ES2959842T3 - Combinación de un agonista de PPAR con un agonista de FXR - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una combinación de ingredientes activos para uso en el tratamiento de enfermedades. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Combinación de un agonista de PPAR con un agonista de FXR

Antecedentes de la invención

De acuerdo con el Washington Manual of Medical Therapeutics (31a ed.; 2004; Lippincott Williams & Wilkins), los trastornos hepáticos se pueden clasificar en diferentes grupos de enfermedades, en particular enfermedades virales, enfermedades hepáticas relacionadas con las drogas y el alcohol, enfermedades hepáticas inmunomediadas, enfermedades metabólicas del hígado, enfermedades diversas tales como la enfermedad del hígado graso no alcohólico y complicaciones. de insuficiencia hepática (tales como insuficiencia hepática fulminante o carcinoma hepatocelular).

En particular, la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés) es un trastorno hepático común con características histológicas de enfermedad del hígado graso inducida por el alcohol en individuos que consumen poco o nada de alcohol (Yeh M et al., 2007; Marchesini et al., 2003). La NAFLD se debe a la retención anormal de lípidos dentro de las células (comúnmente definida como esteatosis), un evento más frecuente en el hígado ya que este órgano es el principal responsable del metabolismo de los lípidos. La NAFLD tiene un espectro de formas histológicas que incluyen esteatosis hepática y esteatohepatitis no alcohólica (NASH), que se caracteriza por inflamación del hígado, esteatosis, necrosis y fibrosis debido a la alteración de las células hepáticas. Las afecciones asociadas con la NAFLD son variadas e incluyen diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, síndrome metabólico, tratamiento con fármacos hepatotóxicos, toxinas, agentes infecciosos u otras causas exógenas.

Aunque la NAFLD suele seguir un curso clínico benigno y no progresivo, la NASH es una afección potencialmente grave; hasta 25% de los pacientes pueden progresar a fibrosis avanzada, cirrosis y experimentar complicaciones de hipertensión portal, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular, lo que hace obligatoria una evaluación temprana y correcta (Yeh M et al., 2007).

Los sistemas de generación de imágenes hepáticas son útiles para evaluar también la estructura del hígado y la presencia de esteatosis. Sin embargo, la biopsia hepática sigue siendo el criterio de referencia para evaluar la fibrosis hepática, pero este método de análisis no se puede realizar en todos los estudios debido a su carácter invasivo. La evaluación no invasiva de la bioquímica y el metabolismo del hígado se utiliza a menudo para definir enfermedades hepáticas, tales como en NAFLD y NASH (Gressner A et al., 2009; Vuppalanchi R y Chalasani N, 2009). Al utilizar plasma, se miden comúnmente niveles elevados de enzimas tales como Alanina aminotransferasa (ALAT), Aspartato aminotransferasa (ASAT), Fosfatasa alcalina (AP) y/o Gamma glutamil transpeptidasa (GGT), así como la presencia de otras proteínas de origen hepático (incluyendo haptoglobina, bilirrubina total, alfa-2-microglobulina, Resistina, citoqueratina-18 escindida o intacta) además de los parámetros de glucosa sérica y resistencia a la insulina. Dado que el nivel de actividad ALAT aumenta con frecuencia en pacientes con NASH (Angulo P et al., 2002), este criterio se considera un marcador sustituto para evaluar la lesión hepática. De hecho, no se dispone de métodos no invasivos fiables para diagnosticar correctamente NAFLD o NASH e incluso las características histológicas no siempre son suficientes para distinguir adecuadamente NAFLD o NASH de otras afecciones como la enfermedad hepática alcohólica (Yeh M et al., 2007, Vuppalanchi R y Chalasani N, 2009).

