CN101328123B - 5-氧-取代苯烯丙酰奎尼酸甲酯化合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一类5-氧-取代苯烯丙酰奎尼酸甲酯化合物及其可药用的盐(I)，以及提供制备化合物(I)的重要中间体5-氧-[3-取代苯烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯化合物及其可药用的盐(II)。本发明提供的化合物(I)和化合物(II)均具有抑制乙型肝炎病毒DNA复制和降低乙肝病毒表面抗原的表达功能，可以在制备治疗相关的乙肝病毒感染性疾病的药物种运用。本发明化合物(I)和化合物(II)的结构通式：

Description

5-氧-取代苯烯丙酰奎尼酸甲酯化合物及其用途

技术领域

本发明涉及有机化学、药物化学和药理学领域，具体而言，本发明涉及5-氧-[3-取代苯烯丙酰]奎尼酸甲酯类化合物和其关键中间体5-氧-[3-取代苯烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯以及它们的制备方法，该类化合物被发现有抑制乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)复制和降低乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的表达功能；可以预期用于制备治疗相关的乙肝病毒感染性疾病的药物用途。

背景技术

从认识病毒的第一天起，人类就在不断地寻找抗击病毒的有效武器，但是病毒性疾病的治疗，目前仍缺乏专属性强的药物。临床上常用的药物有如下几类：1、抑制病毒复制的抗病毒药；2、增强机体免疫功能的免疫调节药；3、针对临床症状的止咳、镇痛、退热和消炎等治疗药；4、防止继发感染的抗感染药；5、预防病毒感染的疫苗；6、阻断病毒传播的消毒药。

我国是病毒性肝炎的高发地区，以乙型肝炎病毒HBV感染为主。乙肝病毒携带者超过1.2亿，现有约3000万患者需要治疗，每年因肝病死亡约30万人，至少带来直接经济损失500亿人民币。此外，慢性乙肝病人经5～20年后约有12％可发展为肝硬化，在肝硬化病人中大约20％患者最终发展成肝功能衰竭，约5％发展为肝癌。因此，慢性病毒性肝炎的治疗不仅给国家和患者家庭造成巨大的经济负担，同时也引起就业、升学等严重社会问题。肝炎病毒利用宿主细胞的DNA、RNA及蛋白合成系统进行复制，并将自身的核酸信息整合到宿主细胞的DNA中，与宿主细胞同期复制并在复制过程中不断产生错误而形成变异，上述过程是肝炎病毒重要的分子生物学基础，也是抗肝炎病毒药研制难以形成突破的重要原因。目前临床众多用于慢性病毒性肝炎的治疗药物，包括抗病毒、保肝(抗纤维化)、免疫调控和中草药等仍存在诸多问题。核苷类药物及干扰素为主的药物虽具有一定的抗病毒作用，但其对共价闭环HBVDNA的清除作用尚不确定，停药后易反跳，况且用药后发生不同程度的病毒变异。干扰素临床上有效率仅有30～50％，且与核苷类一样有副作用。从我国辽阔药用资源发掘活性天然产物，研制新型特色抗乙肝病毒药物是寻找具有自主知识产权新药的关键和突破口。

绿原酸(chlorogenic acid)是由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(鸡纳酸，quinic acid)组成的一取代的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，化学名5-氧-咖啡酰奎尼酸(5-O-Caffeoylquinic acid)，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。绿原酸为众多药材(如金银花、茵陈、杜仲)以及中成药(如复肝宁、双花注射液、粉刺口服液)中抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分，同时是某些中药制剂质量控制的重要指标。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用，尤其是在病毒防治领域有重要用途[赵昱等：“咖啡酰奎尼酸类化合物研究进展”，中国中药杂志，2006，31(11)，869-874；李国雄等，Journal of Natural Products，1990，53(3)，587-595；马双成等，药物分析杂志，2005，25(7)，751-755；左建平、赵维民等，“绿原酸、异绿原酸的组合物及它的医学用途”，中国发明专利，公开号：CN 1449753A；左建平、赵维民等，“一类苯丙烯酰奎宁酸酯衍生物、制备方法及用途”；中国发明专利，公开号：CN 1552690A]。

