应由其生成cccDNA(即，共价闭合环状DNA)。一旦生成cccDNA，HBV可连续增殖直到细胞的寿命结束。
对于cccDNA形成，首先，HBV的肝细胞的侵入必须在先。
HBV的包膜包括HBsAg，并且为了HBV侵入肝细胞，HBsAg结合至肝细胞表面处的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖从而允许HBV附着于肝细胞表面是必需的。当HBV附着于肝细胞表面时，HBsAg中的Pre-S1结构域(domain)结合至肝细胞表面上存在的受体、即钠-牛黄胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)，从而允许HBV进入肝细胞。
乙型肝炎病毒抗体(HBV抗体)可为天然或重组抗体，并且优选从细胞系BHAb-49(KCLRFBP-00054)产生的HBV的表面抗原的抗体(HBIG-Gene)。
本发明的HBV抗体可为包括以下的重组抗体：编码针对HBV的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:1；和编码针对HBV的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
此外，本发明的HBV抗体可为包括以下的重组抗体：编码针对HBV的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:3；和编码针对HBV的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NOs:4至6的任一种。
HBV抗体可防止HBV的cccDNA形成。HBV抗体可抑制HBV的表面抗原(HBsAg)与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。当抑制HBsAg与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合时，阻断HBV的肝细胞的侵入，因此防止cccDNA形成。
HBV的cccDNA形成的防止是直接作用(acting)病毒的生活史的治疗方法之一。这与例如干扰素治疗、细胞因子治疗、细胞免疫恢复(cell immunity recovery)等的免疫疗法区分。
此外，HBV的cccDNA形成的防止与乙型肝炎病毒cccDNA(HBV cccDNA)的消灭方法(extinction method)不同。HBV cccDNA的消灭方法具有需要开发合适载体以便将其应用于临床试验的问题。
如果防止HBV的cccDNA形成，HBV基因组DNA是不可复制的，并且HBV复制可变得不可能，因此，不会发生HBV进一步传播至未感染的肝细胞。对于具有已在其中形成的cccDNA的肝细胞，当肝细胞的寿命(约5个月)结束从而达到细胞死亡，cccDNA也降解并消失。
因此，本发明的药物组合物可使得乙型肝炎能够较综合和根本性的治疗。此外，本发明组合物可较适用于治疗需要长期治疗的慢性乙型肝炎。
本发明的药物组合物的给药时段未特别确定，然而，为了最大化防止HBV的cccDNA形成的医疗效果，优选从HBV感染时间起尽可能早地施用组合物。在从HBV感染时间起72小时、48小时或24小时内，可施用本发明组合物。
根据任何常规方法，可将本发明组合物制备为制剂。在制备制剂中，HBV抗体可与载体共同混合或稀释，或密封至具有容器形式的载体中。当使用载体作为稀释剂时，所述制剂可为充当抗体的载体、赋形剂、或介质的固体、半固体或液体材料。
所述制剂可为任何以下的形式：片剂、丸剂、粉末剂、铝箔小包(sachet)、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬明胶胶囊剂(gelatin capsule)、或者无菌可注射溶液和无菌粉末等。
合适的载体、赋形剂和稀释剂的实例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯(polyvinyl pyrrolie)、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、和矿物油。
制剂可进一步包括填料、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、矫味剂(flavoring agent)、乳化剂、和防腐剂等。本发明组合物可使用相关领域内广泛公知的方法配制从而在向哺乳动物施用组合物后提供抗体的快速、持续和延迟释放。
本发明的药物组合物可进一步包括作为抗病毒剂的抗-HBV单克隆抗体、抗-HBV多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA制剂或治疗性疫苗。
此外，本发明的一个实施方案提供防止HBV抗体的cccDNA形成的方法，其包括施用预防或治疗有效量的乙型肝炎病毒抗体。
本发明的防止HBV的cccDNA形成的方法可包括施用预防或治疗有效量的上述药物组合物。上述HBV抗体还可用于防止HBV的cccDNA形成的方法。
