KR20110107287A

KR20110107287A - 비알콜성 지방간 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20110107287A
Application number: KR1020110025759A
Authority: KR
Inventors: 안국준; 양은경; 조은정; 채유나; 최성현; 김하동; 신창열; 김미경; 곽우영; 김흥재; 손문호; 김순회
Original assignee: 동아제약주식회사
Priority date: 2010-03-24
Filing date: 2011-03-23
Publication date: 2011-09-30
Also published as: BR112012023139A2; MX2012009855A; US20130072459A1; JP2013522359A; AU2011230081A1; CA2790914A1; CN102883721A; RU2012145116A; EP2549997A2; EP2549997A4; WO2011118976A2; SG183817A1; WO2011118976A3

Abstract

본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 1, 시타글립틴(Sitagliptin), 빌다글립틴(vildagliptin), 리나글립틴(linagliptin) 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효성분을 함유하는 비알콜성 지방간 질환 질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 비알콜성 지방간의 전형적인 병변으로 나타나는 중성지방 (triglyceride, TG)의 축적을 예방 및 치료하며, 혈중에서 검출되는 간세포 (hepatocyte)의 손상 지표인 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (alanine aminotransferase, ALT)를 정상화시켜 궁극적으로는 비알콜성 지방간의 치료 및 예방효과가 있으며 간섬유화를 유도하는 간성상세포 (hepatic stellate cell, HSC)의 활성화 및 분화를 억제함으로써 간섬유화 및 간경화로의 진전을 억제하여 간섬유화 및 간경화 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.　

Description

비알콜성 지방간 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention and the treatment of non-alcoholic fatty liver disease}

본 발명은 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

비알콜성 지방간 질환은 과량의 알콜을 섭취하지 않은 환자에서 염증 반응을 동반하지 않는 단순 지방간 및 이에 의해 진전되며, 간세포의 염증반응 (hepatocellular inflammation)을 나타내는 비알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 간섬유화 및 간경화를 포함하는 넓은 범위의 질환을 의미하며 예전에 사용되었던 비알콜성 지방간염 (Ludwig J et al., Mayo Clin Proc 1980, 55(7):434-438)에 비해 광의의 개념이다.

비알콜성 지방간 질환은 원인에 따라 원발성과 속발성으로 나뉘는데 원발성은 대사 증후군 (metabolic syndrome)의 특징인 고지혈, 당뇨, 또는 비만 등에 의해 발생되며, 속발성은 영양적 원인 (급격한 체중 감소, 기아, 장 우회술), 다양한 약물 (glucocorticoids, estrogens, tamoxifen, methotrexate, zidovudine, amiodarone, tetracycline, didanosine, cocaine, diltiazem, perhexiline), 독성 물질 (독버섯, 세균 독소), 대사성 원인 (lipodystrophy, dysbetalipoporoteinemia, Weber-Christian syndrome, Wolman's disease, acute fatty liver of pregnancy, Reye's syndrome) 및 기타 요인 (염증성 장질환: inflammatory bowel syndrome, AIDS 감염: HIV infection)에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다 (Admas LA et al., CMAJ 2005, 172(7): 899-905). 원발성 요인인 대사증후군의 중요한 특징인 당뇨 및 비만과 관련된 비알콜성 지방간 질환의 발생율은 당뇨 환자의 약 50%, 비만 환자의 약 76%, 비만한 당뇨 환자에서 거의 대부분 발생하는 것으로 알려져 있다 (Gupte P et al., J Gastroenterol Hepatol 2004, 19(8):854-858). 또한 알라닌 아미노 트랜스퍼라제 (alanine aminotransferase, ALT)의 수준이 증가된 당뇨　및 비만 환자에서 간 생검을 실시한 결과 지방간염의 발생율은 18~36%로 나타나고 있으며 (Braillon A et al., Gut 1985, 26(2):133-139), 이러한 지방간염은 인슐린 저항성 (insulin resistance)에 의해 발생되는 것으로 알려져 있다. 또한, 당뇨, 비만 및 고지혈증을 동반하는 지방간염 환자에서 간경화로 진행되는 비율은 질병의 조사 기간에 따라 다른데, 3~11년의 조사 기간 내에 지방간염에서 간경화로 진전된 환자의 비율은 4~26%로 보고된 바 있으며, 일반 인구군에 비해 치사율이 높은 것으로 보고되고 있다 (Powell EE et al., Hepatology 1990, 11(1):74-80, Bacon BR et al., Gastroenterology 1994, 107(4):1103-1109, Matteoni CA et al., Gastroenterology 1999, 116(6):1413-1419).

비알콜성 지방간 질환과 직접적으로 연관되는 중성지방의 간 축적 및 이로 인해 진행되는 간세포의 손상 (hepatocellular damage)은 국소 인자 및 인슐린 저항성 등의 전신성 인자의 변화에 의해 간으로의 지질의 유입/합성 및 방출/산화의 불균형에 의해 나타날 수 있다고 알려져 있다. 즉, 인슐린 저항성에 의한 인슐린 고혈증 (hyperinsulinemia)에 의해 간세포 (hepatocyte)의 미토콘드리아 (mitochondria)에 의해 산화될 수 있는 지방산을 초과하여 간으로 지방산이 유입되어 (Reid AE. Gastroenterology 2001, 121(3): 710-723) 간에 중성 지방이 축적되는 것으로 알려져 있다. 또한 인슐린 저항성에 의해 지방합성 전사인자 (lipogenic transcription factor)인 PPAR-γ (peroxisome proliferator-activiated receptor-gamma) 및 SREBP-1c (sterol regulatory element binding protein-1c)의 발현이 증가 (up-regulation) 되어 간의 지방 신생합성 (de novo hepatic lipogenesis)이 증가함으로 인해 중성 지방의 축적이 나타나기도 한다 (Fromenty B et al., Diabetes Metab 2004, 30(2):121-138).