Los medios para un tratamiento eficaz de las enfermedades fibróticas del hígado, en particular de NAFLD y NASH, son todavía insuficientes. No se ha establecido ningún tratamiento para pacientes con NASH y se prueban varias opciones terapéuticas en ensayos clínicos (Vuppalanchi R y Chalasani N, 2009, Dowman J.K et al., 2009). Estos estudios implican el uso de muchas familias diferentes de compuestos químicos (fibratos, tiazolidinodionas, biguanidas, estatinas, cannabinoides) y dianas terapéuticas (receptores nucleares, receptores de angiotensina, receptores cannabinoides, HMG-CoA reductasa). Recientemente, estudios con tiazolidinodionas (Rosiglitazona y Pioglitazona) han demostrado que estos fármacos pueden mejorar la condición hepática, pero el tratamiento con estos fármacos no está exento de efectos no deseados, tales como mayores riesgos de insuficiencia cardíaca congestiva y osteoporosis, así como aumento de peso con efectos psicológicos sobre el paciente (Dowman J.K et al., 2009; Shiri-Sverdlov R et al., 2006; Neuschwander-Tetri et al., 2003). Los ensayos clínicos que implican la administración de cannabinoides han planteado la preocupación de que se produzcan alteraciones neuropsiquiátricas (Vuppanchi R y Chalasani N, 2009). Otras terapias actualmente en curso buscan evaluar los fármacos NASH como antioxidantes, pero ninguno de estos tratamientos ha mostrado resultados convincentes (Nelson A et al., 2009).

Actualmente no existen tratamientos aprobados para NASH, pero dos compuestos con diferentes mecanismos de acción se encuentran actualmente en ensayos clínicos de Fase 3: ácido obeticólico (OCA, agonista de FXR) y Elafibranor.

El documento WO2016154258 se refiere a métodos de tratamiento de enfermedades hepáticas utilizando derivados del ácido indanoacético. El documento US2006252670 se refiere a métodos para reducir los efectos secundarios inducidos por PPARy en un paciente, mediante la administración de un agonista de FXR. Ratziu et al. (Dig Dis Sci, 2016, 61: 1398-1405) analizan las opciones de farmacoterapia en NASH. El documento WO2016127019 se refiere a composiciones farmacéuticas para terapia combinada, que comprenden una combinación de un agonista de FXR y al menos un agente hipolipemiante. Baghdasaryan et al. (Hepatology, 2011, 54(4): 1303-1312) informan de que el agonista dual de FXR/TGR5 INT-767 reduce la lesión hepática en el modelo de colangiopatía en ratónmdr2-/-(Abcb4'1')mediante la promoción de la producción HCO3- biliar.

La 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona (Elafibranor, o ELA anteriormente denominada GFT505), un agonista dual de PPAR-alfa/delta divulgado en el documento WO2004005233, posee propiedades que pueden ser ventajosas para el tratamiento de numerosas enfermedades gastroenterológicas y hepáticas, en particular enfermedades colestásicas tales como PBC (colangitis biliar primaria) y PSC (colangitis esclerosante primaria), o enfermedades hepáticas, en particular enfermedades hígado graso no alcohólico (NAFLD) tales como la Esteatohepatitis No Alcohólica (NASH).

Se ha probado la eficacia clínica de elafibranor en NASH en un ensayo de fase 2b basado en biopsia hepática de 1 año de duración (GFT505-2127), uno de los estudios de intervención más grandes jamás realizados en NASH. Administrado a más de 800 pacientes y voluntarios sanos hasta la fecha, elafibranor ha demostrado propiedades beneficiosas para NASH, que incluyen en particular: mejora de los marcadores de disfunción hepática, incluidos ALAT, ASAT, yGT, ALP; mejora de la sensibilidad a la insulina y la homeostasis de la glucosa; efectos favorables sobre los lípidos plasmáticos, incluida la disminución de los triglicéridos plasmáticos y LDL-C, y el aumento de los niveles de HDL-C; propiedades anti-inflamatorias; eficacia sobre los parámetros histológicos de NASH (esteatosis, inflamación, fibrosis) en modelos de enfermedades animales - actividades antifibróticas; y la ausencia de problemas de seguridad se ha confirmado en un paquete toxicológico completo de estudios de carcinogenicidad de hasta 2 años de duración. Elafibranor se está evaluando actualmente en un estudio clínico de fase 3 para el tratamiento de NASH. También se ha iniciado la evaluación de esta molécula para el tratamiento de la PBC en un estudio clínico de fase 2.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere al objeto definido en las reivindicaciones.

La presente divulgación proporciona un producto combinado que comprende:

(i) un agonista de PPAR; y

(ii) un agonista de FXR.