作为对抗病毒药物研究的一部分工作，我们对这类重要的天然产物进行了研究。目前绿原酸及其衍生物主要靠从植物中提取而得，但其在植物中含量不高，同时考虑到绿原酸对人有致敏作用，因此本发明的目的在于对此类化合物进行合成和结构改造，合成了一系列5-氧-[3-取代苯丙烯酰]奎尼酸甲酯类化合物，并测试了其对HBVDNA和/或HBsAg的抑制活性，以期寻找对乙肝病毒生长显示抑制作用的先导化合物。

发明内容

本发明的目的在于提供一类式(I)所示的5-氧-[3-取代苯烯丙酰]奎尼酸甲酯类化合物及其可药用的盐：

其中：取代基R₁，R₂，R₃，R₄和R₅可以相同或不同，分别选自氢、卤素、硝基、胺基、含1～8个碳的烷氧基、含1～8个碳的酰氧基或含1～8个碳的烷氧烷氧基；其条件是：R₁，R₂，R₃，R₄和R₅不能同时为氢；当R₁，R₂和R₅同时为氢时，R₃和R₄不能为偕二甲氧基取代；当R₁，R₂和R₅同时为氢时，R₃和R₄不能同时为甲氧基取代；当R₁，R₂，R₄和R₅同时为氢时，R₃不能是乙酰氧酰氧基。

本发明优选的化合物(I)包括：

I-a.5-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-奎尼酸甲酯；

I-b.5-氧-[3-(2，4-二氯苯)烯丙酰]-奎尼酸甲酯；

I-c.5-氧-[3-(3，4-二硝基苯)烯丙酰]-奎尼酸甲酯；

I-d.5-氧-[3-(4-硝基苯)烯丙酰]-奎尼酸甲酯；

I-e.5-氧-[3-(4-溴苯)烯丙酰]-奎尼酸甲酯；

I-f.5-氧-[3-(2-乙氧基苯)烯丙酰]-奎尼酸甲酯；

I-g.5-氧-[3-(3，4-二甲氧基甲氧基苯)烯丙酰]-奎尼酸甲酯。

本发明还提供了一种如式(II)所示的制备化合物(I)的关键中间体5-氧-[3-取代苯烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯及其可药用的盐：

其中：取代基R₁，R₂，R₃，R₄和R₅可以相同或不同，分别选自氢、卤素、硝基、胺基、含1～8个碳的烷氧基、含1～8个碳的酰氧基和含1～8个碳的烷氧烷氧基；其条件是：R₁，R₂，R₃，R₄和R₅不能同时为氢；当R₁，R₂和R₅同时为氢时，R₃和R₄不能为偕二甲氧基取代；当R₁，R₂和R₅同时为氢时，R₃和R₄不能同时为甲氧基取代；当R₁，R₂，R₄和R₅同时为氢时，R₃不能是乙酰氧酰氧基。

本发明优选的化合物(II)包括：

II-a.5-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-b.5-氧-[3-(2，4-氯苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-c.5-氧-[3-(3，4-二硝基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-d.5-氧-[3-(4-硝基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-e.5-氧-[3-(4-溴苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-f.5-氧-[3-(2-乙氧基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-g.5-氧-[3-(3，4-二甲氧基甲氧基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯。

本发明的又一目的是提供了化合物(I)和化合物(II)在制备抗乙肝病毒药物的中的用途。实验证实该类化合物具有抑制乙型肝炎病毒DNA复制和/或降低乙肝病毒表面抗原表达的功效。

本发明所述的药物可加入各种药用赋形剂，添加剂及载体。

所述药物制剂形式为注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型，也可以使用目前公认的控释或缓释剂型或纳米制剂。

本发明的有益之处是：本发明涉及的5-氧-[3-取代苯烯丙酰]奎尼酸甲酯类化合物及其关键中间体5-氧-[3-取代苯烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯具有抑制乙型肝炎病毒核糖核酸复制和降低乙肝病毒表面抗原表达的功能。该类化合物来源于对天然产物绿原酸的结构改造，而绿原酸类化合物对于正常细胞的毒性较低，且经过结构改造后的化合物及其重要中间体都具有较好的抑制乙肝病毒活性，可以预期作为防治病毒性乙型肝炎药物用途。本发明涉及的化合物合成方法简便、反应条件温和产率较好、成本较低，因此具有较可行的市场化前景。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步的说明。