간에서 지방은 초저밀도 지단백질 (very low density lipoprotein, VLDL)의 형태로 혈중으로 방출되는데, 초저밀도 지단백질은 중성지방과 apo B (apolipoprotein B)를 결합시키는 마이크로좀 중성지방 이동 단백질 (microsomal triglyceride transfer protein, MTP)에 의해 형성된다. 인슐린 저항성에 의해 지방 조직에서 지방 분해가 증가하고 이로 인해 혈중 지방산이 증가하는데, 이로 인한 마이크로좀 중성지방 이동 단백질의 활성 및 apo B 합성의 감소는 간의 지방 방출을 감소시키고, 중성지방의 축적을 야기하게 된다 (Namikawa C et al., J Hepatol 2004, 40(5):781-786). 특히 인슐린 저항성이 비알콜성 지방간 질환의 병인론에 중요함은 당뇨, 비만, 고지혈을 특징으로 하는 대사 증후군과 비알콜성 지방간이 서로 상관성이 높기 때문이다. 지방이 축적된 간은 2차적인 손상에 민감하여 간세포 염증 및 섬유화로 진행되게 된다.

이러한 2차적인 손상은 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), 렙틴 (leptin), 아디포넥틴 (adiponectin)을 포함하는 다양한 아디포카인 (adipocytokine), 산화적 스트레스 (oxidative stress), 지질 과산화 (lipid peroxidation), 증가된 지방산 (Hui JM et al., Hepatology 2004, 40(1):46-54), 및 공장 회장 우회술 (jejunoileal bypass surgery)를 받은 환자의 경우 장에서 유래되는 세균의 내독소 (gut-derived bacterial endotoxin)에 의해 발생된다 (Day CP and James OF. Gastroenterology 1998, 114(4):842-845).　　

간 손상이 진행되면서 지방구가 침착된 간세포 및 동양 혈관 주위의 섬유화 (perisinusoidal fibrosis)에 의해 미세 혈관의 혈류를 저해하게 되고, 이로 인해 산소 및 영양분의 교환을 감소시키며 미세 혈관성 염증 반응을 야기하게 된다 (Magalotti D et al., Dig Liver Dis 2004, 36(6):406-411). 또한 혈중 페리틴 (ferritin) 및 철이온 (iron) 수치가 지방간염 환자에서 증가하는데, 증가된 철이온, 종양 성장 인자-β1 (tumor growth factor-β1, TGF-β1) 및 싸이토카인에 의해 간성상세포 (hepatic stellate cell)가 활성화되고 콜라젠 (collagen)이 합성되어 간섬유화 및 간경화로 진전된다 (Pietrangelo A et al., Hepatology 1994, 19(3):714-721).

한편, 최근에는 비알콜성 지방간 질환이 동맥 경화 (artherosclerosis), 뇌혈관 질환 (Francazani A et al., Am J Med 2008, 121:72-78), 미세 혈관 질환, 신증 (nephropathy), 및 망막증 (retinopathy) (Targher G et al., Diabetologia 2008; 51(3):444-450) 등을 포함하는 심혈관 질환 (cardiovascular disease, CVD), 다낭성 난소 증후군 (polycystic ovarian syndrome, PCOS) (Targher G et al., Atherosclerosis 2007, 191:235-240, Cerda C et al., J Hepatol 2007, 47:412-417), 또는 폐쇄성 수면 무호흡증 (obstructive sleep anpea, OSA) (Tanne F at al., Hepatology 2005, 41:1290-1296) 등의 질환과 연관된 것으로 보고 되고 있다.

현재까지 비알콜성 지방간 질환에 대한 확립된 치료법은 없는데 이는 당뇨병, 비만, 관상동맥 질환, 앉아 있는 습관 등의 다양한 요소와 연관되어 나타나기 때문이다. 비만은 비알콜성 지방간 질환의 치료에 있어서 중요한 타겟인데, 체중 감소에 의해 간 손상의 위험 인자인 인슐린 저항성과 연관된 인자, 간으로 유입되는 지방산의 양 및 염증성 또는 섬유화성 아디포카인 (adipokine)의 감소를 유도할 수 있기 때문이다.　식이 조절 및 운동에 의한 체중 감소로 의해 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (alanine aminotransferase, ALT) 수치 및 간의 중성 지방 함량이 감소될 수 있으나, 괴사성 염증이 있거나 간섬유화가 있는 환자의 경우 체중 감소에 의한 개선은 거의 알려져 있지 않다 (Harrison SA et al., Gut 2007, 56:1760-1769).

식이성 포화 지방의 섭취는 간의 중성 지방량 및 인슐린 저항성과 연관성이 높기 때문에 (Westerbacka J et al., J Clin Endocrinol Metab 2005, 2804-2809) 식이 조절은 매우 중요하며, 체중 감량 및 인슐린 저항성 개선을 위한 운동의 경우 조직학적으로 지방간을 개선하는 것으로 알려져 있다 (Ueno T et al., J Hepatol 1997, 27:103-110).

소장의 리파제 저해제 (lipase inhibitor)이며 경구용 비만 치료제로 사용되고 있는 올리스탯 (orlistat)의 경우 지방간염 환자에서 간의 조직학적 향상을 유도했다는 보고가 있으나 (Hussein O et al., Dig Dis Sci 2007, 52:2512-2519), 이러한 조직학적인 향상이 체중의 감소에 의한 것인지 또는 다른 기전에 의한 것인지에 대해서 분명하지 않다.

제 2형 당뇨병 및 인슐린 저항성이 간의 염증 및 섬유화에 관여한다고 알려져 있는데 (Adachi M et al., Gastroenterology 2007, 132:1434-1446), 비알콜성 지방간 질환을 나타내는 2형 당뇨병 환자에서 메트포르민 (metformin)을 투여할 경우 혈액 검사 및 핵자기 공명 영상법 상에서 지방간의 개선이 분명하지 않았다. 그러나, 당뇨를 동반하지 않는 비알콜성 지방간 환자에서　1년간 메트포르민을 투여한 결과 비타민 E (vitamin E) 또는 체중 감소 약물 투여군에 비해 혈중 간 효소 수치 및 간의 괴사성 염증, 섬유화가 감소되었다는 보고가 있다 (Bugianesi E et al., Am J Gastroenterol 2005, 100:1082-1090).　　

티아졸리딘디온 (Thiazolidinedione, TZD) 계열의 약물은 PPAR-γ 작용 물질 (agonist)이며, 인슐린 감수성 (insulin sensitivity) 개선 및 간과 근육에서 지방 축적을 억제하고, 지방세포에서 항염증 및 항섬유화성 작용을 하는 아디포카인 (adipokine)의 분비를 증가시킨다. TZD 계열의 약물은 비알콜성 지방간 질환의 동물 모델에서 간에 대해 직접적인 항섬유화 작용을 나타내는 것으로 보고된 바 있다 (Galli A et al., Gastroenterology 2002, 122:1924-1940).