在此，HBV抗体的有效量意为足以表达防止HBV的cccDNA形成的医疗效果的量。例如，HBV抗体可以0.1至50mg/ml、优选2至10mg/ml、更优选3至7mg/ml的浓度包含在任何合适的制剂中。
为了最大化防止HBV的cccDNA形成的医疗效果，优选从HBV感染时间起尽可能早地施用HBV抗体。例如，可在从HBV感染时间起72小时、48小时或24小时内施用HBV抗体。
本发明的一个实施方案提供治疗乙型肝炎、特别是慢性乙型肝炎的方法，其包括施用上述药物组合物从而阻断HBV的基因组DNA复制。
此外，本发明提供筛选用于预防或治疗乙型肝炎的材料的方法，其包括：接种HBV至肝细胞；和在用受试材料处理肝细胞后，确认cccDNA形成是否受到抑制。
根据一个实施方案，肝细胞可为HepG2-NTCP。
受试材料可在接种HBV后24小时内、更优选12小时内、最优选6小时内用于处理。
受试材料可包括用于抑制HBV侵入肝细胞的材料，或可包括用于抑制HBV的表面抗原(HBsAg)结合至硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或钠-牛黄胆酸共转运多肽(NTCP)的材料。
此外，例如，cccDNA形成是否受到抑制的确认可通过在从使用受试材料的处理点起2至10天后从肝细胞提取附加体DNA、然后测量附加体DNA中包含的cccDNA的量来进行。
从肝细胞提取附加体DNA、和测量附加体DNA中包含的cccDNA的量的上述过程可通过用于本发明所属的相关领域的各种常规方法来执行。
此外，本发明提供筛选可与HBV抗体组合施用的治疗性补充剂(therapeuticsupplement)的方法。根据一个实施方案，包含HBV的生物样品用HBV抗体和受试材料处理，然后确认cccDNA形成是否受到抑制。如果cccDNA形成比受试材料不与样品接触的情况减少，可认为受试材料是可与上述HBV抗体组合施用的治疗补充剂(treatment supplement)。在上述筛选方法中，HBV抗体指的是具有HBV的预防和治疗作用的抗体，所述抗体包括上述HBV抗体。
以下，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，本领域技术人员将理解提供这类实施例用于具体地描述本发明，并且不限制如具体描述和所附权利要求中所保护的主题。
实施例：针对HBsAg的人类HBV抗体(GC 1102)的HBV感染抑制效力的评估
<材料和方法>
1)抗-HBsAg抗体：本实验中使用的抗体(GC1102)是由以下表示的人类抗体：编码针对HBV的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:1(HBAb-H4)；和编码针对HBV的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:2(HBAb-L9)。
2)对照组：制备在进行实验中用作为阴性对照的IgG处理的样品和用作为阳性对照的Myrcludex B(MyrB)处理的样品两者，从而最小化实验误差的发生。用作阳性对照的MyrB为由HBsAg Pre-S1结构域中的47个氨基酸组成的脂肽，并且现在作为HBV进入抑制剂(HBV entry inhibitor)处于临床试验中。
3)细胞培养：本实验中使用的HepG2-NTCP细胞系是稳定地表达人类NTCP的细胞系，并且已在本实验室发表的论文中建立(Ko等人,2014)。此外，HepAD38细胞系是连续产生HBV接种物(inoculum)的细胞系，并且已用于得到在感染试验中需要的HBV接种物。
4)DNA印迹分析：本实验中使用的DNA印迹分析是从细胞中存在的HBV壳体(capsid)分离的病毒DNA的分析方法，并且已由本实验室建立(Ko等人,2014)。
5)ELISA：ELISA是通过直接测量分泌至培养上清液的HBsAg或HBeAg来测定HBV感染的另一方法。更具体地，得到感染后的第5至7天的上清液，并且通过用于乙型肝炎的诊断试剂、"Genedia HBsAg Elisa 3.0"研究。在进行实验中，使用HBV国际标准绘制标准曲线，然后比较所述标准曲线与测量值，从而估计分泌至上清液的HBsAg的绝对量。
6)免疫-荧光：由于可使用荧光显微镜直接地观察HBV感染而没有细胞裂解过程，免疫-荧光具有显著优点。将感染的细胞用低聚甲醛固定，然后使用triton X-100进行透化(permeablization)过程。接下来，用HBcAg抗体确认是否存在HBcAg感染。
7)HBV感染：在HepG2-NTCP细胞系中进行HBV感染。更具体地，在培养皿中接种HepG2-NTCP细胞后、和24小时后，将HBV接种物用于感染HepG2-NTCP细胞。在感染后16至24小时中，将培养基更换成含有2.5％DMSO的新的培养基。每两天更换培养基，并且在感染后8至10天中，已通过利用多种实验技术确认是否实现感染。
<2>GC1102的HBV感染抑制效力的评估
首先，已通过DNA印迹分析和HBsAg ELISA测量研究GC1102是否可抑制HBV感染。