实施例1

本发明提供了一种从中间体式(II)化合物制备式(I)化合物的方法。式(I)化合物合成工艺路线特征是：奎尼酸与丙酮在酸性条件下缩合生成丙酮叉保护的奎尼酸内酯化合物，再将其在醇钠条件下，内酯环打开，生成丙酮叉保护的奎尼酸甲酯，然后再与取代的苯烯丙酸在N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)存在下或在1，1′-二羰基咪唑(CDI)，1，8-二氮杂双环[5，4，0]11烷-7-烯(DBU)存在下通过酯化反应制备得到式(II)化合物，后者在酸性条件下水解得到式(I)化合物。具体制备过程如下所示：

其中：取代基R₁，R₂，R₃，R₄和R₅可以相同或不同，分别选自氢、卤素、硝基、胺基、含1～8个碳的烷氧基、含1～8个碳的酰氧基和含1～8个碳的烷氧烷氧基；其条件是：R₁，R₂，R₃，R₄和R₅不能同时为氢；当R₁，R₂和R₅同时为氢时，R₃和R₄不能为偕二甲氧基取代；当R₁，R₂和R₅同时为氢时，R₃和R₄不能同时为甲氧基取代；当R₁，R₂，R₄和R₅同时为氢时，R₃不能是乙酰氧酰氧基。

本发明的式(I)化合物及其关键中间体式(II)化合物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)有良好的抑制作用。根据本发明，该类化合物及其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有抗病毒活性从而可以用于防治病毒引起的疾病的药物组合物。下面通过实施例进一步说明本发明。实施例给出了代表性化合物的合成及相关结构鉴定数据。必须说明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例2：化合物5-羟基-3，4-丙酮叉奎尼酸内酯的制备

向反应瓶中加入奎尼酸(500毫克，2.6毫摩尔)，无水硫酸钠(2.5克，17.6毫摩尔)，15毫升丙酮，搅拌数分钟，再向反应瓶中滴加3微升浓硫酸，开始加热回流5小时。冷却到室温，加入固体碳酸氢钠调节pH约为7，抽滤除去不溶物，滤液浓缩。脱溶所得固体分散在3毫升氯仿和3毫升蒸馏水中，水层再用氯仿萃取3次(5毫升×3)，合并所有有机相，用水洗，饱和食盐水洗涤数次，无水硫酸钠干燥。减压蒸馏除去溶剂得白色固体，在乙酸乙酯中重结晶得白色粉末350毫克。产率为63.4％，熔点：120～122℃。核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ1.29(3H，单峰)，1.46(3H，单峰)，2.00～2.49(4H，多重峰)，4.27(1H，双双峰)，4.50(1H，多重峰)，4.65(1H，双双峰)。

实施例3：化合物5-羟基-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯的制备

在15毫升的二颈瓶中加入丙酮叉保护的奎尼酸内酯(100毫克，0.47毫摩尔)，溶解在5毫升甲醇中，在冰浴下加入钠条(22毫克，0.96毫摩尔)，于室温下反应8小时。滴加冰醋酸调节pH值到中性，蒸去甲醇，用二氯甲烷萃取，二氯甲烷层用水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂，氩气保护置于干燥器中待用。产率为40.8％。

实施例4：化合物II-a即5-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯的制备

方法一：

向反应瓶中加入对甲氧基苯烯丙酸(103毫克，0.58毫摩尔)，羰基二咪唑(190毫克，1.17毫摩尔)，四氢呋喃8毫升，回流反应2小时，再向其中加入5-羟基-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯(116毫克，0.47毫摩尔)，1，8-二氮杂双环[5，4，0]11烷-7-烯(DBU)(90毫克，0.58毫摩尔)，整个溶液再回流反应8小时。脱溶得到淡黄色粘稠状固体，经反相硅胶RP-C₁₈柱层析(甲醇/水：65/35)分离得到白色固体53毫克，产率为28.5％。