2세대 TZD약물인 피오글리타존 (pioglitazone)의 경우 지방간염 환자에서 지방간 개선 및 염증반응, 괴사반응을 유의적으로 개선시킴이 보고되었으나 (Belfort R et al., N Engl J Med 2006, 355:2297-2307), 지방간염 환자에서 약물 투여를 중단할 경우 지방간 및 염증이 악화되는 단점이 있다 (Lutchman G et al., Hepatology 2007, 46:424-429).

이상지혈증 (dyslipidemia)은 비알콜성 지방간 질환과 연관성이 있으며, 고중성지방혈증 (hypertriglyceridemia)은 비알콜성 지방간 환자의 20~80%에서 나타나고, 혈중 중성 지방을 감소시키는 약물인 피브레이트 (fibrate) 계열의 약물이 도움을 줄 수 있다. 피브레이트 계열의 약물은 PPAR-α 수용체 작용 물질이며 지방간염의 동물모델에서 약효가 검증된 바 있으나 (Ip E et al., Hepatology 2004, 39:1286-1296), 임상 실험에서 피브레이트 계열의 약물 중 하나인 클로피브레이트 (clofibrate)가 간 효소 수치와 조직학적 병변에 영향이 없다고 보고된 바 있다 (Laurin J et al., Hepatology 1996, 23:1464-1467).

콜레스테롤을 낮추는 물질인 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA 환원 저해제 (HMG CoA reductase inhibitor)의 기전을 가지는 스타틴 (statin) 계열의 약물의 경우 비알콜성 지방간 질환 환자에서 그 효과가 정립이 되지 않은 상태이나, 제 2형 당뇨병 환자 및 심혈관 질환의 위험 인자가 있는 환자에서 안전하게 처방될 수 있는 장점이 있다. 그러나 스타틴 계열의 약물에 의한 간독성 (hepatotoxicity)은 오히려 혈중 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (alanine aminotransferase)의 증가를 유도할 수 있는 단점이 있다 (Browning J et al., Hepatology 2006, 44:466-471).

고혈압 치료제의 경우 간의 섬유화 및 지방간염을 나타내는 동물 모델에서 알파 수용체 차단제 (alpha-blocker)가 약효를 나타낸 바 있으며 (Hirose A et al., Hepatology 2007, 45:1375-1381), 임상 실험의 경우 지방간염 환자에서 간 섬유화의 혈청 인자가 감소되고 인슐린 감수성 향상 효과 (insulin sensitizing effect)를 나타내어 가능성을 나타내고 있다 (Ichikawa Y et al., Intern Med 2007, 46:1331-1336).

따라서, 본 발명은 비알콜성 지방간 질환 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 하기 화학식 1,2,3,4로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효성분 (active ingredient)으로 함유하는 비알콜성 지방간 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

화학식 1로 표시되는 화합물 1은 ((R)-4-[(R)-3-아미노-4-(2,4,5-트리플루오로페닐)-부타노일]-3-(t-부톡시메틸)피페라진-2-온)이며, 대한민국 출원특허 제2008-0036052호에서 공개된 바 있다.

화학식 2로 표시되는 화합물 2는 시타글립틴 (sitagliptin)이며, 자누비아 (Januvia)라는 상표로 시판되고 있으며, 화학식 3으로 표시되는 화합물3은 빌다글립틴 (vildagliptin)으로 Galvus라는 상표로 시판되고 있고, 화학식 4로 표시되는 화합물 4는 리나글립틴 (linagliptin)으로 알려져 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

본 발명의 화합물 1 내지 4는 공지된 방법에 의해 제조하여 사용할 수도 있으며, 시중에서 판매하는 것[예를 들어, vildagliptin(빌다글립틴)은 Trademax 사(China)에서 판매되는 것]을 사용할 수도 있다.

상기 화학식1 또는 2에 나타난 바와 같이 화합물 1 또는 2는 베타 탄소와 피페라지논의 3번 위치의 탄소에 비대칭 중심을 가질 수 있고, 단일거울상 이성질체, 단일부분입체이성질체, 라세미체, 또는 부분입체이성질체의 혼합물의 형태는 본 발명의 화합물 1 또는 2에 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물 1 또는 2는 호변이성질체 (tautomer)로서 존재하는 것도 가능하며, 나아가 각각의 호변이성질체 뿐만 아니라 이들의 혼합물도 본 발명의 화합물 1또는 2에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 화합물 1 또는 2의 베타 아미노기를 포함하는 헤테로 화합물은 약학적으로 허용되는 이의 염, 이로부터 제조될 수 있는 수화물 및 용매화물을 포함한다. 상기 화합물 1 또는 2의 베타 아미노기를 포함하는 헤테로 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 통상적으로 이용되는 염의 제조방법에 의해서 제조될 수 있다. 또한 화합물 3 및 4 또한 이들이 나타낼 수 있는 모든 광학이성질체 및 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.

본 발명에 있어서 “약학적으로 허용되는 염”은 무기 또는 유기 염기 및 무기 또는 유기산을 포함하는 약학적으로 허용되는 비독성 염기 또는 산으로부터 제조되는 염을 말한다. 무기 염기로부터 유도되는 염은 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리, 제이철, 제일철, 리튬, 마그네슘, 망간, 칼륨, 나트륨, 아연 등을 포함한다.

특히 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 칼륨 또는 나트륨 염이 바람직하다. 고형의 염은 하나 이상의 결정 구조로 존재할 수 있고, 또한 수화물 형태로 존재할 수 있다. 약학적으로 허용되는 비독성 유기 염기로부터 유도된 염은 일급, 이급 또는 삼급 아민, 천연적으로 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 아민 환, 또는 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-에틸몰폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 하이드라바민, 이소프로필아민, 라이신, 메틸글루카민, 포폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 트리프로필아민, 트로메타민 등과 같은 염기성 이온 교환 수지를 포함한다.

본 발명의 화합물이 염기성인 경우, 염은 무기 및 유기 산을 포함하는 약학적으로 허용되는 비독성 산으로부터 제조될 수 있다. 상기 산은 아세트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 캄포르술폰산, 시트르산, 에탄술폰산, 퓨마르산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드로브롬산, 염산, 이세티온산, 락트산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄술폰산, 뮤크산, 질산, 파모산, 판토텐산, 인산, 숙신산, 황산, 타르타르산, p-톨루엔술폰산 등을 포함한다. 시트르산, 하이드로브롬산, 염산, 말레산, 인산, 황산, 퓨마르산 또는 타르타르산이 바람직하다.

