CN103191105B - 一类呋喃香豆素类化合物在制备抗乙型肝炎病毒(hbv)药物中的应用 - Google Patents
一类呋喃香豆素类化合物在制备抗乙型肝炎病毒(hbv)药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物用途发明领域，具体地，公开了一类呋喃香豆素类化合物在制备抗乙型肝炎病毒（HBV）药物中的应用。所述化合物与当前上市抗HBV药物不同，属于非核苷类化合物，经细胞学试验研究表明，该类化合物能够抑制乙型肝炎病毒DNA的复制，并能抑制HBsAg和HBeAg的分泌；细胞毒性测试表明该类化合物具有很小的毒性，因此，此类化合物可安全用于制备治疗和/或预防由HBV感染引起的相关疾病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及药物用途发明领域，具体地，涉及一类呋喃香豆素类化合物在制备抗乙型肝炎病毒（HBV）药物中的应用。
背景技术
乙肝病毒（Heptatis B Virus，HBV），属于噬肝性病毒科小DNA病毒。该病毒于1965年被丹娜（Dane）发现，并将其命名为丹娜（Dane）颗粒(Seeger and Mason 2000)。HBV特异性的感染肝细胞，引起肝细胞炎性反应，产生乙型肝炎（Heptatis B）。HBV复制过程中，产生的cccDNA难以根除，易导致慢性乙型肝炎的产生(Bowden, Jackson et al. 2004)。流行病学研究证实：HBV感染是慢性肝炎发生的重要因素，同时也是肝硬化、肝癌等严重肝病发生的主要原因(Perz, Armstrong et al. 2006)。HBV感染已对全球人类健康构成重大威胁。核苷类药物（NAs）及干扰素是目前美国FDA批准可用于临床治疗乙型肝炎的两类药物。由于慢性乙型肝炎感染需要长期应用，加之NAs耐药形势严峻，干扰素治疗无应答现象，严重地限制了这两类药物的使用。FDA批准上市的5个抗HBV NAs药物，均已出现耐药病毒株，且出现交叉耐药现象。拉米夫定（3TC）作为第一个应用于乙型肝炎治疗的NA类药物，在连续用药两年后，耐药发生率高达50%，且病毒大部分突变位点对其他NA类药物耐药。NAs治疗乙型肝炎受到了极大的挑战。抑制HBV病毒复制（以NAs为代表），激活人体自身免疫系统清除HBV（以干扰素为代表），是目前抗HBV药物开发的主要方向。当前，处于抗HBV药物临床研究的药物主要是围绕着这两个方向进行，但是，由于耐药性和免疫应答失败，加之cccDNA无法清除，这两类药物很难根治乙型肝炎。因此，目前医药界迫切的需求一种针对HBV感染的特效药物问世，以改善HBV相关恶性疾病的治疗效果。
开发新靶标及非核苷类似物是解决上述问题的关键。目前尚未有非核苷类抗HBV小分子药物被批准用于HBV感染的治疗。随着人们对HBV发病机理的深入研究，抗HBV药物开发靶标已经从病毒吸附、DNA复制、组装、释放各个环节相关蛋白、酶等，延伸到人类自身相应靶标。人体内多种受体或蛋白如核转录因子kappa B 受体（NF-κB）是HBV复制重要的辅助因子，干扰这些辅助因子的功能，能有效的抑制HBV复制，NF-κB在慢性乙型肝炎病毒感染及致肝细胞癌发生过程中发挥着重要作用(Tai, Tsai et al. 2000)。研究发现，IFN-α/β、IL-1和Toll-样受体信号关键的信号转换器蛋白MyD88通过激活NF-κB来达到抑制HBV效果的，阻断NF-κB信号通路，则废除了MyD88抑制HBV复制的功能(Xiong, Wang et al. 2004)。干扰NF-κB正常功能，对HBV复制及HBV引起的免疫炎症反应有抑制作用。因此以NF-κB为药物靶点，是开发新型抗HBV药物的理想方向。
呋喃香豆素类化合物是一种具有很强的生理活性、药理活性及生物活性的天然产物。具有抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、增强自身免疫能力、抗细胞增生、抗菌、抗艾滋病、抗疲劳及钙拮抗性等功效。目前，还没有关于呋喃香豆素类化合物用于制备抗乙型肝炎病毒（HBV）药物的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中缺乏不易耐药、能根治乙型肝炎病毒的药物的缺陷，提供一类呋喃香豆素类化合物在制备抗乙型肝炎病毒（HBV）药物中的应用。
本发明通过以下技术方案予以实现上述目的：