实验的结果在图1中示出。(A)DNA印迹分析：在从HepG2-NTCP细胞的HBV感染起9天后的时间，通过DNA印迹测量衣壳DNA(capsid DNA，cap seed DNA)。与HBV感染同时，用MyrB(1μg/ml)、IgG(1μg/ml)或GC1102(1μg/ml)处理细胞。3.2kb HBV DNA用作大小标记物(sizemarker)。RC：松环DNA；DL：双链线性DNA；(B)HBsAg ELISA：在进行HBV感染后，分别测量存在于在感染后5至7天和感染后7至9天中培养2天的培养上清液中的HBsAg的浓度。使用已知浓度下的标准HBsAg产品，测量存在于培养上清液中的HBsAg(IU/ml)的绝对量。
作为实验的结果，确认GC1102(1μg/ml)可有效抑制HBV复制中间体(RC和DL DNA)的产生。此外，当量化存在于培养上清液中的HBsAg时，确认用GC1102处理的样品显示HBsAg的非常低的产生。在用作为阳性对照的MyrB处理的样品中，未观察到复制中间体和HBsAg。可选地，在用作为阴性对照的IgG处理的样品中，观察到复制中间体和HBsAg与仅进行HBV感染的样品相似。从上述实验结果，观察到GC1102可有效抑制HBV感染。
此外，通过免疫-荧光观察到GC1102的HBV感染抑制作用。更具体地，在从用HBV感染HepG2-NTCP细胞系起7天后的时间，通过共焦显微镜监测HBV核心蛋白(core protein)。与HBV感染同时，用1μg/ml MyrB、2μg/ml MyrB、100ng/ml GC1102、或200ng/ml GC1102处理细胞。细胞的核用DAPI染色(在图2中以蓝色或中灰色示出)，而用抗-HBcAg染色核心蛋白(在图2中以红色或浅灰色示出)。不存在荧光信号的背景在图2中以深灰色示出。
实验的结果在图2中示出。抗-HBcAg染色以浅灰色示出；DAPI染色以中灰色示出；背景以深灰色示出。如图所示，与HBV感染同时，用1μg/ml MyrB、2μg/ml MyrB、100ng/mlGC1102、或200ng/ml GC1102处理细胞。作为处理的结果，细胞中的核心蛋白的表达水平(抗-HBcAg染色，以浅灰色示出)与GC1102的浓度成比例地显著降低。此外，观察到用作为阳性对照的MyrB处理的实验组也显示与MyrB的浓度成比例的HBV核心蛋白的表达水平的减少。因此，从图1和2中示出的结果，可解释为GC1102抑制HBV感染，从而有效防止HBV蛋白以及复制中间体产物的表达。
<3>GC1102的HBV cccDNA形成抑制效力的评估
基于上述结果，为了进一步研究GC1102对作为慢性HBV感染决定性因素的共价闭合环状DNA(cccDNA)的形成的作用，进一步进行实验。
简要地，HBV的cccDNA指的是HBV个体进入目标细胞的肝细胞后HBV基因组DNA转化为质粒形式的附加体DNA，所述附加体DNA充当转录的模板。换言之，HBV基因组DNA转化为cccDNA的过程是HBV的基因组复制所必需需要的。
基于上述理论，另外进行实验来研究GC1102对作为慢性HBV感染决定性因素的共价闭合环状DNA(cccDNA)的形成的作用。更具体地，在用GC1102(100ng/ml或200ng/ml)或MyrB(1μg/ml)处理HepG2-NTCP后，在从处理起3天后的时间通过赫特(Hirt)DNA提取得到DNA，然后通过DNA印迹分析测量PF-RC DNA和cccDNA。3.2kb、2.1kb、1.9kb和1.4kb HBV DNA用作大小标记物。
实验的结果在图3中示出。根据实验结果，相比于仅进行HBV感染的泳道2，在使用用作阳性对照的MyrB处理的样品和用GC1102处理的样品中未发现cccDNA。该事实意为从PF-RC DNA至cccDNA的HBV基因组DNA转化由GC1102处理抑制。
<4>GC1102的HBV感染抑制的剂量-反应分析
接下来，使用多种HBV研究技术，研究GC1102浓度的HBV感染抑制作用，从而评价其治疗效力。与以2倍的速率从6.25至200ng/ml增加HepG2-NTCP细胞中的GC1102浓度同时，在6个点处进行剂量-反应研究。确认在本实验前进行的先前实验中使用的浓度下，通过细胞活性分析测定和验证非细胞毒性(数据未示出)。
实验的结果在图4中示出。已进行(A)DNA印迹；(B)蛋白质印记；(C)HBsAg ELSIA；和(D)HBeAg ELISA。DNA印迹和ELISA如图1所示的相同过程进行。此外，蛋白质印记(B)是使用为了进行DNA印迹分析得到的部分(6％输入)细胞裂解物测量细胞中的核心蛋白的量的结果。β-肌动蛋白是表明使用相同量的细胞裂解物的上样对照。
根据实验结果，细胞中的复制中间体产物和病毒核心蛋白的表达水平、和分泌至培养上清液的HBsAg和HBeAg以剂量依赖方式与增加量的GC1102成比例地降低。上述实验结果表明GC1102是不具有细胞毒性、并且根据浓度显示剂量-反应的有效的HBV抗病毒剂。
<5>GC1102的EC50(有效浓度)的评估
根据从图4示出的实验得到的结果的量化，计算EC50值。当进行HBV感染时，将从仅用IgG处理的样品得到的HBV感染程度设定为100％。然后，用不同浓度的GC1102处理的样品的值修正为上述程度的相对值，然后绘制抑制曲线(％)。
