CN113069445A

CN113069445A - 牛防风素作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途

Info

Publication number: CN113069445A
Application number: CN202110514966.7A
Authority: CN
Inventors: 陈娟; 黄爱龙; 任放; 程胜桃; 任吉华
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2021-05-11
Filing date: 2021-05-11
Publication date: 2021-07-06
Also published as: AU2021107213A4; WO2022237007A1

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了牛防风素作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。本发明首次发现牛防风素(Sphondin，简称Sph)能够抑制HBV分泌HBsAg、抑制HBV RNAs的转录水平、抑制HBV core DNA的复制水平、抑制cccDNA转录活性、抑制肝组织内HBV RNAs，HBV DNA，HBV S蛋白及X蛋白水平，具有明显的乙型肝炎治疗功能，可用于制备能降低HBsAg水平并抑制cccDNA转录的新型抗HBV药物，在乙肝治疗方面具有广阔的应用前景。

Description

牛防风素作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及牛防风素作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是嗜肝DNA病毒科家族中的一员，HBV感染与急慢性肝炎、肝硬化和肝癌的发生发展息息相关。据统计，全球约20亿人曾感染过HBV，其中约3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌等严重疾病。我国属于乙型肝炎的高发区，虽然乙肝疫苗已经进入国家基础免疫范围，却不能完全消除HBV。据2006年全国人群乙肝血清流行病学调查，1～59岁一般人群的乙肝表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)携带率为7.18％，由于我国人口众多，据此推算，我国仍有HBsAg携带者约9300万人。母婴传播较难预防，并且有10％的成年人和5％的未成年人无法被疫苗免疫，他们成为潜在感染风险最大的人群。乙型肝炎病毒感染及所致疾病，不仅严重危害着人们的身体健康，而且也是一个严重的社会公共卫生问题。因此，治疗慢性HBV感染，阻止乙肝相关性疾病的进展是事关全球公共健康的重要任务。

而目前被美国食品药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)批准用于慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB)的药物仅两类：靶向pol蛋白的核苷类似物(Nucleotide analog，NAs)和靶向病毒转录的干扰素类(Interferons，IFNs)，它们分别通过免疫调节和干扰HBV复制发挥抗病毒作用。而IFN-a因其应答率低，不良反应多，耐受性差，价格昂贵且治疗对象局限等受到诸多应用限制。近年来，NAs药物发展迅速，已成为首选抗病毒治疗药物，在临床上得到广泛应用。尽管NAs药物具有较强的抑制病毒DNA的能力，但NAs不能彻底清除患者体内的HBsAg以及HBV复制的源头-HBV共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，cccDNA)，并且NAs需长期服药，可能导致HBV聚合酶变异而引起耐药，多数NAs药物停药后病毒载量会发生反弹，极大限制了此类药物的应用。因此，有必要研发具有全新作用机制和作用靶点的抗HBV药物。

HBV有着复杂的生活周期，当病毒颗粒接触到肝细胞膜，在受体(NTCP)的介导下入胞，经过内化释放出病毒核衣壳蛋白(core protein)包裹的松弛环状DNA(rc DNA)。rcDNA在宿主DNA聚合酶和拓扑异构酶的作用下发生一系列切除修复反应，最终形成具有超螺旋结构的cccDNA。cccDNA是建立持续感染的关键分子，在宿主RNA聚合酶II的作用下，转录产生4种RNA转录体。precore RNA负责HBV核心蛋白的编码及HBeAg的形成；2.4/2.1-kb RNA则负责包膜蛋白(L，M，S)的形成；0.7-kb RNA最终形成HBx。而最大的前基因组RNA(PregenomicRNA，pgRNA)则在HBV多聚酶作用下形成rcDNA，继续补充cccDNA池。HBV难以治愈，与cccDNA长期稳定存在密切相关，此外，包膜蛋白可整合到宿主基因组DNA，因此病人血清中存在大量的HBsAg，难以阴转。基于此，本发明拟寻找出能有效降低HBsAg并关闭cccDNA转录的新型抗HBV药物。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供牛防风素作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途，为有效降低HBsAg并关闭cccDNA转录提供一种新的抗HBV药物和治疗手段。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供了牛防风素作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物至少具有以下功用之一：