化合物II-a：熔点：75～77℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.75；核磁共振氢谱(¹H NMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ1.33(3H，单峰)，1.41(3H，单峰)，2.46～2.76(4H，多重峰)，3.67(3H，单峰)，3.91(3H，单峰)，4.09(1H，双双峰)，4.51(1H，多重峰)，4.74(1H，双双峰)，6.39(1H，双峰)，6.84(2H，单峰)，7.29(2H，单峰)，7.69(1H，双峰)。

方法二：

向反应瓶中加入对甲氧基苯烯丙酸(87毫克，0.49毫摩尔)，二环己基碳二亚胺(100毫克，0.49毫摩尔)，二氯甲烷8毫升，在室温下搅拌20分钟，加入保护的奎尼酸甲酯(96毫克，0.39毫摩尔)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)(10毫克，0.049毫摩尔)，整个溶液在室温下反应过夜，抽滤除去不溶物，蒸去溶剂，脱溶得到白色固体，经反相硅胶RP-C₁₈柱层析(甲醇/水：65/35)分离得到白色固体47毫克，产率为30.3％。

根据实施例4中方法二相同的方法制备表一所示实施例5-10化合物：

表一

下面列出表一中各化合物的理化数据：

实施例5：化合物II-b：白色固体，熔点：79～81℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.48；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ1.39(3H，s)，1.45(3H，单峰)，2.09～2.43(4H，多重峰)，3.67(3H，单峰)，4.19(1H，双双峰)，4.38(1H，多重峰)，5.06(1H，双双峰)，6.28(1H，双峰)，7.34(1H，多重峰)，7.51(1H，双峰)，7.58(1H，单峰)，7.91(1H，双峰)。

实施例6：化合物II-c：白色固体，熔点：96～98℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.25；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ1.38(3H，单峰)，1.50(3H，单峰)，2.18～2.46(4H，多重峰)，3.69(3H，单峰)，3.78(1H，双双峰)，4.10(1H，多重峰)，5.26(1H，双双峰)，6.46(1H，双峰)，7.83(1H，双峰)，8.20(1H，双峰)，8.53(1H，双峰)，9.07(1H，单峰)。

实施例7：化合物II-d：白色固体，熔点：88～90℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.31；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ1.41(3H，单峰)，1.53(3H，单峰)，2.50～2.69(4H，多重峰)，3.71(3H，单峰)，3.98(1H，双双峰)，4.33(1H，多重峰)，5.37(1H，双双峰)，6.68(1H，双峰)，7.59(2H，单峰)，7.78(1H，双峰)，8.25(2H，单峰)。

实施例9：化合物II-e：白色固体，熔点：75～77℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.43；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ1.33(3H，单峰)，1.40(3H，单峰)，2.06～2.22(4H，多重峰)，3.68(3H，单峰)，3.75(1H，双双峰)，4.12(1H，多重峰)，5.23(1H，双双峰)，6.38(1H，双峰)，7.19(2H，单峰)，7.38(2H，单峰)，7.67(1H，双峰)。

实施例9：化合物II-f：白色固体，熔点：83～85℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.45；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ1.33(3H，三重峰)，1.36(3H，单峰)，1.53(3H，单峰)，2.18～2.36(4H，多重峰)，3.67(3H，单峰)，3.78(1H，双双峰)，3.98(2H，四重峰)，4.15(1H，多重峰)，5.23(1H，双双峰)，6.41(1H，双峰)，6.74(1H，双峰)，6.83(1H，多重峰)，7.07(1H，多重峰)，7.28(1H，双峰)，7.91(1H，双峰)。

实施例10：化合物II-g：白色固体，熔点：71～73℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.58；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ1.33(3H，单峰)，1.36(3H，单峰)，2.16～2.36(4H，多重峰)，3.49(3H，单峰)，3.53(3H，单峰)，3.67(3H，单峰)，3.78(1H，双双峰)，4.10(1H，多重峰)，4.93(1H，双双峰)，5.18(2H，单峰)，5.26(2H，单峰)，6.37(1H，双峰)，6.98(2H，双双峰)，7.21(1H，单峰)，7.65(1H，双峰)。