본 발명의 화합물 1, 2, 3 또는 4 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 수화물은 비공유적 분자간 힘으로 결합되는 화학양론적 또는 비화학양론적 양의 물을 포함하고 있는 것으로 이해될 수 있다. 상기 수화물은 1 당량 이상, 일반적으로는 1~5 당량의 물을 함유할 수 있다. 이러한 수화물은 물 또는 물을 함유하는 용매로부터 본 발명의 화합물 1 또는 2 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 결정화시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 유효성분은 화학식 1로 표시되는 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것이 바람직하며, 유효성분은 화합물 1의 타르타르산 염인 것이 보다 더 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 유효성분은 시타글립틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것이 바람직하며, 시타글립틴 인산염인 것이 보다 더 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 유효성분은 빌다글립틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 유효성분은 리나글립틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 비알콜성 지방간 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 본 발명에서는 경구투여가 바람직하다. 또한, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 　경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형 제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

또한, 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

더불어, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 활성성분의 일일 투여량 또는 복용량은 0.1 내지 1000mg/kg 이나, 이는 환자의 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에서 비알콜성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 원발성과 속발성에 따른 비알콜성 지방간 질환을 모두 포함하나, 바람직하게는 원발성 고지혈증, 당뇨 또는 비만으로부터 발생되는 비알콜성 지방간 질환을 의미한다.

또한, 본 발명에서 비알콜성 지방간 질환 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 단순 지방간 (simple steatosis), 비알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis, NASH) 및 이러한 질환의 진전에 의해 발생되는 간섬유화 (liver fibrosis)와 간경화 (liver cirrhosis)를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 화합물 1 내지 4 또는 약학적으로 허용가능한 염에 추가하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명은 또한, 화합물 1 내지 4 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 비알콜성 지방간 질환 치료 및 예방을 요하는 인간을 포함하는 포유류에게 투여하여 비알콜성 지방간 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어,“투여”는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 내피 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여될 수 있으며, 이에 제한 되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 일일 1회 또는 일정한 시간 간격을 두고 일일 2회 이상 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비알콜성 지방간 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한 본 발명은, 비알콜성 지방간 질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물을 제조하기 위한 화합물 1 내지 4 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 비알콜성 지방간의 전형적인 병변으로 나타나는 중성지방 (triglyceride, TG)의 축적을 예방 및 치료하며, 혈중에서 검출되는 간세포 (hepatocyte)의 손상 지표인 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (alanine aminotransferase, ALT)를 정상화시키는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 간섬유화를 유도하는 간성상세포 (hepatic stellate cell, HSC)의 활성화 및 분화를 억제함으로써 간섬유화 (liver fibrosis), 나아가 간경화 (liver cirrhosis)로의 진전을 억제하여 간섬유화 또는 간경화의 치료 및 예방의 효과가 있어, 비알코올성 지방간의 치료 또는 예방제로 사용될 수 있다.

도 1은 비알콜성 지방간이 유도된 마우스에서 화합물 1의 타르타르산 염 또는 시타글립틴의 인산염에 의한 혈청 알라닌 아미노트랜스페라제(ALT)의 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 비알콜성 지방간이 유도된 마우스에서 화합물 1의 타르타르산 염 또는 시타글립틴의 인산염에 의한 간 중성지방의 감소 효과를 나타내는 간 중성지방 량 분석 그래프이다.
도 3은 비알콜성 지방간이 유도된 마우스에서 화합물 1의 타르타르산 염에 의한 간 중성지방의 감소 효과를 나타낸 조직 표본 사진이다.
도 4는 비알콜성 지방간이 유도된 랫드에서 화합물 1의 타르타르산 염에 의한 혈청 알라닌 아미노트랜스페라제(ALT)의 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 5 는 비알콜성 지방간이 유도된 랫드에서 화합물 1의 타르타르산 염에 의한 간 중성지방의 감소 효과를 나타내는 간 중성지방 함량 분석 그래프이다.
도 6은 비알콜성 지방간이 유도된 랫드에서 화합물 1의 타르타르산 염에 의한 간 중성지방의 감소 효과를 나타낸 조직 표본 사진이다.
도 7은 비알콜성 지방간이 유도된 랫드에서 화합물 1의 타르타르산 염에 의한 간 중성지방의 감소 효과를 나타낸 조직표본 이미지를 분석하여 표본의 일정 면적당 지방구가 차지하는 면적을 나타낸 그래프이다.
도 8은 마우스에서 고지방 사료에 의해 유도되는 지방간에 대한 화합물 1의 타르타르산염, 시타글립틴 인산염 및 빌다글립틴의 간 중성지방 축적에 대한 예방 효과를 나타낸 조직표본 이미지이다.
도 9는 활성화된 간성상 세포에서 화합물 1의 타르타르산염, 시타글립틴의 인산염, 빌다글립틴 및 리나글립틴에 의한 표적 단백질 발현량 감소 효과를 나타낸 전기영동 사진이다.
도 10은 화합물 1의 타르타르산염, 시타글립틴 인산염 및 빌다글립틴의 유리지방산으로 유도된 간세포 지방축적 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 CCl₄로 유발된 급성 간 손상 동물 모델에서 화합물 1의 타르타르산염, 시타글립틴인산염 및 빌다글립틴에의한 TGF-β1 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 분석 그래프이다.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
도1, 도2, 도4, 도5 및 도7에서, *; 일반 사료군에 비해 95% 신뢰도 범위내에서 유의적인 증가를 나타내고 (p<0.05),
#; 고지방 사료군에 비해 95% 신뢰도 범위내에서 유의적인 감소를 나타낸다(p<0.05).
도10에서, *: 0.1% DMSO 대조군에 비해 95% 신뢰도 범위내에서 유의적인 감소를 나타내고(P<0.05),
**: 0.1% DMSO 대조군에 비해 99% 신뢰도 범위내에서 유의적인 감소를 나타낸다(P<0.01).