En la presente invención, el agonista de PPAR es el agonista de PPARa/5 Elafibranor (ELA en la siguiente descripción) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En la presente invención, el agonista de FXR es Ácido obeticólico (u OCA en la siguiente descripción) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o INT-767 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una realización particular adicional, el producto combinado de la invención es una composición que comprende:

(i) ELA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(ii) un agonista de FXR, en donde el agonista de FXR es OCA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o INT-767 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en particular OCA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

un portador farmacéuticamente aceptable.

En otra realización particular, el producto combinado es un kit de partes que comprende:

(i) ELA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

(ii) OCA o una sal farmacéuticamente aceptable del misma.

En una realización particular adicional, el producto combinado de la invención es una composición que comprende:

(i) ELA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

(ii) INT-767 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

un portador farmacéuticamente aceptable.

En otra realización particular, el producto combinado es un kit de partes que comprende:

(i) ELA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

(ii) INT-767 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo).

El kit de partes de la invención es para uso secuencial, separado o simultáneo en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades mencionadas en el presente documento, en particular para el tratamiento de NAFLD, NASH, fibrosis hepática, cirrosis hepática, PBC o PSC.

También se divulga en el presente documento una composición para uso en un método para el tratamiento de una serie de enfermedades, incluidas enfermedades inflamatorias, metabólicas, fibróticas y colestásicas, que comprende administrar el producto combinado de la invención a un sujeto que lo necesite.

En una realización particular, (i) y (ii) se usan en una cantidad eficaz sinérgica, en donde el efecto combinado de las cantidades de (i) y (ii) es mayor que la suma de los efectos terapéuticos de las cantidades de (i) y (ii) administradas individualmente. Gracias a la invención, la cantidad de cada uno de los compuestos (i) y (ii) administrados al paciente puede reducirse en comparación con la cantidad de dichos compuestos (i) y (ii) administradas individualmente, en al menos un factor de 1,5, al menos un factor de 2 o incluso al menos un factor de 3 o superior tal como en al menos un factor de 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Por ejemplo, la cantidad de ELA administrada a pacientes en ensayos clínicos es de 80 o 120 mg/día y la cantidad de OCA administrada a los pacientes en ensayos clínicos es de 10 o 25 mg/día, y la cantidad sinérgica según la invención, con una reducción del factor de 3 puede ser de 27 mg o 40 mg/día de ELA y de 3 y 8 mg/día para OCA.

En una realización particular, el paciente que está siendo tratado con el producto combinado de la invención es un paciente que tiene NAFLD, NASH, fibrosis hepática, cirrosis hepática, PBC o PSC.

En otro aspecto, la invención se refiere al producto combinado de la invención, para uso en un método para el tratamiento de una enfermedad, tal como una enfermedad inflamatoria, metabólica, fibrótica o colestásica. En este aspecto, cada uno de los componentes del producto combinado se puede utilizar en una cantidad eficaz sinérgica. En una realización adicional, la enfermedad es NAFLD, NASH, fibrosis hepática, cirrosis hepática, PBC o PSC.

En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso del producto combinado de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, tal como una enfermedad inflamatoria, metabólica, fibrótica o colestásica. En este aspecto, cada uno de los componentes del producto combinado se puede utilizar en una cantidad eficaz sinérgica. En una realización adicional, la enfermedad es NAFLD, NASH, fibrosis hepática, cirrosis hepática, PBC o PSC.

Leyendas de las figuras

Figura 1:Efecto de Elafibranor (GFT505), OCA y su combinación sobre la fibrosis hepática en ratas alimentadas con CDAA/col (n=10/grupo).

El porcentaje de superficie de fibrosis se evaluó mediante cuantificación morfométrica del área positiva de picrosirius en relación con el área de la sección del hígado. Los datos se expresan como media ± DT. # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001 usando la prueba t de Student. § p<0,05, §§ p<0,01, §§§ p<0,001, §§§§ p<0,0001 utilizando la prueba de Kruskal-Wallis y post-hoc de Dunn sin corregir. HSA, modelo de agente único más alto.

Figura 2:Efecto de Elafibranor (GFT505), OCA y su combinación sobre el contenido de colágeno hepático en ratas alimentadas con CDAA/col (n=10/grupo).

