CN102631384A - 石榴在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石榴在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用，首先检测了各石榴来源的药物对HepG2.117的细胞毒性，安石榴苷、没食子酸、石榴皮鞣素的CC50依次为>500μM、334μM和218.86μM。接着检测了安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素对HBeAg和HBsAg的作用以及安石榴苷对病毒的DNA、RNA作用，结果显示这四种化合物都能抑制HBeAg和HBsAg，其中安石榴苷可以显著下调cccDNA。安石榴苷在HepG2.2.15细胞中显著下调HBeAg和cccDNA含量而对胞内总HBVDNA无作用，说明安石榴苷是以cccDNA为靶标，直接清除肝细胞中的cccDNA。目前用于临床治疗的抗HBV感染的药物都不能直接作用cccDNA，从而无法彻底清除病毒。实验结果揭示了该药物具有开发成抗乙型肝炎病毒感染药物的前景。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，更具体涉及一种石榴在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)发现于上世纪六十年代，是乙型肝炎的病原体。乙型肝炎病毒感染是全球范围内慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要成因之一。HBV主要通过血液、性、母婴等途径传播。全世界有1/4的人生活在HBV流行区域，有20亿人是HBV携带者，其中3.5到4亿人为慢性感染者，每年有近100万人死于由HBV引发的肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。
HBV属于嗜肝DNA病毒科哺乳动物病毒属的一员。完整的HBV颗粒直径仅为42nm，又名Dane颗粒，分为包膜与核心两个部分。包膜由通常所称的乙肝表面抗原(HBsAg)，即小表面蛋白(S蛋白)以及中表面蛋白(M蛋白)和大表面蛋白(L蛋白)构成，S蛋白含量最高。核心部分即病毒的核衣壳，直径约28nm，呈二十面体立体对称，主要含有核心抗原(HBcAg)等，核衣壳内即为HBV的基因组，是高度紧密、共价非闭合环状DNA分子，为病毒复制的主体。HBV基因组全长约3.2kb，，基因组高度重叠，其中负链DNA为完整长度，正链DNA则不完整。含有四个开放读码框(ORF)，即S区、C区、X区以及P区。S区主要编码上述S蛋白，M蛋白和L蛋白，C区主要编码HBcAg和HBeAg。X区和P区分别编码X蛋白和多聚酶蛋白P，前者具重要的调节功能，后者则是一种多功能聚合酶，具有逆转录酶、RNaseH活性，为HBV复制所必需。
HBV生活周期复杂，其通过前S1多肽与宿主肝细胞表面的一个或多个蛋白相互作用从而进入宿主体内。当病毒吸附到细胞上之后，病毒脱去包膜进入到肝细胞内，并脱衣壳。病毒的基因组(rcDNA)进入到细胞核内，rcDNA在病毒蛋白和宿主细胞因子的帮助下修复成共价闭合的环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)。细胞的RNA聚合酶II以cccDNA为模板转录出3.2kbHBV前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)和precore mRNA以及2.4、2.1和0.8kb三种长度的mRNA，分别编码核心蛋白(HBcAg)、HBeAg前体蛋白、病毒聚合酶P蛋白、前S1、前S2、HBsAg蛋白和X蛋白。pgRNA出核后，在胞质中形成εpgRNA，并与病毒的聚合酶P蛋白共价结合，诱发核衣壳化。在HBcAg聚集形成衣壳的同时，pgRNA经逆转录酶合成负链DNA，与此同时pgRNA被P蛋白的RNaseH亚基降解。然后DNA聚合酶以负链为模板合成正链，形成含有rcDNA的成熟的核衣壳。新合成的核衣壳绝大部分和病毒的表面蛋白在肝细胞的内质网和高尔基复合体中进行装配，形成新的具有感染性的病毒粒子，再以出芽的方式从肝细胞中释放出来。此外，一部分新合成的核衣壳又进入细胞核中，补充核内的cccDNA。
目前经欧美FDA批准的用于慢性HBV感染临床治疗的药物仅为免疫调节剂干扰素和核苷(酸)类似物两大类。干扰素有IFN-α和pegylated IFN-α，而临床显示其只对少数病人有效，但却需要注射给药，价格昂贵而且还有诸多副作用。核苷类似物近年发展迅速，已有五种应用于临床：拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦，均属于DNA聚合酶抑制剂，虽能有效的抑制病毒的复制，但并不能有效的清除感染细胞中的病毒，且长期用药容易导致病毒发生突变，从而导致耐药株的产生。近年来，一些针对HBV生活史的新的靶点的药物已在临床前或临床研究中。但这些药物都不能彻底清除病毒，也无直接作用于cccDNA的药物，故亟待研发新的抗HBV药物，特别是能直接抑制cccDNA形成或清除已存在于感染细胞核中的cccDNA。