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 마우스에서 고지방 사료에 의해 유도된 단순 지방간에 대한 화합물 1 의 타르타르산 염 ( tartrate ) 및 시타글립틴의 인산염 ( sitagliptin phosphate )의 예방 효과 확인

상기 화합물 1의 타르타르산 염(대한민국 출원특허 제2008-0036052호에 기재된 방법으로 제조) 및 시타글립틴의 인산염 (sitagliptin phosphate)의 단순 지방간 (simple steatosis)에 대한 예방 효과를 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 안정화시킨 후 총 5군으로 분리하였다. 그 중 1개군에는 지방이 10% 함유되어 있는 일반 사료(제조사: Research diets, 상품명: D12450B)를 공급하였고, 1개군에는 지방이 60% 함유된 고지방 사료(제조사: Research diets, 상품명: D12492)를 공급하였다. 나머지 3개 군은 약물군으로써 고지방 사료에 약물을 혼합하여 특수 제작한 약물 혼합 사료를 공급하였다. 화합물 1의 타르타르산 염의 경우에는 평균 1일 동안의 고지방 사료 소비량을 기준으로 화합물 1의 타르타르산 염의 1일 목표 용량 (target dose)인 100mg/kg 및 300mg/kg를 공급하기 위해 고지방 사료에 0.2중량% 및 0.5중량%의 화합물 1의 타르타르산 염을 혼합하여 사료를 제작하였다. 시타글립틴 인산염의 경우에도 1일 동안의 평균 고지방 사료 소비량을 기준으로 1일 목표 용량 (target dose)인 300mg/kg를 공급하기 위해 고지방 사료에 약 0.5중량%의 시타글립틴 인산염을 혼합하여 사료를 제작하였다. 각 약물군에 제작한 약물 혼합 사료를 공급하였다. 각 사료를 공급한지 8주, 16주, 24주가 경과한 후, 부검을 실시하여 혈청을 분리 후 혈액분석기를 통해 혈청 ALT level (alanine　aminotransferase,　GPT,　glutamic　pyruvate　transaminase)을 측정하였고 (표1 및 도1), 적출된 간은 5(v/v)% Triton-X 용액에서 균질화 (homogenization)한 후 중성지방 working reagent[free glycerol reagent(Sigma, F6428) 및 triglyceride reagent(Sigma, T2449)를 4:1(v/v)으로 섞어서 제조함]를 넣고 540nm에서 흡광도를 측정하여 중성지방의 함량을 측정하였다 (표 1 및 도2). 또한 적출된 간의 일부분은 조직학적 지방분포를 관찰하기 위해 10(v/v)% 포르말린 용액에서 고정 후 조직 표본을 제작하여 hematoxylin & eosin 염색을 실시하였으며, 이미지 분석 프로그램 (computerized image analysis)을 이용하여　촬영하였다 (도 3, 보라색으로 염색된 부분은 정상적인 간 조직을 나타내며, 흰색으로 염색이 된 부분이 지방구 (lipid droplet)이다).

그 결과, 도1에서 보는 바와 같이 화합물 1의 타르타르산 염 및 시타글립틴 인산염의 약물 공급에 의해 16주와 24주에 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 유의적인 감소를 나타내었다. 또한, 간의 중성 지방의 함량 역시 간 중성 지방 분석 (도2)과 조직학적 분석 (도3)에서 고지방 사료 공급군에 비해 유의적인 감소를 나타내었다. 이러한 결과는 고지방 사료 공급에 의해 형성되는 지방간에 대해 화합물 1의 타르타르산 염 및 시타글립틴 인산염이 간의 중성 지방 함량을 감소시켜 지방간에 예방 약효를 갖는 것을 나타낸다.

[표1] 마우스에서 고지방 사료에 의해 유도되는 단순 지방간에 대한 화합물 1의 타르타르산 염 및 시타글립틴 인산염의 지방간 예방 효과

< 실시예 2> 랫트에서 고지방 사료에 의해 유도된 단순 지방간에 대한 화합물 1의 타르타르산염의 치료 효과 확인

상기 화합물 1의 타르타르산 염(대한민국 출원특허 제2008-0036052호에 기재된 방법으로 제조)의 단순 지방간 (simple steatosis)에 대한 치료 효과를 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 웅성 흰쥐 (Wistar rat)를 안정화시킨 후 2군으로 분리해 각각 24주간 사료에 함유되어 있는 지방이 10%인 일반 사료(제조사: Research diets, 상품명: D12450B)와 사료에 함유되어 있는 지방이 60% 인 고지방 사료(제조사: Research diets, 상품명: D12492)를 공급하였다. 사료 공급 22주차에 사료 소비량을 계산한 결과　고지방 사료군은 33.40g/kg의 사료 섭취를 나타내어 화합물 1의 타르타르산 염의 1일 목표 용량 (target dose)인 10mg/kg을 공급하기 위해 고지방 사료에 0.03중량%의 화합물 1의 타르타르산염을 혼합하여 사료를 제작하였다. 사료를 공급한지 24주가 경과한 후, 동물을 고지방 사료 공급군 (n=8), 고지방 사료 + 화합물 1의 타르타르산 염 0.03중량% 혼합 공급군 (n=8),　일반 사료 공급군 (n=8)으로 나눠 추가적으로 14주간 공급하였다. 그 후 부검을 실시하여 혈청을 분리 후 혈액분석기를 통해 혈청 ALT level(alanine　aminotransferase,　GPT,　glutamic　pyruvate　transaminase)을 측정하였고 (도4), 적출된 간은 5(v/v)% Triton-X 용액에서 균질화 (homogenization)한 후 중성지방 working reagent[free glycerol reagent(Sigma, F6428) 및 triglyceride reagent(Sigma, T2449)를 4:1(v/v)으로 섞어서 제조함]를 넣고 540nm에서 흡광도를 측정하여 중성지방의 함량을 측정하였다 (도5). 또한 적출된 간의 일부분은 조직학적 지방분포를 관찰하기 위해 10(v/v)% 포르말린 용액에서 고정 후 조직 표본을 제작하여 hematoxylin & eosin(HE) 염색을 실시하였으며, 이미지 분석 프로그램 (computerized image analysis)을 이용하여　촬영 후(도6, 보라색으로 염색된 부분은 정상적인 간 조직을 나타내며, 흰색으로 염색이 되지 않은 부분이 지방구이다)표본의 일정 면적 당 지방구가 차지하는 면적을 구하였다 (도7).