实施例11：化合物I-a即5-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-奎尼酸甲酯的制备

在二颈瓶中加入化合物5-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯II-a(50毫克，0.123毫摩尔)，加入5毫升四氢呋喃，再滴加5毫升1N盐酸，在室温下反应72小时，用氯仿萃取，合并氯仿层用大量水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。经反相硅胶RP-C₁₈柱层析(甲醇/水：65/35)分离得到白色固体17毫克，产率为38.3％。

化合物I-a：熔点：88～90℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.25；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ2.46～2.76(4H，多重峰)，3.68(3H，单峰)，3.93(3H，单峰)，4.12(1H，双双峰)，4.56(1H，多重峰)，4.76(1H，双双峰)，6.49(1H，双峰)，6.88(2H，单峰)，7.42(2H，单峰)，7.79(1H，双峰)。

根据实施例11相同的方法制备表二所示实施例12-17化合物：

表二

下面列出表二中各化合物的理化数据：

实施例12：化合物I-b：白色固体，熔点：82～83℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.23；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ2.19～2.43(4H，多重峰)，3.67(3H，单峰)，4.09(1H，双双峰)，4.28(1H，多重峰)，5.08(1H，双双峰)，6.28(1H，双峰)，7.40(1H，多重峰)，7.57(1H，双峰)，7.72(1H，单峰)，7.91(1H，双峰)。

实施例13：化合物I-c：白色固体，熔点：103～106℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.14；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ2.08～2.46(4H，多重峰)，3.68(3H，单峰)，4.27(1H，双双峰)，4.50(1H，多重峰)，5.26(1H，双双峰)，6.56(1H，双峰)，7.86(1H，双峰)，8.24(1H，双峰)，8.55(1H，双峰)，9.10(1H，单峰)。

实施例14：化合物I-d：白色固体，熔点：99～101℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.19；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ2.50～2.69(4H，多重峰)，3.71(3H，单峰)，4.10(1H，双双峰)，4.33(1H，多重峰)，5.37(1H，双双峰)，6.73(1H，双峰)，7.63(2H，单峰)，7.80(1H，双峰)，8.28(2H，单峰)。

实施例15：化合物I-e：白色固体，熔点：85～87℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.23；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ1.96～2.22(4H，多重峰)，3.71(3H，单峰)，4.13(1H，双双峰)，4.38(1H，多重峰)，5.23(1H，双双峰)，6.48(1H，双峰)，7.23(2H，单峰)，7.48(2H，单峰)，7.77(1H，双峰)。

实施例16：化合物I-f：白色固体，熔点：92～94℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.25；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ1.33(3H，三重峰)，2.28～2.36(4H，多重峰)，3.57(3H，单峰)，3.79(1H，双双峰)，3.99(2H，四重峰)，4.17(1H，多重峰)，5.29(1H，双双峰)，6.61(1H，双峰)，6.78(1H，双峰)，6.86(1H，多重峰)，7.18(1H，多重峰)，7.38(1H，双峰)，7.93(1H，双峰)。

实施例17：化合物I-g：白色固体，熔点：80～82℃，R_f(氯仿/甲醇/甲酸：50/2/1)：0.28；核磁共振氢谱(¹HNMR)(400MHz，氘代甲醇)：δ2.16～2.36(4H，多重峰)，3.49(3H，单峰)，3.53(3H，单峰)，3.68(3H，单峰)，3.98(1H，双双峰)，4.30(1H，多重峰)，4.98(1H，双双峰)，5.18(2H，单峰)，5.28(2H，单峰)，6.37(1H，双峰)，6.98(2H，双双峰)，7.24(1H，单峰)，7.69(1H，双峰)。

本发明的式(I)所示之5-氧-[3-取代苯烯丙酰]奎尼酸甲酯类化合物，以及其关键中间体式(II)化合物具有抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的复制、降低乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的表达功能；可以预期用于治疗相关的乙肝病毒感染性疾病的药物。该类化合物及其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结合，用制药领域中的常规技术制备得到具有抗病毒活性从而可以用于防治病毒引起的疾病的药物组合物。上述各类药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型药物，也可以使用目前公认的控释或缓释剂型或纳米制剂。