本发明的设计思路是以人类NF-κB DNA结合位点为药物设计靶点，通过计算机药物虚拟筛选技术筛选获得一系列化合物可能具有人类NF-κB抑制活性，然后在细胞水平对筛选获得的化合物进行抗HBV复制抑制实验，发现其中一类高治疗指数的新型呋喃香豆素类化合物可以有效抑制HBV DNA复制，并且能抑制HBV表面抗原（HBsAg）和E抗原（HBeAg）分泌。所以，此类呋喃香豆素类化合物可安全用于制备治疗和/或预防乙型肝炎病毒药物，尤其是用于治疗和/或预防HBV感染引起的急慢性肝炎。
本发明所选取的化合物均为现有的化合物。计算机筛选指的是运用计算机辅助药物设计相关软件，如Discovery Studio之类的药物设计软件,采用分子对接、相似度检索等技术手段对现有的化合物库进行筛选，筛选得到的化合物进行生物活性测试。
一类呋喃香豆素类化合物、其药学上可接受的盐或酯或含有它们中任一种的药物组合物在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用，所述呋喃香豆素类化合物的结构式如式（Ⅰ）所示：
其中，R1为氢、烷基或糖苷，R2为氢、甲基或羟基，R3为氢、烷基、烃基或烷氧基，R4为氢、烷基、羟基或烷氧基，R5为氢、羟基、烷基或烷氧基，R1~R5不能同时为氢。
优选地，所述R1为氢、C1~C10的烷基或糖苷，R2为氢、甲基或羟基，R3 为氢、烃基、烷基或C1~C10的烷氧基，R4为氢、羟基、C1~C10的烷基或C1~C10的烷氧基，R5 为氢、羟基、烷基或C1~C10的烷氧基。
术语“烷基”是用于表示饱和烃基，C1~C10的烷基是指含有1~10个碳原子的饱和烃基；“烃基“是用于表示碳、氢两种原子的官能团，可以看作是相应的烃失去一个氢原子(H)后剩下的自由基。
进一步地，所述药学上可接受的盐为结构式如式（Ⅰ）所示呋喃香豆素类化合物与酸或碱形成的药学上可接受的盐。
优选地，上述呋喃香豆素类化合物的结构式为：
代码为N2的或
代码为N5的
结构式如式（Ⅰ）所示呋喃香豆素类化合物、其药学上可接受的盐或酯或含有它们中任一种的药物组合物能抑制乙型肝炎病毒DNA的复制。
结构式如式（Ⅰ）所示呋喃香豆素类化合物、其药学上可接受的盐或酯或含有它们中任一种的药物组合物能抑制乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg的分泌。
优选地，如上所述应用是指结构式如式（Ⅰ）所示呋喃香豆素类化合物与药学上可接受的载体和/或赋形剂在制备治疗和/或预防由乙型肝炎病毒感染引起的相关疾病的药物中的应用。
优选地，所述相关疾病为由乙型肝炎病毒感染引起的急慢性肝炎。
本发明的有益效果是：
（1）结构式如式（Ⅰ）所示呋喃香豆素类化合物均能一定程度上抑制乙型肝炎病毒DNA复制，其中编号为N5化合物对乙型肝炎病毒 DNA复制具有最高抑制活性。
（2）结构式如式（Ⅰ）所示呋喃香豆素类化合物均能一定程度上抑制乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg分泌，其中编号为N2化合物对乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg分泌具有最高抑制活性；编号为N2化合物具有同时抑制乙型肝炎病毒DNA复制和HBsAg和HBeAg分泌的作用。
（3）结构式如式（Ⅰ）所示呋喃香豆素类化合物结构简单、易合成；而且此类化合物毒性较小，可安全用于制备治疗和/或预防乙型肝炎病毒药物，尤其适用于治疗和/或预防HBV感染引起的急慢性肝炎。
附图说明
图1为N5 抑制HBV DNA复制及N5细胞毒性曲线图。
图2为N2 抑制HBV DNA复制、HBsAg和HBeAg分泌曲线图。
图3为N1抑制HBV DNA复制曲线图。
图4为N1抑制HBVHBsAg及HBeAg分泌活性和细胞毒性曲线图。
图5为N2抑制HBV DNA复制曲线图。
图6为N2抑制HBV HBsAg及HBeAg分泌活性和细胞毒性曲线图。
图7为N3抑制HBV DNA复制曲线图。
图8为N3抑制HBV HBsAg及HBeAg分泌活性和细胞毒性曲线图。
图9为N4抑制HBV DNA复制曲线图。
图10为N4抑制HBV HBsAg及HBeAg分泌活性和细胞毒性曲线图。
图11为N5抑制HBV DNA复制曲线图。
图12为N5抑制HBV HBsAg及HBeAg分泌活性和细胞毒性曲线图。
图13为N6抑制HBV DNA复制曲线图。
图14为N6抑制HBV HBsAg及HBeAg分泌活性和细胞毒性曲线图。
图15为N7抑制HBV DNA复制曲线图。
图16为N7抑制HBV HBsAg及HBeAg分泌活性和细胞毒性曲线图。
图17为N8抑制HBV DNA复制曲线图。
图18为N8抑制HBV HBsAg及HBeAg分泌活性和细胞毒性曲线图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：计算机药物筛选