分析结果在图5中示出。当细胞用14.97ng/ml浓度的GC1102处理时，HBV感染被抑制50％。当通过应用GC1102的分子量(150kDa)将浓度转换为摩尔浓度(molarconcentration,'molarity')时，这类处理浓度约对应于100pM。上述实验结果表明即使在非常低的浓度(EC50＝100pM)下，GC1102可有效抑制HBV感染。
<6>根据GC1102(抗-HBsAg)处理时间的HBV感染抑制效力的评估
接下来，为了研究当HBV感染最有效抑制时，使用GC1102(抗-HBsAg)的处理时间，进一步进行实验。
实验的结果在图6中示出。(A)示出研究GC1102作用于HBV感染的阶段的实验方案。HBV感染和GC1102处理方案通过实线表示。(B)DNA印迹分析：HepG2-NTCP细胞进行如(A)所述的相同HBV感染和GC1102处理。然后，在从上述处理起9天后的时间，通过DNA印迹测量衣壳DNA。6％输入为通过使用为了进行DNA印迹得到的部分细胞裂解物测量细胞中的核心蛋白的量的结果。β-肌动蛋白是表明使用相同量的细胞裂解物的上样对照。
从实验结果，可确认，当GC1102给药与HBV感染同时进行时，最有效地完成GC1102的HBV感染抑制。该事实可解释为，因为在HBV感染时GC1102直接结合至HBV中的SORF的特异性表位从而在HBV中抑制对肝细胞(hepatocyte)的附着，由此有效降低感染。
<7>结论
通过上述实验，表明本发明的人类乙型肝炎病毒抗体(GC1102)是非现有的、并且非常有效的根本性抑制HBV感染的抗-HBV病毒。GC1102具有在非常低的浓度下的EC50值，并且已不仅有效抑制HBV的基因组DNA复制、还有效抑制已知为HBV基因组的转录模板的cccDNA的形成。因此，这些结果提出了一种新机会：GC1102可在肝移植患者中非常有效地抑制HBV感染，从而因此非常有效地预防肝移植后HBV复发，此外，慢性肝炎患者可通过单独的GC1102给药或与现有抗病毒治疗剂组合来有效地治疗。
序列表
<110> 财团法人牧岩生命科学研究所(MOGAM BIOTECHNOLOGY INSTITUTE)
<120> 用于防止乙型肝炎病毒的cccDNA形成的药物组合物
<130> 16PCT05004
<141> 2018-03-20
<150> KR 10-2015-0105277
<151> 2015-07-24
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> GC1102抗体的H链可变区(HBAb-H4)
<400> 1
Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Lys Tyr
20 25 30
Lys Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Thr Ser Arg Asp Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Gly Trp Leu Trp Gly Trp Asp Val Arg Ser Asn Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Asn Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> GC1102抗体的L链可变区(HBAb-L9)
<400> 2
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Asn Ser
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe Val Thr Pro Glu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> HB48-33、HB48-35或HB48-59抗体的H链可变区
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Leu Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly His Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Trp Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Pro Thr Trp Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> HB48-33抗体的L链可变区
<400> 4
Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 5
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> HB48-35抗体的L链可变区
<400> 5
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Asn
20 25 30