本发明的式(I)所示之5-氧-[3-取代苯烯丙酰]奎尼酸甲酯类化合物或其关键中间体式(II)化合物及其可药用盐可以与现已上市的治疗乙型病毒性肝炎药物如拉米呋啶(lamivuding)、阿德福韦及其二匹伏酯(adevovir/adevovirdipivoxil)、恩替卡韦(entecavir)、恩曲他滨(emtricitabine)、克来福定(clevudine)、泛昔络韦(famciclovir)、洛布卡韦(lobucavir)、干扰素(IFN)等联合使用，制备得到具有治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物。上述各类药物组合物或者保健品均可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂等剂型药物，也包括使用目前公认的控释或缓释剂型或纳米制剂。

为了更好地理解本发明的实质，下面分别用药理实施例的形式将本发明的式(I)所示之5-氧-[3-取代苯烯丙酰]奎尼酸甲酯类化合物或其关键中间体式(II)化合物对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制试验的药理实验结果，说明其在抗病毒药物开发领域中的用途。药理实施例给出了部分化合物的代表性活性数据。同样必须说明，本发明的药理实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。

药理实施例1：化合物I-a对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抑制作用试验：

1.1细胞培养：

将HepG2.2.15细胞培养于含10％灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37℃，5％二氧化碳CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养。

1.2采用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法测定式(I)化合物I-a对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用：

取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1×10⁵个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37℃，5％二氧化碳CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物I-a，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升，和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入5毫克/毫升MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入DMSO 200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD值。以只加培养基的培养孔为对照孔。

抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。实验重复三次。

1.3测定化合物I-a对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用：

取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1×10⁵个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物I-a，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混匀，作为待测样品。用ELISA试剂盒测定培养基中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)浓度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照。

1.4实验结果：

实验结果如表三所示，化合物I-a有显著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其对HepG2.2.15细胞生长的无明显抑制作用，但对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg在高、中、低剂量下抑制活性都高于拉米呋啶。

表三.化合物I-a对HepG2.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率(％)

^a无抑制活性。

1.5结果说明：

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)指标是判断乙型肝炎病毒感染重要标志，抑制HBsAg并使HBsAg转阴反应是治疗乙型肝炎中的直接目的之一。该实施例结果说明：化合物I-a在第八天对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有显著的抑制作用，说明此类5-氧-[3-取代苯烯丙酰]奎尼酸甲酯类化合物可预期发展为降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的药物。

药理实施例2：化合物II-c对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抑制作用试验：

2.1细胞培养：

将HepG2.2.15细胞培养于含10％灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37℃，5％二氧化碳CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养。

2.2采用MTT法测定化合物II-c对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用：

测试方法同药理实施例1；以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照。

2.3实验结果：

实验结果如表四所示，化合物II-c有显著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其对HepG2.2.15细胞生长的无明显抑制作用，但对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg在高、中、低剂量下抑制活性都高于拉米呋啶。

表四.化合物II-c对HepG2.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率(％)

^a无抑制活性。

2.4结果说明：

该实施例结果显示化合物II-c在第八天对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有显著的抑制作用，说明此类5-氧-[3-取代苯烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯类中间体化合物可预期发展为降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的药物。

药理实施例3：化合物I-f对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制作用试验：

材料与方法：

3.1仪器与试剂：PE7700自动荧光PCR仪，美国Perkin Elmer公司生产；HBVDNA荧光定量检测试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心提供，胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均购自Gibco公司。

3.2细胞培养：将HepG2.2.15细胞接种于DMEM培养液(含10％胎牛血清，380微克/毫升G418)，置5％CO₂37℃培养箱中培养，具体方法同药理实施例1。

3.3采用MTT法测定化合物I-f对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用：方法同药理实施例1。

3.4测定化合物I-f对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的抑制作用：

取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1×10⁵/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物I-f，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混匀，作为待测样品。第8天时用HBVDNA定量PCR仪测定培养基中HBVDNA浓度。按试剂说明书操作，50微升反应体积中含30微升反应缓冲液，5微升氯化镁，5微升引物和探针，7微升样品处理上清液和3微升Taq酶。各反应管放入PCR仪中，按下列条件扩增：92℃2分钟预变性，然后按93℃45秒-55℃120秒，共40个循环。反应结束后，由电脑自动分析计算出结果。以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照。实验结果举例说明如表五所示，化合物I-f均具有强效的抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的作用。