그 결과, 도4에서 보는 바와 같이 화합물 1의 타르타르산염의 투여에 의해 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 유의적인 감소를 나타내었다. 또한, 간의 중성 지방의 함량 역시 간 중성 지방 분석 (도5)과 조직학적 분석 (도7)에서 고지방 사료 공급군에 비해 유의적인 감소를 나타내었다. 이러한 결과는 기존에 형성된 지방간에 대해 화합물 1의 타르타르산염이 간의 중성 지방 함량을 감소시켜 지방간의 치료제로 사용될 수 있음을 나타낸다.

< 실시예 3> 마우스에서 고지방 사료에 의해 유도되는 단순 지방간에 대한 화합물 1의 타르타르산 염, 시타글립틴의 인산염, 및 빌다글립틴의 비알콜성 지방간 예방 효과 확인

화합물 1의 타르타르산 염의 비알콜성 지방간 (simple steatosis)에 대한 예방 효과를 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 안정화시킨 후 체중 및 혈당에 따라 총 9군 (n=9)으로 군 분리한 후, 일반 사료 공급군과 고지방 사료 공급군을 vehicle 용액 (0.5(v/v)% MC,methylcellulose)에 녹여 1일 1회 10ml/kg으로 경구투여하고, 나머지 군은 고지방사료와 함께 지정된 군에 따라 화합물 1의 타르타르산 염을 30, 100, 300mg/kg, 시타글립틴 인산염 100, 300mg/kg및 빌다글립틴 100, 300mg/kg을 1일 1회 총 28일간 경구 투여하였다. 마지막 경구 투여 후 24시간 경과 시 부검을 실시하여 적출된 간을 5(v/v)% Triton-X 용액에서 균질화 (homogenization)한 후, 이에 중성지방 working reagent를 넣고 540nm에서 흡광도를 측정하여 중성지방의 함량을 측정하였다 (표 2). 또한 적출된 간의 일부분은 10(v/v)% 포르말린 용액에서 고정 후 조직 표본을 제작하여 hematoxylin & eosin(HE) 염색을 실시하여 촬영하였다 (도8).

[표2] 마우스에서 고지방 사료에 의해 유도되는 단순 지방간에 대한 화합물 1의 타르타르산 염, 시타글립틴 인산염, 및 빌다글립틴의 비알코올성 지방간 예방 효과

상기 표2에서와 같이 고지방 사료군에서 간의 중성 지방 함량은 일반 사료군에 비해 54% 증가하였으며, 화합물 1의 타르타르산 염300mg/kg 투여군의 경우 11%, 시타글립틴 인산염 100mg/kg 투여군은 21%, 빌다글립틴 300mg/kg 투여군은 11%의 증가를 나타내어 고지방 사료에 의한 지방간의 발생에 예방 효과를 나타내었다.

또한 고지방 사료군 대비 간의 중성 지방 함량의 최대 감소 비율은 화합물 1의 타르타르산 염 투약 군에서 최대 81%, 시타글립틴 인산염 투여 군에서는 최대 61%, 빌다글립틴 투여 군에서 최대 79%의 감소를 나타내어 이 또한 지방간의 발생에 대한 예방 약효를 나타낸다. 이러한 예방 약효를 조직학적으로 평가하기 위해 조직 표본을 촬영한 결과 화합물 1의 타르타르산 염, 시타글립틴 인산염, 및 빌다글립틴에 의한 지방구의 감소를 확인할 수 있었다 (도8). 이러한 결과는 지방간의 발생에 대해 세 가지 약물 공히 예방 약효가 있음을 시사한다.

< 실시예 4> 화합물 1의 타르타르산 염, 시타글립틴 인산염, 빌다글립틴 , 및 리나글 립틴의 랫트 간성상 세포 활성화 억제 효과 확인

본 발명의 화합물의 간성상 세포 활성화 억제 작용을 다음과 같은 세포배양법으로 검정하였다. 체중이 500~700g범위에 속하는 수컷 흰 쥐 (Wistar rat)를 마취하여, 복부를 절개한 뒤 간문맥에 캐뉼라 (cannula)를 연결하여 헤파린이 함유된 Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 용액과 제 1형 콜라게네이즈을 함유한 HBSS 용액을 순차적으로 관류시켰다. 관류가 끝난 뒤, 간을 적출한 후 수술용 가위를 이용하여 분쇄한 다음, 제1형 콜라게네이즈을 함유한 HBSS 용액에 넣어 37℃에서 15분간 진탕 배양하였다.

완전히 분쇄된 액체상태의 간 조직을 거즈에 통과시킨 뒤, 500g에서 10분간 원심 분리하여 얻어진 혼잡한 세포침전물을 인산완충액으로 세척한 뒤, 100 g에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 상층액을 다시 500 g에서 10분간 원심 분리하여 얻은 침전물에 Ficoll액 (GE healthcare)과 Percoll (GE healthcare)액의 9:1 (v/v)혼합액을 넣어 섞어준 뒤, 인산완충액을 혼합층 위에 살짝 얹고, 1,400g에서 15분간 원심 분리하여 상층과 하층 사이에 형성된 세포 층을 회수하여 10(v/v)% 우태아 혈청을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배지로 1회 세척하였다. 얻어진 세포는 3.1×10⁵개/cm²가 되도록 가하고 24시간 후 배지를 교체하고 이후 2~3일 마다 배지를 교체하면서 7일간 배양하였다. 이 후 사람 transforming growth factor (TGF) β1 1ng/ml을 함유하는 배지와 함유하지 않은 배지 중에 약물을 제시한 농도로 각각 처치하였다. 약물의 처리하고자 하는 농도보다 1,000배 높은 농도가 되도록 dimethylsulfoxide (DMSO)에 녹인 후 다음 배지에 1,000배 희석하여 1배(1X)가 되도록 한 후 세포에 처리하였다.

약물처치 기간이 7일 경과하였을 때, 배지를 걷어내고, 인산완충액으로 세척 후, 계면활성제를 포함하는 완충액을 넣어 세포를 용해시켰다. 이후 단백질을 정량 한 뒤, 4-12% Bis-Tris gel (invitrogen)에 전기 영동한 다음 나이트로셀룰로즈 멤브레인으로 이동시킨 단백질을 α-smooth muscle actin (αSMA) 또는 TGFβ1에 대해 특이적인 1차 항체와 반응시킨 뒤, 호스라디시페록시다제가 결합된 특이적 2차 항체를 반응시켜 화학 발광액으로 표적 단백질의 발현 정도를 확인하고, 액틴 (βactin) 발현량으로 보정하였다 (도 9). 각각의 본 발명의 화합물 100μM에 의한 관찰 단백질 발현의 감소율은 DMSO만 가한 음성 대조군 대비 TGFb1을 처리한 양성 대조군에서 증가한 증가율을 기준으로 약물에 의한 감소율을 백분율로 나타내었다(표 3).