Los datos se expresan como media ± DT. # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001 usando la prueba t de Student. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 usando ANOVA unidireccional y prueba post-hoc de Fisher sin corregir. § p<0,05, §§ p<0,01, §§§ p<0,001, §§§§ p<0,0001 utilizando la prueba Kruskal-Wallis y post-hoc de Dunn sin corregir. HSA, modelo de agente único más alto.

Figura 3:Efecto de Elafibranor (GFT505), OCA y su combinación sobre la expresión de genes implicados en la remodelación de tejidos y la inflamación en hígados de ratas alimentadas con CDAA/col (n=10/grupo).

La expresión de aSMA (ACTA2), TIMP1 y TGFp se evaluó mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los datos se expresan como media ± DT. # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001 usando la prueba t de Student. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 usando ANOVA unidireccional y prueba post-hoc de Fisher sin corregir. § p<0,05, §§ p<0,01, §§§ p<0,001, §§§§ p<0,0001 utilizando la prueba Kruskal-Wallis y post-hoc de Dunn sin corregir. HSA, modelo de agente único más alto.

Figura 4:Efecto antifibrótico diferencial de Elafibranor e INT-767 en hHSC inducidas por TGFp. Las HSC privadas de suero se preincubaron durante 1 hora con Elafibranor (A) e INT-767 (B) antes de la activación con la citocina profibrogénica TGFp1 (1 ng/ml). Después de 48 horas de incubación, se midió la expresión de a-SMA mediante ELISA. Los valores obtenidos se transformaron en porcentaje de inhibición sobre el control de TGFp1. Los datos se presentan como media (cuadruplicados) ± desviación típica (DT).

Figura 5:La combinación de Elafibranor con INT-767 inhibe sinérgicamente la producción de a-SMA en hHSC inducidas por TGFp1. Las combinaciones se probaron en un formato de matriz de dosis-respuesta y se analizaron según el modelo de aditivismo Exceso Sobre Bliss (EOB en sus siglas en inglés). Se prepararon series de diluciones de Elafibranor (fila) e INT-767 (columna), incluidos sus respectivos controles de DMSO. Las mezclas resultantes se añadieron a HSC privadas de suero, 1 hora antes de la activación con la citocina profibrogénica TGFpl (1 ng/ml). (A) Porcentaje de inhibición de a-SMA sobre el control de TGFp1 para todos los pares de combinación. Los datos se presentan como media de cuadruplicados. (B) Las puntuaciones de EOB se calcularon como se describe en Materiales y métodos. Cualquier par de compuestos con valores de EOB > 10 se consideró sinérgico (coloreado de gris claro a negro). También se calculó la puntuación EOB total, incluidas todas las combinaciones. (C) Los valores de datos derivados de un par de combinación sinérgica se trazaron en una representación de gráfico de barras. Los datos se presentan como media (cuadruplicados) ± desviación típica (DT). *p<0,05; **p<0,01; *** p<0,001 **** p<0,0001 usando una prueba t de Student para comparar el grupo de combinación con el agente único más alto.

Descripción detallada de la invención

Como se emplea anteriormente, el término "administrar" incluye cualquier modo de administración, tal como oral, subcutánea, sublingual, transmucosa, parenteral, intravenosa, intraarterial, bucal, sublingual, tópica, vaginal, rectal, oftálmica, ótica, nasal, inhalada, intramuscular, intraósea, intratecal y transdérmica, o una combinación de las mismas. En una realización preferida, los compuestos se administran por vía oral, en particular en forma de uno o más comprimidos.

"Administrar" también puede incluir prescribir o cumplimentar una receta para una forma de dosificación que comprende un compuesto particular. "Administrar" también puede incluir proporcionar instrucciones para llevar a cabo un método que implique un compuesto particular o una forma de dosificación que comprenda el compuesto.

Como se emplea en el presente documento, el término "enfermedad" se refiere a una enfermedad, trastorno, afección, síntoma o indicación. Este término se utiliza indistintamente con la frase "enfermedad o trastorno".