抑制HBV分泌HBsAg、抑制HBV RNAs的转录水平、抑制HBV core DNA的复制水平、抑制cccDNA转录活性、抑制肝组织内HBV RNAs，HBV DNA，HBV S蛋白及X蛋白水平。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物必然包括牛防风素，并以牛防风素作为前述功用的有效成分。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为牛防风素，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

进一步，所述牛防风素作为所述乙型肝炎治疗药物的有效成分之一或唯一有效成分。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

进一步，所述乙型肝炎治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明第二方面提供一种治疗乙型肝炎的药物制剂，包括安全有效剂量的牛防风素。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂中，必然包括牛防风素，并以牛防风素作为前述功用的有效成分。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂中，发挥前述功用的有效成分可仅为牛防风素，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

进一步，所述牛防风素作为所述治疗乙型肝炎的药物制剂的有效成分之一或唯一有效成分。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

进一步，所述治疗乙型肝炎的药物制剂主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明第三方面提供一种治疗乙型肝炎的方法，为向对象施用牛防风素。

进一步，所述对象可以为哺乳动物或哺乳动物的乙型肝炎细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述乙型肝炎细胞可以为离体乙型肝炎细胞。

进一步，所述对象可以是罹患乙型肝炎的患者或者期待治疗的乙型肝炎的个体。或者，所述对象为乙型肝炎患者或者期待治疗乙型肝炎的个体的乙型肝炎细胞。

进一步，所述牛防风素可以在接受乙型肝炎治疗前、中、后向对象施用。

本发明第四方面提供一种乙型肝炎联合治疗药物组合，包括安全有效剂量的牛防风素和至少一种其他乙型肝炎治疗药物，余量为药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述乙型肝炎联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

(一)将牛防风素和其他乙型肝炎治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他乙型肝炎治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他乙型肝炎治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

(二)将牛防风素和其他乙型肝炎治疗药物配置成复方制剂，在将牛防风素和其他乙型肝炎治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明第五方面提供一种治疗乙型肝炎的方法，为向对象施用有效量的牛防风素以及向对象施用有效量的其他乙型肝炎治疗药物和/或向对象实施其他乙型肝炎治疗手段。

进一步，可以同步地或顺序地给予有效剂量的牛防风素和至少一种有效剂量的其他乙型肝炎治疗药物。

基于牛防风素为本发明首次发现的乙型肝炎治疗药物，在与牛防风素以外的其他乙型肝炎治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于乙型肝炎的治疗作用。

进一步，其他的乙型肝炎治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。

进一步，所述牛防风素可以是胃肠道给药或者胃肠外给药，所述其他乙型肝炎治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物，一般采用胃肠外给药。

本发明第六方面提供了牛防风素在制备具有以下任一项或多项作用的物质中的用途：

用于制备抑制HBV分泌HBsAg的物质的用途、用于制备抑制HBV RNAs的转录水平的物质的用途、用于制备抑制HBV core DNA的复制水平的物质的用途、用于制备抑制cccDNA转录活性的物质的用途、用于制备抑制肝组织内HBV RNAs，HBV DNA，HBV S蛋白及X蛋白水平的物质的用途。

如上所述，本发明的牛防风素作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途，具有以下有益效果：

本发明首次发现牛防风素(Sphondin，简称Sph)能够抑制HBV分泌HBsAg、抑制HBVRNAs的转录水平、抑制HBV core DNA的复制水平、抑制cccDNA转录活性、抑制肝组织内HBVRNAs，HBV DNA，HBV S蛋白及X蛋白水平，具有明显的乙型肝炎治疗功能，可用于制备能降低HBsAg水平并抑制cccDNA转录的新型抗HBV药物，在乙肝治疗方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1显示为经MTT实验体外验证Sph的毒性作用的实验结果图。