石榴不仅可以食用，而且具有很多医用功能(降血脂、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗菌、治疗糖尿病、治疗腹泻以及抗蠕虫等)且无毒，已被用作中药运用到很多疾病的治疗中。在中国石榴果皮已经被用于治疗腹泻、子宫不规则出血、子宫渗血、腹痛，石榴花用于治疗糖尿病，在印度草药医学中其树皮和根用作驱虫药，而在南非则用石榴果治疗腹泻。由于石榴功能众多，且具有强大的抗氧化功能，现在已越来越受医药科研工作者的青睐。安石榴苷(Punicalagin)是从石榴里提取的天然小分子化合物，目前没有安石榴苷在抗乙型肝炎病毒方面的应用。其水解产物鞣花酸(Ellagic acid)、没食子酸(Gallic acid)和石榴皮鞣素(Punicalin)也都是石榴多酚的主要组成成分。目前虽有报道从叶下珠里分离的鞣花酸可以抑制HBeAg的分泌，但并无没食子酸和石榴皮鞣素在抗乙型肝炎病毒方面的作用的报道，也没有鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素在抗乙型肝炎病毒方面的应用。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，是在于提供了一种石榴及其成分安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用，从而为临床上乙型肝炎的治疗提供安全高效毒副作用小的中药和小分子化合物。其中安石榴苷在无毒性范围内能够有效地抑制受感染肝细胞内的cccDNA的形成，这是一种新靶点，因此可进一步开发为治疗或预防乙型肝炎病毒感染的药物，具有广泛的应用前景。
为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是：
一种石榴在制备治疗或预防乙型肝炎病毒药物中的应用，石榴提取物有四个单体化合物：安石榴苷，鞣花酸、没食子酸、石榴皮鞣素。
安石榴苷英文名punicalagin，化学名为2，3-(S)-Hexahydroxydiphenoyl-4，6-(S，S)-gallagyl-D-glucose，具有结构式I所示的结构式：
其中：H为氢，O为氧，-OH为羟基。
鞣花酸英文名为ellagic acid，化学名为2，3，7，8-Tetrahydroxy-chromeno[5，4，3-cde]chromene-5，10-dione，具有结构式II所示结构式：
其中：H为氢，O为氧，-OH为羟基。
没食子酸英文名为gallic acid，化学名为3，4，5-三羟基苯甲酸，具有结构式III所示结构式：
其中：H为氢，O为氧，-OH为羟基。
石榴皮鞣素英文名为punicalin，化学式为4，6-(S，S)-Gallagyl-D-glucose具有结构式IV所示结构式：
其中：H为氢，O为氧，C为碳，-OH为羟基，-CH2-为亚甲基。
安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素在制备治疗或预防乙型肝炎病毒(HBV)药物中的应用，其步骤是：
A.药物对HepG2.117的细胞毒性实验：HepG2.117细胞按8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后加入用培养基稀释的各浓度的药物，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养3天后，Alamarblue法检测细胞的存活率。结果显示，安石榴苷对HepG2.117的CC50(半数致死浓度)＞500μM，没食子酸的CC50为334μM，石榴皮鞣素的CC50为218.86μM，鞣花酸由于溶解性不好，不利于计算CC50。
B.药物抗乙型肝炎病毒活性的评价：将HepG2.117细胞按8×103个/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h后，开始加药处理。用DMEM培养基将各药物稀释成各种浓度，每组3个重复。将不同剂量药物加入到培养板中继续培养。72h后取培养基上清用ELISA法进行HBeAg和HBsAg的检测；结果显示安石榴苷可以有效的减少胞外HBeAg，其EC50为12.67μM，但对HBsAg无作用。鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素都能一定程度的抑制HBeAg和HBsAg。