Como se emplea anteriormente y en toda la divulgación, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado deseado con respecto al tratamiento del trastorno, afección o efecto secundario relevante. Se apreciará que la cantidad eficaz de componentes de la presente invención puede variar de un paciente a otro no sólo con el compuesto, componente o composición particular seleccionado, la vía de administración y la capacidad de los componentes para provocar una respuesta deseada en el individuo, sino también con factores tales como el estado de la enfermedad o la gravedad de la afección que se vaya a aliviar, los niveles hormonales, la edad, el sexo, el peso del individuo, el estado del paciente y la gravedad de la afección que se está tratando, la medicación concurrentemente o dietas especiales que después siga el paciente en particular, y otros factores que los expertos en la técnica reconocerán, quedando la dosificación adecuada en última instancia a discreción del médico a cargo. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar una respuesta terapéutica mejorada. Una cantidad eficaz es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de los componentes es superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

El término "sinérgico" como se emplea en el presente documento significa que el efecto logrado con el producto combinado y los métodos de esta invención es mayor que la suma de los efectos que resultan de los componentes de la combinación o de los métodos que comprenden uno de los componentes por separado y en las cantidades empleadas en los métodos y composiciones del presente documento. Tal sinergia se puede determinar según métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, como utilizando el método Exceso Sobre Bliss (EOB).

El producto combinado de la invención puede lograr mejores efectos que el efecto que se puede lograr con cada uno de sus componentes usado por separado, en particular cuando se usa en una cantidad eficaz sinérgica. Una "cantidad eficaz sinérgica" es una cantidad de cada uno de los componentes del producto combinado que permite lograr un efecto sinérgico cuando se administra a un sujeto que lo necesita. En otras palabras, cuando los componentes (i) y (ii) se usan en una cantidad eficaz sinérgica, el efecto combinado de las cantidades de (i) y (ii) es mayor que la suma de los efectos terapéuticos de las cantidades de (i) y (ii) administrados individualmente. Como se mencionó anteriormente, la cantidad de cada uno de los compuestos (i) y (ii) administrados al paciente puede reducirse en comparación con la cantidad de dichos compuestos (i) y (ii) administrados individualmente. Por ejemplo, la cantidad de cada componente se puede reducir en al menos un factor de 1,5, al menos un factor de 2 o incluso al menos un factor de 3 o superior tal como en al menos un factor de 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Por ejemplo, la cantidad de ELA administrada a pacientes en ensayos clínicos es de 80 o 120 mg/día y la cantidad de OCA administrada a pacientes en ensayos clínicos es de 10 o 25 mg/día, y la cantidad sinérgica según la invención, con una reducción del factor de 3 puede ser de 27 mg o 40 mg/día de ELA y de 3 y 8 mg/día para OCA.

Según la presente divulgación, el agonista de PPAR es un agonista de PPAR-alfa, un agonista de PPAR-gamma, un agonista de PPAR-delta, un agonista dual de PPAR-alfa/gamma, un agonista dual de PPAR alfa/delta, un agonista dual de PPAR-gamma/delta o un pan-agonista de PPAR alfa/gamma/delta.

El componente (ii) del producto combinado es al menos un agonista dual de PPAR-alfa/delta.

Según la presente divulgación, el término "agonistas de PPAR" se refiere a los agonistas del Receptor Activado por Proliferador de Peroxisomas, que son una clase de fármacos que desempeñan un papel central en la homeostasis de lípidos y glucosa. PPARa influye principalmente en el metabolismo de los ácidos grasos y su activación reduce los niveles de lípidos, mientras que PPARy participa principalmente en la regulación de la adipogénesis, el equilibrio energético y la biosíntesis de lípidos. PPAR5 participa en la oxidación de ácidos grasos, principalmente en los músculos esqueléticos y cardíacos, pero también regula los niveles de glucosa y colesterol en sangre.

Según la presente divulgación, el término "agonista de PPAR alfa" como se emplea en el presente documento incluye, pero sin limitarse a, fenofibrato, ciprofibrato, pemafibrato, gemfibrozilo, clofibrato, binifibrato, clinofibrato, ácido clofíbrico, nicofibrato, pirifibrato, plafibrida, ronifibrato, teofibrato, tocofibrato y SR10171.

Según la presente divulgación, el término "agonista de PPAR gamma" como se emplea en el presente documento incluye, pero sin limitarse a, Rosiglitazona, Pioglitazona, pioglitazona deuterada, efatutazona, ATx08-001, OMS-405, CHS-131, THR-0921, SER-150-DN, KDT-501, GED-0507-34-Levo, CLC-3001 y ALL-4.