图2显示为经ELISA实验验证Sph对细胞内外HBsAg的抑制作用的实验结果图。

图3显示为经qRT-PCR和Northern blot实验验证Sph对HBV RNAs的抑制作用的实验结果图。

图4显示为经q-PCR及Southern blot实验验证Sph对HBV core DNA的抑制作用的实验结果图。

图5显示为经Taq-Man探针PCR实验和RNA-Seq验证Sph对cccDNA水平及转录活性的影响的实验结果图。

图6显示为经人肝嵌合小鼠模型实验体内验证Sph抗病毒活性的实验结果图。

具体实施方式

牛防风素，Sphondin，简称Sph，又名6-甲氧基当归素。本发明通过高通量ELISA实验发现，Sph能有效抑制HBV分泌的HBsAg，并在多个肝癌细胞系及人原代肝细胞(PHH)上均未表现出明显毒性。经Western blot及Dot blot再次证实，Sph能有效降低细胞内外HBsAg。经RT-PCR实验及Northern blot试验证明，Sph能抑制HBV RNA的水平。同时，本发明也发现Sph对HBV core DNA也具有浓度依赖性的抑制作用。然而，本发明未发现Sph对HBV转录模板cccDNA有明显的抑制作用，但有趣的是本发明发现其能有效降低cccDNA的转录活性。此外，本发明使用人肝嵌合小鼠模型进行体内实验，将小鼠感染HBV后持续培养8周，使其稳定复制HBV后给与Sph处理，通过检测血清及肝组织中病毒指标发现，Sph可以显著减低小鼠血清中HBsAg，HBV DNA的水平，以及肝组织内HBV RNAs，HBV DNA，HBV S蛋白及X蛋白的水平。

上述结果表明，牛防风素Sph通过抑制cccDNA转录活性来影响HBV RNAs的生成，进一步导致病毒蛋白及DNA等病毒学指标下降，是一种潜在的、新型的可同时降低HBsAg水平且抑制cccDNA转录的抗HBV药物。

基于此，本发明提供了以牛防风素作为有效成分用于制备乙型肝炎治疗药物。通常，所述乙型肝炎治疗药物除了包括安全有效剂量的牛防风素外，根据不同药物剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与牛防风素相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

另外，本发明还提供一种乙型肝炎联合治疗药物组合和施用方法。所述乙型肝炎联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

(一)将牛防风素和其他乙型肝炎治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。

当其他乙型肝炎治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型，如静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。

当其他乙型肝炎治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

需要注意的是，本发明中的联合用药是指合理的联合用药，应以提高疗效和(或)降低不良反应为基本原则。联合用药时，药物的相互作用，应包括影响药动学的相互作用，应包括影响药效学的相互作用。联合用药时，应尽量减少用药种类，减少药物相互作用引起的药物不良反应，避免影响药物疗效或增加毒性，避免产生相反的结果。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1

一、实验方法

1.细胞培养与转染

HepG2-NTCP细胞系培养于含有10％胎牛血清、2μg/mL强力霉素的DMEM培养基中；PHH细胞培养于HM培养基；Huh-7细胞系培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中。所有细胞均在含5％CO2，37℃孵箱中常规培养。

2.MTT实验

用DMSO溶解Sph，配制成50mM存储液。将1.5×10⁴Huh-7、PLC/PRF/5、PHH细胞或2×10⁴HepG2-NTCP细胞等接种于96孔板中，24小时后，用生长培养基将Sph存储液进行倍比稀释，并依次得到500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.95μM 9个浓度；并以无药处理组为对照，纯培养基为空白，每个浓度3个复孔，每孔分别加100μl药物溶液。72h后，加入MTT试剂10μl，37℃孵育4h，吸干上清，加入100μl DMSO溶液，摇床振荡10min后于490nm检测OD值，计算CC50值。