化合物库预处理：化合物库为自备化合物数据库。化合物库作如下处理：去除离子及络合水分子、加电荷、质子化、产生三维构象。这些流程均在药物设计软件包Discovery Studio 2.5中完成。其中质子化在pH 6.5~8.5条件下进行。准备好的小分子库用于虚拟筛选。
以呋喃香豆素结构进行子结构检索，找出含有该母核的化合物。本发明通过计算机药物筛选程序DiscoveryStudio2.5版本，预测出本实验室化合物储备库拥有13个人类NF-κB靶标的候选抑制剂。对该13个化合物进行细胞水平的抗HBV复制活性筛选，发现其中8个化合物(N1~N8)具有抑制HBV DNA复制，并且能够抑制HBsAg和HBeAg分泌。N1~N8化合物是从中国药品生物制品检定所买到的。这8个化合物均属呋喃香豆素类，结构通式见式（I），各个活性化合物的结构式及活性见表1。
其中，R1为氢、烷基或糖苷，R2为氢、甲基或羟基，R3为氢、烷基、烃基或烷氧基，R4为氢、烷基、羟基或烷氧基，R5为氢、羟基、烷基或烷氧基，R1~R5不能同时为氢。
表1 药物筛选获得的化合物结构及其对HBV DNA、HBsAg、HBeAg抑制性
实施例2：化合物对宿主细胞的毒性测定
S1.细胞培养。
体外培养HepG2.2.15细胞（转染HBV基因的人肝癌细胞，可稳定的表达HBV病毒颗粒及HBV相关蛋白）。使用含有10%胎牛血清，200mg/L G418的RPMI 1640培养基，在37℃，5%二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。
S2.化合物干预。
收集对数期细胞，将细胞悬液浓度配成5×104个/ml，加入96孔细胞培养板中。于二氧化碳培养箱中培养24h后，将培养液换成含有不同化合物浓度的培养基，连续培养6天，每3天换上相同化合物浓度的培养基，于第6天检测细胞毒性，使用DMSO将待测化合物配置为不同浓度的溶液。每个浓度设3个平行复孔，并设不经化合物处理的对照组进行比较。
S3.测试方法。
采用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]法测定经化合物处理6天之后的细胞。应用酶标仪（检测波长490nm，参考波长630nm）测定个孔吸光值（OD值）。
S4.结果处理。
按下面的公式计算各药物对HepG2.2.15细胞的生长抑制率：
以HepG2.2.15细胞生长抑制率为纵坐标，化合物浓度为横坐标绘制各化合物对细胞生长的抑制曲线图，根据各化合物对细胞抑制率，求出半数毒性浓度TC50，即抑制细胞生长达50%时药物浓度。
另按照公式：选择抑制常数(SI) = TC50/IC50 计算各化合物的选择抑制常数，以评价各化合物的用药安全性。N1~N8八个化合物的选择抑制常数结果见表1。N1~N8八个化合物对宿主细胞的毒性测定结果分别见图4、6、8、10、12、14、16、18。
实施例3 表1中N1~N8化合物抑制HBsAg和HBeAg抗原表达实验
S1.细胞培养。
体外培养HepG2.2.15细胞。使用含有10%胎牛血清，200mg/L G418的RPMI 1640培养基，在37℃，5%二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。
S2.药物干预。
调整对数生长期HepG2.2.15细胞密度为5×104 cells/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μl ，24h后待细胞贴于孔底，弃去上清，加入含有不同浓度药物的培养液，每个浓度设3个复孔，并设加完全培养基的细胞做为正常对照，5% CO2、37℃下培养，每三天换相同药液浓度1次。
S3.测试方法。
于第6天收集细胞上清液，采用ELISA（enzyme-linked immuno sorbent assay，酶联免疫吸附测定）法，测定HBeAg和HBsAg的含量。
S4.结果处理。按照公式：
计算各化合物不同浓度下的抗原相对抑制数。以抗原相对抑制数为纵坐标，化合物浓度为横坐标绘制各化合物对HBV 抑制曲线图，并计算各化合物对HBsAg和HBeAg抑制剂量（IC50）以评价各化合物对HBV抗原抑制活性。根据选择性指数SI=TC50/ IC50值，按以下标准评价化合物的抗HBV效果。SI<1.0表明化合物有毒无效，1.0≤SI≤2.0表明化合物低效有毒即弱阳性，2.0<SI<10.0表明化合物有效低毒即阳性，SI≥10.0表明化合物高效低毒即强阳性。