Según la presente divulgación, el término "agonista de PPAR delta" como se emplea en el presente documento incluye, pero sin limitarse a, GW501516 (Endurabol o (ácido {4-[({4-metil-2-[4-(trifluorometil)fenil]-1,3-tiazol-5-il}metil)sulfanil]-2-metilfenoxi}acético)) o MBX8025 (Seladelpar o ácido {2-metil-4-[5-metil-2-(4-trifluorometilfenil)-2H-[1,2,3]triazol-4-ilmetilsulfanil]-fenoxi}-acético) o GW0742 (ácido [4-[[[2-[3-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-4-metil-5-tiazolil]metil]tio]-2-metilfenoxi]acético) o L165041 o HPP-593 o Nc P-1046.

Según la presente divulgación, el término "agonista de PPAR alfa/gamma" (también denominado glitazares) utilizado en el presente documento incluye, pero sin limitarse a, Saroglitazar, Aleglitazar, Muraglitazar, Tesaglitazar, DSP-8658. Según la presente divulgación, el término "agonista de PPAR alfa/delta" utilizado en el presente documento incluye, pero sin limitarse a, ELA o T913659.

Según la presente divulgación, el término "agonista de PPAR gamma/delta" utilizado en el presente documento incluye, pero sin limitarse a, un ácido linoleico conjugado (CLA), T3D-959.

Según la presente divulgación, el término "agonista de PPAR alfa/gamma/delta" utilizado en el presente documento incluye, pero sin limitarse a, IVA337 (Lanifibranor) o TTA (ácido tetradeciltioacético) o Bavaquinina o GW4148 o GW9135, o Bezafibrato o Lobeglitazona, o CS038, o ácido 2-(4-(5,6-metilendioxibenzo[d]tiazol-2-il)-2-metilfenoxi)-2-metilpropanoico (MHY2013).

El agonista de PPAR puede estar en forma de sal, hidrato, solvato, polimorfo o cocristal. El agonista de PPAR también puede estar en forma de hidrato, solvato, polimorfo o cocristal de una sal.

Según la invención, el agonista de PPAR es ELA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. ELA tiene la siguiente estructura:

ELA puede prepararse mediante los métodos descritos en los documentos WO2004/005233, WO2005/005369 o WO2011/144579.

Un agonista de FXR puede ser un agonista de FXR esteroide o no esteroide.

Los agonistas de FXR ilustrativos se divulgan en los documentos WO02072598, WO2005082925, WO03080803, WO04007521, WO04046162, WO04045511, WO04048349, WO05082925, WO07140174, WO08000643, WO08025540, WO08025539, WO07140183, WO08157270, WO09005998, WO09027264, WO09062874, WO09080555, WO09149795, WO10034649, WO10034657, WO11020615, WO11039130, WO12087519, WO13007387, WO14184271, WO15138986, WO16073767, WO16086115, WO16086134, WO16086169 y WO16086218. Según la presente divulgación, cada realización y cada agonista de FXR específico divulgado en estas referencias se divulga individualmente en el presente documento combinado con un agonista de PPAR.

Según un ejemplo particular, el agonista de FXR se selecciona del grupo que consiste en ácido obeticólico (INT-747), GS-9674, LJN-452 o LJN452, LJN-763, LMB763, EDP-305, AKN-083, INT-767, GNF-5120, LY2562175, INV-33, NTX-023-1, EP-024297, EPY-001, Px-103 y SR-45023. En un ejemplo particular adicional, el agonista de PPAR es ELA y el agonista de FXR se selecciona del grupo que consiste en ácido obeticólico (INT-747), GS-9674, LJN-452 o LJN452, LJN-763, LMB-763, EDP-305, AKN-083, INT-767, GNF-5120, LY-2562175, INV-33, NTX-023-1, EP-024297, EPY-001, Px-103 y SR-45023.

En una realización particular, el agonista de FXR es INT-767 que tiene la siguiente estructura:

En una realización particular, el agonista de FXR es ácido obeticólico (OCA; ácido 6a-etilquenodesoxicólico; INT-747) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. OCA tiene la siguiente estructura química:

El OCA se puede preparar mediante los métodos descritos en el documento WO2006122977.