3.ELISA实验

收集Sph处理后的细胞上清，2000g离心3min去除细胞碎片，取上清于新的1.5mlEP管中，稀释一定倍数后，按照酶联免疫吸附试验试剂盒(上海科华)操作说明，于450nm检测细胞培养上清中HBsAg的OD值。

4.Western blot实验

取出待检测细胞，加入适量RIPA(含PI)裂解细胞提取总蛋白；取30μg总蛋白95℃变性后采用SDS-PAGE变性凝胶分离蛋白；采用BioRad湿式转移法将蛋白转移至PVDF膜，用5％脱脂牛奶室温封闭2h；根据实验目的加入一抗4℃孵育过夜；次日，洗膜后加入对应二抗室温孵育2h；最后，ECL显影，分析数据。以GAPDH为内参。

5.RNA提取与检测

PBS清洗细胞后，采用TRizol法提取细胞总RNA，取1μg RNA使用TIANGEN公司FastKingRT Kit逆转录RNA合成cDNA，然后进行qRT-PCR检测目的基因。

total HBV RNAs forward：5’-ACCGACCTTGAGGCATACTT-3’(SEQ ID NO.1)，totalHBV RNAs reverse：5’-GCCTACAGCCTCCTAGTACA-3’(SEQ ID NO.2)；HBV 3.5-kb mRNAforward：5’-GCCTTAGAGTCTCCTGAGCA-3’(SEQ ID NO.3)，HBV 3.5-kb mRNA reverse：5’-GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3’(SEQ ID NO.4)。

每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次。以β-actin为内参。

6.HBV core DNA的提取与检测

PBS清洗细胞后，加入0.5ml细胞裂解液(10mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA，1％NP-40，2％sucrose)，混匀后，37℃孵育15min，收集细胞裂解液，15000g离心5min。转移上清，并加入40U/ml DNaseI和10mM MgCl₂，37℃孵育4h后加入200μl 35％PEG8000(含1.5mol/L NaCl)，冰浴1h后11,000g×10min 4℃离心，弃上清，加入0.5ml蛋白酶K消化液(0.5％SDS，150mM NaCl，25mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA)和0.5mg/ml蛋白酶K(promega)，45℃水浴过夜。次日等体积酚氯仿抽提，70％乙醇沉淀，灭菌ddH₂O溶解HBVDNA。产物进行q-PCR定量。HBV DNA引物，F：CCTAGTAGTCAGTTATGTCAAC(SEQ ID NO.5)，R：TCTATAAGCTGGAGGAGTGCGA(SEQ ID NO.6)。每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次。

7.小鼠模型构建与药物处理

购买雄性人肝嵌合小鼠15只，将新鲜病人血清以尾静脉方式注射到小鼠体内，正常喂养8周后检测小鼠体内HBV复制水平，并随机分为3组：对照组(注射等体积不含药物的溶质)、Sph组(2.5mg/kg/2days，腹腔给药)、ETV+Sph组(ETV：0.02mg/kg/2days灌胃给药)。每4天眼眶采血分离血清冻存于-80℃，第7周时颈脱臼处死小鼠，钝性分离小鼠肝脏，切取较大完整的组织块，进行石蜡包埋切片，剩余组织待磨并提取DNA及RNA。

8.小鼠血清病毒DNA提取

使用Biospin病毒DNA提取试剂盒(BioFlux)，取10μl血清于190ul生理盐水中，加入l0μl蛋白酶K于一只新的1.5ml离心管中，然后加入200μl裂解液，振荡混匀5-10秒。56℃温育15分钟。于上述离心管中加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀5-10秒。按照试剂盒操作说明，使用试剂盒中纯化柱完成病毒DNA的提取，并将DNA样品保存于-20℃。

9.组织DNA、RNA提取

分离小鼠肝脏，并于液氮中将组织块碾磨成干粉，称取约20mg干粉于1.5ml离心管中，分别加入DNA裂解液和Trizol打磨。打磨均质后，DNA使用Biospin组织基因组DNA提取试剂盒(BioFlux)提取，加入600μl的FL Buffer和10μl PK solution，充分混匀，并用小型分散机(T10 basic ULTRA-