[표 3] 활성화된 간성상 세포에서의 활성 지표 단백질 발현량 감소 효과

그 결과, 표3과 도 9에서와 같이 랫드의 활성화된 간성상 세포에서 hTGF-β1에 의해 증가한 간의 섬유화의 병태생리에 중요한 인자인 TGFβ1 와 αSMA 의 단백질 발현이 화합물 1의 타르타르산 염, 시타글립틴 인산염, 빌다글립틴, 및 리나글립틴에 의해 감소되었으며, 또한 화합물 1의 타르타르산 염의 농도가 증가할수록 TGFβ1 및 α-SMA의 단백질 발현 감소율이 증가함을 확인하였다 (도 9). 이러한 결과는 지방간염 및 간섬유화에 대해 화합물 1의 타르타르산 염, 시타글립틴 인산염, 빌다글립틴, 및 리나글립틴이 치료 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.

< 실시예 5> 사람 간암세포에서 화합물 1의 타르타르산염과 시타글립틴 인산염의 유리지방산에 의한 유도된 세포내 지방축적 억제효과 확인

간세포에 유리지방산을 처치하면 세포 내 지방 축적이 증가하는데, 유리지방산과 약물을 병용 처치함으로써 세포 내 지방축적을 억제하는 효과를 중성지방 염색법으로 정량했다.

사람 간암세포주인 HepG2 세포를 10(v/v)% 우태아 혈청을 포함하는 minimum essential media (MEM) 배지에 48시간 동안 배양하였다. 이후, 1(v/v)% 소혈청 알부민을 포함하는 MEM 배지에 oleate와 palmitate (Sigma)의 몰 (mole)농도 비율이 2:1 되도록 용해시켜 만든 0.5 mM 유리지방산 혼합액으로 교체한 뒤, 0.1(v/v)% 디메칠설폭사이드 (dimethyl sulfoxide; DMSO) 또는 각 시험 약물을 가하고 24시간 배양하였다.

음성 대조군은 1% 소혈청 알부민을 포함하는 MEM 배지에 유리지방산을 가하지 않고 0.1% 디메칠설폭사이드를 처치하였다. 배양 종료 후, 배지를 제거한 다음 세포를 인산완충액으로 세척하였다. 1(v/v)% 플루로닉 F127 (Pluronic F127, Invitrogen)을 함유하는 디메칠설폭사이드에 녹인 10 mM Nile Red (Sigma) 원액을 인산완충액에 1,000배 희석하여 세포에 가한 뒤 37도, 200 rpm, 차광 조건에서 30분간 세포 내 지방을 염색했다. 염색 후 상층액을 제거하고, 인산완충액으로 교체한 다음 488 nm 여기 파장과 550 nm 방출 파장 조건에서 형광 강도를 측정하였다. 이어서, 세포 수에 따른 편차를 보정하기 위해 동일 well에 10μM resazurin (Sigma)을 용해시킨 인산완충액을 가한 다음 37℃에서 1시간 차광 상태로 반응시키기 전·후 형광 측정기로 535 nm 여기 파장과 580 nm 방출 파장 조건에서 형광 강도를 측정해서 세포 내 미토콘드리아 활성에 의해 환원되어 형성된 resorufin에 의한 형광 강도 증가를 측정했다. 실험결과는 Nile Red의 형광 강도를 resazurin 환원에 의한 형광 강도 증가량으로 보정한 값을 이용해서, 음성 대조군에 비해 유리지방산 처리에 의해 증가된 지방축적에 대한 백분율로 표시했다.

그 결과 [도 10]에서와 같이 화합물 1의 타르타르산 염과 시타글립틴 인산염은 유리지방산에 의한 간세포에서의 지방축적을 농도 의존적으로 억제했으며, 1 μM 농도에서 나타난 28.7±3.2%의 억제효과는 간세포 막의 glucagon-like peptide-1 (GLP-1) 수용체를 활성화시켜 지방산 생합성을 억제하는 것으로 알려진 GLP-1 (Ding X, et al., Hepatology 2006, 43:173-181; Gupta NA, et al., Hepatology 2010, 51(5):1584-1592)이 100 nM에서 나타낸 28.0±4.9% 억제효과, 지방산 산화를 촉진해서 지방축적을 감소시키는 것으로 알려진 페노피브레이트 (fenofibrate; Hahn SE & Goldgerg DM, Biochem Pharmacol 1992, 43(3):625-33) 30㎛에서 나타난 35.6±6.5% 억제효과, 그리고 AMPK-activated protein kinase (AMPK)활성화를 통해 지방산 산화를 촉진하고 생합성을 억제하는 것으로 보고된 메트포르민 (metfromin; Zang M et al., J Biol Chem, 2004, 279(46):47898-47905) 1 mM 처리에 의한 23.6±5.0% 억제효과대비 동등수준의 효과이다. 이는 화합물 1의 타르타르산 염과 시타글립틴 인산염이 내인성 GLP-1증가에 의한 간접적 효과와 더불어, 간세포에 직접적으로 작용하여 지방축적을 억제함으로써 지방간 예방효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.