表五.化合物I-f第八、十二天对HepG2.2.15脱氧核糖核酸(HBVDNA)的百分抑制率

3.5试验结果：

第八天和第十二天化合物I-f对HBVDNA均显示出一定的抑制活性，但是比阳性对照药品拉米呋啶对HBVDNA的抑制活性要弱，属于有较强活性的HBVDNA抑制剂。

3.6结果说明：

HBVDNA复制得到有效抑制是乙肝病毒得到控制的最直截了当的判断标准，是治疗病毒性乙型肝炎的重要生理指标之一。化合物I-f能显著抑制HBVDNA的复制，说明此类5-氧-[3-取代苯烯丙酰]奎尼酸甲酯化合物可以预期发展成为治疗病毒性乙型肝炎疾病的药物。

药理实施例4：化合物II-g对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制作用试验：

材料与方法：

4.1仪器与试剂：PE7700自动荧光PCR仪，美国Perkin Elmer公司生产；HBVDNA荧光定量检测试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心提供，胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均购自Gibco公司。

4.2细胞培养：将HepG2.2.15细胞接种于DMEM培养液(含10％胎牛血清，380微克/毫升G418)，置5％CO₂37℃培养箱中培养，具体方法同药理实施例1。

4.3采用MTT法测定化合物II-g对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用：方法同药理实施例1。

4.4测定化合物II-g乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)复制的抑制作用：

取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1×105/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物II-g，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混匀，作为待测样品。第8天时用HBVDNA定量PCR仪测定培养基中HBVDNA浓度。按试剂说明书操作，50微升反应体积中含30微升反应缓冲液，5微升氯化镁，5微升引物和探针，7微升样品处理上清液和3微升Taq酶。各反应管放入PCR仪中，按下列条件扩增：92℃2分钟预变性，然后按93℃45秒-55℃120秒，共40个循环。反应结束后，由电脑自动分析计算出结果。以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照。实验结果举例说明如表六所示，化合物II-g具有显效的抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的作用。

表六.化合物II-g第八、十二天对HepG2.2.15脱氧核糖核酸(HBVDNA)的百分抑制率以及第12天对细胞生长的百分抑制率

4.5试验结果：第八天和第十二天化合物II-g对HBVDNA均显示出一定的抑制活性，但是比阳性对照药品拉米呋啶对HBVDNA的抑制活性要弱，属于有较强活性的HBVDNA抑制剂。

4.6结果说明：HBVDNA得到抑制是乙肝病毒得到控制的最直截了当的判断标准，是治疗病毒性乙型肝炎的重要生理指标之一。化合物II-g能显著抑制HBVDNA的复制，说明此类5-氧-[3-取代苯烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯可以预期发展成为治疗病毒性乙型肝炎疾病的药物。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims (4)

1.一种5-氧-[3-取代苯烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯及其可药用的盐，其特征是：具有以下结构通式：

其中：

取代基R₁，R₂，R₃，R₄和R₅相同或不同，选自氢、卤素、硝基、胺基、含1～8个碳的烷氧基、含1～8个碳的酰氧基或含1～8个碳的烷氧烷氧基；

其条件是：R₁，R₂，R₃，R₄和R₅不能同时为氢；

当R₁，R₂和R₅同时为氢时，R₃和R₄不能同时为甲氧基；

当R₁，R₂，R₄和R₅同时为氢时，R₃不能是乙酰氧酰氧基。

2.根据权利要求1所述的化合物及其可药用的盐，其特征是：所述化合物选自：

II-a.5-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-b.5-氧-[3-(2，4-氯苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-c.5-氧-[3-(3，4-二硝基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-d.5-氧-[3-(4-硝基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-e.5-氧-[3-(4-溴苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-f.5-氧-[3-(2-乙氧基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯；

II-g.5-氧-[3-(3，4-二甲氧基甲氧基苯)烯丙酰]-3，4-丙酮叉奎尼酸甲酯。

3.根据权利要求1或2所述的化合物及其可药用的盐在制备治疗乙型病毒性肝炎的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述化合物及其可药用的盐的应用，其特征是：所述药物加入制剂允许的药用赋形剂、添加剂或载体，所述药物制剂形式为注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、控释剂、缓释剂或纳米制剂。