)辅助裂解，于56℃温育15分钟使组织充分裂解后按照试剂盒操作说明，使用试剂盒中纯化柱完成病毒DNA的提取，并将DNA样品保存于-20℃。RNA同细胞RNA提取法提取。

10.免疫组织化学

将石蜡包埋切片置于55℃烤箱过夜；次日置于95℃烤箱继续烘烤10min；立即依次置于二甲苯和浓度梯度的乙醇中进行脱蜡处理。微波炉抗原修复两次，随后加入0.5％Triton-100/PBS透膜20min；内源性过氧化物酶阻断剂去除内源性过氧化物酶；滴加山羊工作血清封闭非特异性位点；加入HBs抗体孵育过夜；次日，洗片后依次滴加生物素标记的第二抗体、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶试剂；最后滴加新鲜配制的DAB显色试剂显色3-5min；苏木素室温复染1min，自来水冲洗返蓝；脱水封片，镜下观察。

11.统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计，两组间比较采用配对t检验和多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

二、实验结果

1.MTT实验检测Sphondin的细胞毒性

如图1所示，MTT结果显示牛防风素(Sph)在多个肝癌细胞系及PHH细胞上CC50均大于500μM，且RNA-seq表明Sph作用后对人肝脏特异性因子无明显影响，表明Sph对细胞的毒性较小。

2.Sphondin抑制HBsAg的表达

在HBV感染的PHH及HepG2-NTCP细胞上给予Sph处理，检测药物处理后HBsAg的分泌水平及细胞内表达水平。结果显示Sph呈浓度梯度依赖性及时间梯度依赖性地降低细胞内外HBsAg，EC50分别为18.08μM，13.17μM(图2)。

3.Sphondin抑制HBV RNAs的转录水平

HBsAg是由HBV 2.4/2.1-kb RNA翻译而来，为检测HBV RNAs是否受到Sph抑制，在HBV感染的PHH及HepG2-NTCP细胞上给予不同浓度Sph处理，并收集不同时间点的细胞提取总RNA。qRT-PCR及Northern blot结果均显示Sph呈浓度梯度依赖性及时间梯度依赖性地降低HBV RNAs(包括3.5-kb RNA及2.4/2.1-kb RNA)，EC50分别为23.48μM及19.24μM(PHHs)，9.26μM及6.14μM(HepG2-NTCP细胞)(图3)。

4.Sphondin抑制HBV core DNA的复制水平

HBV 3.5-kb RNA可进一步逆转录生成HBV core DNA，为检测Sph是否同样能抑制HBV core DNA的水平，同样地，在HBV感染的PHH及HepG2-NTCP细胞上给予浓度梯度的Sph处理，q-PCR及Southern blot检测细胞内HBV core DNA的水平。结果显示：Sph呈浓度梯度依赖性地降低HBV core DNA的水平(图4)。

5.Sphondin抑制cccDNA的转录活性

在明确Sph对HBV各个病毒学指标的抑制作用后，我们进一步验证其对HBV转录模板cccDNA的作用。而Taq-Man探针PCR显示Sph对cccDNA的复制水平无明显抑制作用，而有趣的是它能有效抑制cccDNA的转录活性；同时RNA-Seq也发现Sph能有效降低HBV各个转录本的水平(图5)。

6.Sphondin体内毒性检测

为了探究Sph在体内的抗病毒效应，我们首先检测了Sph在小鼠体内的毒性作用。将15只6-8周龄的BALB/c小鼠随机分别为3组，分别采用不同剂量的Sph进行处理(分别为0mg/kg组、2.5mg/kg组、5mg/kg组)，每两天经腹腔给药一次同时监测小鼠体重。连续处理28天后经眼球采血检测血常规和血生化指标。如表1所示，Sph处理对小鼠体重、白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、总蛋白、白蛋白、ALT、AST、GGT、总胆红素、血肌酐和血尿素均无明显影响。说明Sph在体内毒性较小，无明显肝肾毒性。因此，我们采用了2.5mg/kg的浓度进行后续实验(表1)。