C.安石榴苷对乙型肝炎病毒HBV cccDNA的作用的研究：(1)将HepG2.117细胞按4×104细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h后加药处理。用DMEM培养基将安石榴苷稀释成各种浓度，每组3个重复。将不同剂量药物加入到培养板中继续培养。在加药处理3d后收集细胞提取RNA，用RT-PCR半定量分析药物对HBV各种RNA的作用；(2)将HepG2.117和HepG2.2.15细胞按4×104细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h后加药处理。用DMEM培养基将安石榴苷稀释成所示浓度，每组3个重复。将不同剂量药物加入到培养板中继续培养。在加药处理3d、6d和9d的后收集细胞，分别提取胞内的总的HBV DNA和cccDNA并定量分析研究药物抗病毒活性。实验结果显示安石榴苷可以有效的下调precore mRNA和cccDNA含量。
D.安石榴苷和其他具有抗HBV活性化合物的联合用药：将HepG2.117和HepG2.2.15细胞按4×104细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h后加药处理。用DMEM培养基将安石榴苷和拉米夫定以及安石榴苷和拉米夫定组合物稀释成所示浓度，每组3个重复。将不同剂量药物加入到培养板中继续培养。在加药处理6d的后收集细胞，分别提取胞内的总的HBV DNA和cccDNA并定量分析研究药物抗病毒活性。结果发现将安石榴苷和拉米夫定的联合用药能有效地抑制胞内总的HBV DNA和cccDNA。
利用现代常用药物制剂手段，可将石榴制成中药和中成药，可将安石榴苷、鞣花酸、没食子酸、石榴皮鞣素和石榴多酚作为成活性成分制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。所述的石榴或石榴提取物安石榴苷、鞣花酸、没食子酸、石榴皮鞣素单体或石榴多酚其中的一种或二至五种的任意混合。所述的石榴或石榴提取物与拉米夫定的联合用药，石榴或石榴提取物还可以与拉米夫定同类的阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦的任意混合(进行联合用药)。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1.石榴是一种纯天然药物，毒副作用小，作为中药用于疾病的治疗已经有着悠久的历史。安石榴苷在大鼠体内的生物利用度和代谢、毒性已被充分研究，其生物利用度高，毒性小，代谢途径明确。
2.石榴中安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素等成分都能具有抗HBV活性。
3.在对安石榴苷进行抗病毒机制研究中发现其是以cccDNA为靶点抑制病毒复制的。在连续用药6天时10μM安石榴苷可以对cccDNA的抑制率可达到90％以上。慢性HBV感染难以彻底清除体内病毒，现在临床上尚未有可以有效清除cccDNA的药物。而此化合物可以直接抑制cccDNA的形成，将有可能彻底治疗慢性HBV感染。
4.可以口服给药，用药方便。
5、为非核苷类化合物，兼有抗炎、抗氧化等作用，故能提高治疗过程中的耐受性，提高治疗质量和给药依从性，减轻治疗痛苦。
附图说明
图1为一种安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素的化学结构式。
图2为一种安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素对HepG2.117的细胞毒性检测示意图。
图3为一种安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素对HBeAg和HBsAg的作用效果示意图。
其中3A为安石榴苷对HBeAg的剂量依赖抑制作用，3B为安石榴苷对HBsAg的作用，3C为鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素对HBeAg和HBsAg的作用。
图4为一种安石榴苷对HBV RNA作用效果示意图。
图5为一种安石榴苷在HepG2.117细胞中对HBV DNA作用效果示意图
图6为一种安石榴苷在HepG2.2.15细胞中对HBV DNA作用效果示意图
图7为一种安石榴苷和拉米夫定的联合用药对HBV DNA作用效果示意图
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。