N1~N8化合物抑制HBsAg和HBeAg抗原表达结果见表1和图4、6、8、10、12、14、16、18。由表1和图4、6、8、10、12、14、16、18结果可见，化合物N2能有效的抑制HBsAg和HBeAg分泌，IC50分别为40.59μM和40.57μM，且化合物毒性小，选择性高，对两抗原的选择性指数分别为13.66和11.30。且HBV DNA抑制试验证实，该化合物对DNA复制也有较好的抑制活性，IC50为33.55 μM，SI为13.66（见图2）。实验结果说明，该化合物具有良好的抑制HBV复制的作用，并且选择性高，有良好的成药性。
实施例4 表1中N1~N8化合物对HBV DNA抑制实验
S1.细胞培养。
体外培养HepG2.2.15细胞。使用含有10%胎牛血清，200mg/L G418的RPMI 1640培养基，在37℃，5%二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。
S2.药物干预。
将HepG2.2.15细胞以2×104个/ml 接种于24孔细胞培养板中，24h后，弃去上清，加入含不同浓度药物培养液，培养6天，每3天换一次液，于第6天收集细胞培养上清液，用于检测细胞上清液中HBV DNA拷贝数。每个浓度设3个平行复孔。以3TC为阳性对照药，实验浓度为5.73μg/ml。
S3.测试方法。
收集药物处理6天后细胞上清液，根据HBV DNA试剂盒提取方法提取DNA。采用PCR-荧光探针法，测定上清液HBV DNA拷贝数。
S4.结果处理。
按照公式按下式计算药物对细胞上清液中HBV DNA的抑制率：
以HBV DNA相对抑制数为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制各化合物对HBV DNA抑制曲线图，并计算各化合物对DNA抑制剂量（IC50）以评价各化合物对HBV DNA抑制活性。根据选择性指数SI=TC50/ IC50值，按以下标准评价药物的抗HBV效果。SI<1.0表明化合物有毒无效，1.0≤SI≤2.0表明化合物低效有毒即弱阳性，2.0<SI<10.0表明化合物有效低毒即阳性，SI≥10.0表明化合物高效低毒即强阳性。
N1~N8化合物对HBV DNA抑制实验结果见表1和图3、5、7、9、11、13、15、17。由图3、5、7、9、11、13、15、17和表1的结果可见，本发明通过HBV DNA复制抑制实验，发现8个化合物对DNA复制均有不同程度的抑制作用，其中N2~N6选择性高（SI为4.49~13.66），N5抑制DNA复制活性最好，IC50为12.5 μM（见图1）。
总结：
1.本发明通过HBV DNA复制抑制实验，发现N5对HBV DNA复制抑制活性最高并且细胞毒性低，N5对HBV DNA复制半数抑制剂量（IC50）分别12.5 μM，细胞半致死剂量（TC50）为113.74 μM，选择抑制常数（SI）9.10（表1，图1）。
2.本发明通过HBV DNA复制抑制实验以及HBsAg、HBeAg分泌抑制实验，证实N2可有效的抑制病毒DNA复制和抗原的分泌（表1，图2）。N2对HBV DNA复制抑制IC50为33.55μM，SI为13.66；对HBsAg分泌抑制IC50为40.59μM，SI为11.29；对HBsAg分泌抑制IC50为40.57μM，SI为11.30。
Claims (5)
1.一类呋喃香豆素类化合物或其药学上可接受的盐作为唯一活性成分在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用，所述呋喃香豆素类化合物的结构式为：
或。
2.据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐为所述呋喃香豆素类化合物与酸或碱形成的药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述呋喃香豆素类化合物或其药学上可接受的盐能抑制乙型肝炎病毒DNA的复制。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述呋喃香豆素类化合物或其药学上可接受的盐能抑制乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg的分泌。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用为所述呋喃香豆素类化合物与药学上可接受的载体和/或赋形剂在制备治疗和/或预防由乙型肝炎病毒感染引起的相关疾病的药物中的应用；所述相关疾病为由乙型肝炎病毒感染引起的急慢性肝炎。
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