表1.Sphondin对小鼠体重、血常规以及血生化指标的影响

表1中所有值均表示为平均值±标准偏差。

表1中的缩写：WBC，white blood cell，白细胞；RBC，red blood cell，红细胞；HGB，Hemoglobin，血红蛋白；HCT，Hematocrit，红细胞压积；PLT，Platelets，血小板；MCV，Mean Corpusular Volume，平均红细胞容积；MCH，Mean Corpusular Hemoglobin，平均红细胞血红蛋白含量；BUN，blood urea nitrogen，血尿素氮；TP，Total protein，血清总蛋白；ALB，Albumin，白蛋白；ALT，alanine transaminase，丙氨酸氨基转移酶；AST，aspartatetransaminase，天冬氨酸氨基转移酶；ALKP，alkaline phosphatase，碱性磷酸酶；GGT，γ-glutamyl transpeptidase，尿谷氨酰转肽酶；TBIL，total bilirubin，总胆红素。

与0mg/kg/2days的Sphondin组相比，无显著性(p＞0.05)。

7.人肝嵌合小鼠模型上验证Sphondin体内抗病毒效能

将HBV感染8周后的人肝嵌合小鼠随机分成3组(分别为对照组、2.5mg/kg组、ETV+Sph组)，每组4只。每2天给药一次，每4天眼眶采血。持续7周后颈脱臼处死小鼠后取肝。检测小鼠血清中HBsAg及HBV DNA的水平，肝组织内HBV RNAs、HBV DNA及HBs、HBx蛋白水平。结果显示Sph能有效降低血清中HBsAg及HBV DNA的水平，肝组织内HBV RNAs、HBV DNA及病毒蛋白的水平，尤其对HBV RNAs、HBsAg及HBx抑制作用较为明显；此外，与ETV(恩替卡韦)联用后可加强其抗病毒效果(图6)。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学

<120> 牛防风素作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途

<130> PCQYK2110554-HZ

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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accgaccttg aggcatactt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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gcctacagcc tcctagtaca 20

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<400> 3

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<400> 4

gagggagttc ttcttctagg 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> HBV DNA 引物F

<400> 5

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> HBV DNA 引物R

<400> 6

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Claims

1.牛防风素作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述乙型肝炎治疗药物至少具有以下功用之一：抑制HBV分泌HBsAg、抑制HBV RNA水平HBV RNAs的转录水平、抑制HBV core DNA的复制水平具有浓度依赖性的抑制作用、抑制cccDNA转录活性、抑制肝组织内HBV RNAs，HBVDNA，HBV S蛋白及X蛋白水平。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述乙型肝炎治疗药物必然包括牛防风素，并以牛防风素作为前述功用的有效成分。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述牛防风素作为所述乙型肝炎治疗药物的有效成分之一或唯一有效成分。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述乙型肝炎治疗药物的形式选自固体、液体、凝胶、半流质、气雾。

6.一种治疗乙型肝炎的药物制剂，其特征在于：包括安全有效剂量的牛防风素。

7.根据权利要求6所述的治疗乙型肝炎的药物制剂，其特征在于：所述牛防风素作为所述治疗乙型肝炎的药物制剂的有效成分之一或唯一有效成分。

8.一种乙型肝炎联合治疗药物组合，其特征在于：包括安全有效剂量的牛防风素和至少一种其他乙型肝炎治疗药物。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述乙型肝炎联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

(一)将牛防风素和其他乙型肝炎治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同；

10.牛防风素在制备具有以下任一项或多项作用的物质中的用途：用于制备抑制HBV分泌HBsAg的物质的用途、用于制备抑制HBV RNAs的转录水平的物质的用途、用于制备抑制HBV core DNA的复制水平的物质的用途、用于制备抑制cccDNA转录活性的物质的用途、用于制备抑制肝组织内HBV RNAs，HBV DNA，HBV S蛋白及X蛋白水平的物质的用途。