Val Asn Trp Phe Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser Val Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
100 105
<210> 6
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> HB48-59抗体的L链可变区
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Lys Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg

Claims (19)

1.一种用于防止乙型肝炎病毒的cccDNA形成的药物组合物，其含有乙型肝炎病毒抗体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒抗体适用于抑制所述乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒抗体包含：编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:1；和编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述乙型肝炎病毒抗体包含：编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:3；和编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NOs:4至6的任一种。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中在从所述乙型肝炎病毒感染时间起24小时内施用所述组合物。
6.一种防止乙型肝炎病毒的cccDNA形成的方法，其包括施用预防或治疗有效量的乙型肝炎病毒抗体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗体适用于抑制所述乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗体包含：编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:1；和编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗体包含：编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:3；和编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NOs:4至6的任一种。
10.根据权利要求6所述的方法，其中在从所述乙型肝炎病毒感染时间起24小时内施用所述组合物。
11.一种治疗慢性肝炎的方法，其包括施用根据权利要求1所述的药物组合物从而阻断乙型肝炎病毒的基因组DNA复制。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述慢性肝炎为慢性乙型肝炎。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗体包含：编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:1；和编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒抗体包含：编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体H链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:3；和编码针对所述乙型肝炎病毒的表面抗原的人类抗体L链可变区的氨基酸序列SEQ ID NOs:4至6的任一种。
15.一种筛选用于预防或治疗乙型肝炎的材料的方法，其包括：接种乙型肝炎病毒至肝细胞；和在用受试材料处理肝细胞后，确认cccDNA形成是否受到抑制。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肝细胞为HepG2-NTCP。
17.根据权利要求15所述的方法，其中在乙型肝炎病毒的接种后的24小时内处理所述受试材料。
18.根据权利要求15所述的方法，其中cccDNA形成是否受到抑制的确认通过包括以下来进行：(a)从使用所述受试材料的处理时间起2至10天后从肝细胞提取附加体DNA；和(b)测量所述附加体DNA中包含的cccDNA的量。
19.一种筛选乙型肝炎治疗补充剂的方法，其包括：
(a)使乙型肝炎病毒抗体和受试材料与包含乙型肝炎病毒的生物样品接触；和
(b)确认cccDNA形成是否受到抑制，和如果所述cccDNA形成比所述受试材料不与所述样品接触的情况减少，确定所述受试材料为与所述乙型肝炎病毒组合施用的治疗补充剂。
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