细胞培养模型是最常用的筛选模型，其优点在于：可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物的有效浓度和治疗指数，为后期机理研究提供更多基础。由于HBV宿主范围狭窄，体外培养的细胞病毒感染性低，而且复制效率也极其低下，这严重阻碍了HBV研究进展。现今HBV稳定转染细胞系的成功构建以及HBV感染模型的建立都有效的促使人们对HBV有了更进一步的了解。本发明采用了HBV基因组稳转细胞系HepG2.117和HepG2.2.15检测安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素抗HBV活性。
实施例1：安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素抗HBV活性的评价
1.实验材料
1.1细胞和药物
HepG2.117细胞：人的肝癌细胞系，染色体中整合有HBV基因组，可支持HBV DNA合成、蛋白表达、可产生感染性病毒粒子。此细胞系由德国弗莱堡大学MichaelNassal教授和武汉病毒研究所胡康洪研究员惠赠。安石榴苷、鞣花酸、没食子酸购于四川维克奇生物科技有限公司，石榴皮鞣素购于武汉易泰科技有限公司上海分公司。
1.2试剂
DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；HBV表面抗原(S抗原)和e抗原检测试剂盒购于上海科华生物科技有限公司；Alamarblue试剂购自Invitrogen公司。
2.实验方法与结果
2.1安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素的细胞毒性检测
37℃，5％CO2加湿培养箱中培养。使用含有10％FBS、100U/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90％汇合度后传代，传代比例1/3-1/4。HepG2.117细胞按8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用培养基将安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素进行梯度稀释，每梯度3个复孔。培养72h后弃去培养上清，于每孔中加入100uL含有10％Alamarblue试剂的新的培养基，置细胞培养箱中继续培养。培养2h后用多功能检测仪分别测量荧光和吸光值，计算细胞存活率。
结果显示(图2)：安石榴苷对HepG2.117的CC50＞500μM，没食子酸的CC50为334uM，石榴皮鞣素的CC50为218.86uM。
2.2安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素抗HBV活性检测
将HepG2.117细胞按8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用培养基将安石榴苷、鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素进行梯度稀释，每梯度3个复孔。加药培养72h后收取培养上清，用ELISA检测试剂盒检测HBeAg和HBsAg。
结果显示(图3)：安石榴苷可以剂量依赖的抑制培养基上清中的HBeAg(图3A)，经SPSS软件计算，在HepG2.117细胞中安石榴苷在作用三天时对HBeAg的EC50为12.67μM。而对HBsAg无作用(图3B)，鞣花酸、没食子酸和石榴皮鞣素都可以一定程度的抑制HBeAg和HBsAg(图3C)。
所述的石榴在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物是以石榴或其抗HBV活性成分安石榴苷、鞣花酸、没食子酸、石榴皮鞣素等作为药物活性成分，制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂、中药、中成药任何一种药学上可接受的剂型。
实施例2：安石榴苷直接作用于肝细胞核中cccDNA而发挥抗病毒作用
1.实验材料
1.1细胞、质粒和药物
HepG2.117细胞：人的肝癌细胞系，染色体中整合有HBV基因组，可支持HBV DNA合成、蛋白表达、可产生感染性病毒粒子。此细胞系由德国弗莱堡大学Michael Nassal教授和武汉病毒研究所胡康洪研究员惠赠。HepG2.2.15为人源肝癌细胞，为武汉病毒研究所陈新文研究员惠赠；安石榴苷购于四川维克奇生物技术有限公司；拉米夫定为NIH馈赠。
1.2试剂
DMEM培养基购自GIBCO公司，Real-time PCR kit购自TOYOBO公司，Trizol试剂购于Roche。
2.实验方法与结果
2.1安石榴苷对HBV RNA的作用检测
将HepG2.117细胞按4×104个细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用培养基将药物进行稀释，每梯度3个复孔。加药培养72h后弃去培养上清，细胞用冷的PBS洗两遍后用Trizol试剂裂解提取胞内总的RNA，取2μg总RNA用无RNase的DNase处理并作逆转录PCR分析。所用引物如下表所示：