< 실시예 6> 마우스에서 CCl ₄ 유발 급성 간 손상 동물 모델에서 화합물 1의 타르타르산 염, 시타글립틴 인산염, 및 빌다글립틴의 TGF -β1 활성화 억제 효과

CCl₄에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에서 간 세포의 섬유화 과정에서 핵심 역할을 수행하는 것으로 알려진 TGF-β1 발현 억제에 대한 본발명의 화합물의 예방 효과를 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 안정화시킨 후 체중에 따라 총 9군 (n=7)로 군 분리한 후 CCl₄ (0.1ml/kg)을 복강 내로 투약하고 정상 대조 군에는 olive oil을 투약하였다. 3일간 24시간 간격으로 대조 군에는 vehicle 용액 (0.5% MC)을 1일 1회 10ml/kg으로 경구투여 하고 나머지 군은 지정된 군에 따라 화합물 1의 타르타르산 염 30, 100, 300mg/kg, 시타글립틴 인산염(WO2004/085378 또는 WO2005/003135에 기재된 방법으로 제조함) 100, 300mg/kg 및 빌다글립틴(Trademax, China) 100, 300mg/kg을 1일 1회 경구 투여하였다. 마지막 경구 투여 후 1시간 경과시 부검을 실시하여 적출된 간에서 TGF-β1 mRNA 발현을 평가하였다. 액체 질소에 보관 중인 간 조직을 TRIZOL 용액상에서 균질화 (homogenization)한 후 총 RNA를 추출하였다. 분리된 RNA을 0.1% DEPC,diethylpyrocarbonate)로 희석하여 1㎍/㎕의 농도로 만든 후 RNA 혼합 액 [2 ㎍/㎕ each RNA + 2 ㎕ of 0.5 ㎍/㎕ olig d(T)15 + up to 15 ㎕ of 0.1% DEPC water]을 PCR 기계를 이용하여 72℃에서 5분간 배양시킨 후 ice상에서 급냉시켰다. 혼합액 [1㎕ of PCR nucleotide mix + 5 ㎕ of 5X MMLV RT bf.(Promega, M531A) + 1 ㎕ of 200 ㎍/㎕ M-MLV reverse]을 준비한 후 42℃에서 60분간 elongation시킨 후 95℃에서 5분간 denaturation 시킨 후 8℃에서 급랭시켜 cDNA을 합성하였고 다음 단계까지 -20℃에서 보관하였다. RT-PCR을 실시하기 위해 혼합액 [1 ㎕ of 20 pmol each Primer + 9.5 ㎕ of Nuclease-free water]을 준비한 후 각 cDNA 2㎕을 멸균된 PCR tube에 넣고 remix TaqTM (TaKaRa, RR003A) 12.5㎕를 각 tube에 넣고 혼합 한 후 하기 조건에서 (표 4), Thermal Cycler (PTC-200, MJ Research)을 이용하여 PCR을 실시하였다. PCT products을 전기영동 시킨 후 Image Analyzer (Vilber Lourmat)을 이용하여 분석하였으며, β-actin 발현을 이용하여 타깃 유전자인 TGF-β1 발현을 normalization시켰다. (도 11) 그 결과는 표5와 같다.

[표 4] RT - PCR 시험 조건 및 PCR primer sequence

[표5] CCl ₄ 유발 급성 간 손상 마우스 모델에서 화합물 1의 타르타르산 염, 시타글립 틴 인산염, 및 빌다글립틴의 TGF -ß1 활성화 억제 효과

그 결과, 표5 및 도11에서와 같이 CCl₄ 대조 군에서 간의 TGF-β1의 mRNA 발현은 정상군에 비해 22% 증가하였으며, 화합물 1의 타르타르산 염 및 빌다글립틴에 의한 normalization되었으며, 시타글립틴 인산염 투여 군에서도 CCl₄군에 비해 발현이 감소하므로, CCl₄유발 TGF-β1 발현에 대한 억제효과를 나타내었다. 또한 CCl₄ 대조군 대비 간의 TGF-β1 mRNA 발현의 감소 비율은 화합물 1의 타르타르산 염 투약 군에서 최대 135%, 시타글립틴 투여 군에서는 최대 41%, 빌다글립틴 투여 군에서 최대 115%의 감소를 나타내어, 이 또한 본 발명의 화합물이 TGF-β1 발현 증가에 의한 간의 섬유화의 발생에 약효가 있음을 시사한다.

< 실시예 7> 비만 동물 모델인 ob / ob 마우스에서 화합물 1의 타르타르산 및 시타글 립틴의 인산염의 알라닌 아미노트랜스퍼라제 감소 효과

상기 화합물 1의 타르타르산 염 및 시타글립틴 인산염의 단순 지방간 (simple steatosis)에 대한 치료 효과를 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

5주령의 웅성 C57BL/6 마우스 (정상 마우스군) 및 ob/ob 마우스(비만 마우스군)를 안정화 시킨 후 체중 및 혈당에 따라 총 6군으로 분리해 일반 사료 및 약물 혼합사료를 공급하였다. 마우스의 사료 소비량은 마우스 체중 10g당 약 1g의 사료 섭취를 나타내므로 화합물 1의 타르타르산 염의 1일 목표 용량 (target dose)인 10, 100, 300 mg/kg를 공급하기 위해 일반 사료에 0.01중량%, 0.1중량%, 0.3중량%의 상기 화합물 1의 타르타르산 염 및 0.3중량%의 시타글립틴 인산염을 혼합하여 사료를 제작하였다. 사료를 공급한지 4주가 경과한 후 부검을 실시하여 혈청을 분리 후 혈액분석기를 통해 혈장 알라닌 아미노트랜스퍼라제 수치를 측정하였다(표6).

[표6] 비만 동물 모델인 ob / ob 마우스에서 화합물 1의 타르타르산 염 및 시타글립틴 인산염에 의한 혈장 알라닌 아미노트랜스퍼라제 ( ALT ) 감소 효과

그 결과 화합물 1의 타르타르산 염 및 시타글립틴 인산염의 투여에 의해 혈장 알라닌 아미노트랜스퍼라제의 감소가 나타났음이 확인되었다. 이러한 결과는 지방간에 의해 증가된 알라닌 아미노트랜스퍼라제 대해 화합물 1의 타르타르산 염 및 시타글립틴 인산염이 감소 작용을 나타내어 단순 지방간 치료제로 사용될 수 있음을 나타낸다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 1, 시타글립틴(Sitagliptin), 빌다글립틴(vildagliptin), 리나글립틴(linagliptin) 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효성분을 함유하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 유효성분은 화학식 1로 표시되는 화합물 1 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것인 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 유효성분은 화합물 1의 타르타르산 염인 것인 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 유효성분은 시타글립틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것인 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 유효성분은 시타글립틴 인산염인 것인 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 유효성분은 빌다글립틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것인 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 유효성분은 리나글립틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것인 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비알콜성 지방간 질환은 고지혈증, 당뇨 또는 비만으로부터 발생되는 것인 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 비알콜성 지방간 질환은 단순 지방간, 비알콜성 지방간염, 간섬유화 및 간경화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 예방 또는 치료용 약학적 조성물.