结果显示(图4)，安石榴苷可以显著下调precore mRNA，对HBV total RNA有微弱下调作用，但对pgRNA无作用。
2.2安石榴苷对HBV DNA复制作用的研究
在HepG2.117细胞中precore mRNA只能由形成的cccDNA转录而来，分泌的HBeAg可一定程度反应胞内的总的DNA，通过撤去四环素诱导HBV复制后对HBeAg和cccDNA进行动力学检测，发现胞外HBeAg水平和核内cccDNA含量呈线性关系。通过对HBV RNA转录、核心启动子活性和核心蛋白表达水平的检测，我们发现安石榴苷对HBV病毒基因的转录和表达无作用。故推测安石榴苷可以减少precore mRNA的模板cccDNA。将HepG2.117和HepG2.2.15细胞按4×104细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h后加药处理。用DMEM培养基将安石榴苷进行稀释，每组3个重复。将不同剂量药物加入到培养板中继续培养。在加药处理3d、6d和9d时收集细胞，分别提取胞内的总的HBV DNA和cccDNA并做q-PCR定量分析药物对HBV DNA的作用。
引物如下所示：
结果显示：在HepG2.117细胞中(图5)，安石榴苷作用3d便对cccDNA有一定的抑制作用，在作用时间延长至6d时抑制效果非常显著，10μM的安石榴苷便可达到90％的抑制效果；而安石榴苷在药物作用3d时对胞内总的HBV DNA无作用，只有当作用时间延长至6d时，才能有效的抑制总DNA；在HepG2.2.15细胞中(图6)安石榴苷只有在药物作用时间延长至6d时才对cccDNA有剂量依赖的抑制作用，给药作用9d时抑制效果显著(10μM抑制率71％)；在HepG2.2.15细胞中直到药物作用时间延长至9d，安石榴苷都对胞内总的DNA无抑制作用。阳性药物核苷类似物拉米夫定可以有效的抑制总DNA，而对cccDNA无显著影响。实验结果说明安石榴苷是直接以cccDNA为药物靶标，可以有效清除感染细胞内的cccDNA。
实施例3：安石榴苷与拉米夫定的联合用药
1.实验材料
1.1细胞、质粒和药物
HepG2.117细胞：人的肝癌细胞系，染色体中整合有HBV基因组，可支持HBV DNA合成、蛋白表达、可产生感染性病毒粒子。此细胞系由德国弗莱堡大学Michael Nassal教授和武汉病毒研究所胡康洪研究员惠赠。HepG2.2.15为人源肝癌细胞，为武汉病毒研究所陈新文研究员惠赠；安石榴苷购于四川维克奇生物技术有限公司；拉米夫定为NIH馈赠。
1.2试剂
DMEM培养基购自GIBCO公司，Real-time PCR kit购自TOYOBO公司，2.实验方法与结果
将HepG2.117和HepG2.2.15细胞按4×104细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱中培养24h后加药处理。用DMEM培养基将安石榴苷和拉米夫定以及安石榴苷和拉米夫定组合物稀释成所示浓度，每组3个重复。将不同剂量药物加入到培养板中继续培养。在加药处理6d的后收集细胞，分别提取胞内的总的HBVDNA和cccDNA并定量分析研究药物抗病毒活性。结果显示安石榴苷和拉米夫定的联合用药能有效地抑制胞内总的HBVDNA和cccDNA(图7)。
Claims (6)
1.一种石榴在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的石榴为石榴或石榴提取物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述石榴提取物为安石榴苷、鞣花酸、没食子酸、石榴皮鞣素单体或石榴多酚。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的石榴或石榴提取物作为活性成分制成任何一种药学上可接受的药用的剂型。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的石榴或石榴提取物安石榴苷、鞣花酸、没食子酸、石榴皮鞣素单体或石榴多酚其中的一种或二至五种的任意混合。
6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的石榴或石榴提取物与拉米夫定任意混合。
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| CN102885841A (zh) * | 2012-09-28 | 2013-01-23 | 中国医学科学院医学实验动物研究所 | 安石榴苷的应用 |
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