El producto combinado de la invención se puede usar para la inhibición de la proliferación y/o activación de fibroblastos responsables de la producción de fibras de colágeno y/o responsables de la producción de la matriz extracelular. El producto combinado de la invención se puede usar para el tratamiento de una enfermedad, tal como una enfermedad inmunitaria (p. ej., autoinmunitaria), inflamatoria, metabólica, fibrótica o colestásica.

Según la presente invención, el término "enfermedades autoinmunitarias" se utiliza para designar una afección que surge de una respuesta inmunitaria anormal del organismo contra sustancias y tejidos normalmente presentes en el organismo. La enfermedad puede limitarse a determinados órganos (p. ej., en la diabetes tipo I o la tiroiditis autoinmunitaria) o afectar a un tejido concreto en diferentes lugares (p. ej., en la enfermedad de Goodpasture, afectación de la membrana basal del pulmón y del riñón).

El término "inflamación" se utiliza para designar una afección que surge de una respuesta protectora que involucra células anfitrionas, vasos sanguíneos y proteínas y otros mediadores que pueden servir para eliminar la causa de la lesión celular o tisular, así como las células o tejidos necróticos resultantes del insulto original, e iniciar el proceso de reparación. La reacción inflamatoria puede manifestarse por dolor, calor, enrojecimiento, hinchazón, dilatación de los vasos sanguíneos, aumento del flujo sanguíneo y pérdida de función.

Los términos "fibrosis", "enfermedad fibrótica", "trastorno fibrótico" y sus declinaciones denotan un estado patológico de depósito excesivo de tejido conectivo fibroso en un órgano o tejido. Más específicamente, la fibrosis es un proceso patológico que incluye una formación de cicatriz fibrótica persistente y una sobreproducción de matriz extracelular por parte del tejido conectivo, como respuesta al daño tisular. Fisiológicamente, el depósito de tejido conectivo puede destruir la arquitectura y función del órgano o tejido subyacente.

Según la presente invención, la fibrosis puede ser cualquier fibrosis de órgano o tejido. Los ejemplos ilustrativos, no limitantes, de fibrosis de órganos particulares incluyen fibrosis de hígado, riñón, piel, epidermis, endodermis, músculo, tendón, cartílago, corazón, páncreas, pulmón, útero, sistema nervioso, testículos, ovario, glándula suprarrenal, arteria, vena, colon, intestino (p. ej., intestino delgado), tracto biliar, tejido blando (p. ej., mediastino o retroperitoneo), médula ósea, articulaciones o estómago.

En una realización preferida, el trastorno fibrótico se selecciona del grupo que consiste en fibrosis de hígado, intestino, pulmón, corazón, riñón, músculo, piel, tejido blando (p. ej., mediastino o retroperitoneo), médula ósea, intestino y articulación (p. ej., rodilla, hombro u otras articulaciones).

En una realización más preferida, el trastorno fibrótico se selecciona del grupo que consiste en fibrosis de hígado, pulmón, piel, riñón e intestino.

En una realización más preferida de la presente invención, el trastorno fibrótico tratado se selecciona del grupo que consiste en la siguiente lista no exhaustiva de trastornos fibróticos: esteatohepatitis no alcohólica (NASH), fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis cutánea, fibrosis ocular, fibrosis endomiocárdica, fibrosis mediastínica, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal, fibrosis masiva progresiva (una complicación de la neumoconiosis de los trabajadores del carbón), fibrosis proliferativa, fibrosis neoplásica, fibrosis pulmonar consecutiva a enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias (EPOC, asma, enfisema, pulmón de fumador, tuberculosis, IPF), fibrosis hepática inducida por alcohol o drogas, cirrosis hepática, fibrosis hepática inducida por infección, fibrosis inducida por radiación o quimioterapia, fibrosis sistémica nefrogénica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, queloide, infarto de miocardio antiguo, esclerodermia/esclerosis sistémica, artrofibrosis, algunas formas de capsulitis adhesiva, colangiopatías fibrosantes crónicas tales como Colangitis Esclerosante Primaria (PSC) y Colangitis Biliar Primaria (PBC), atresia biliar, colestasis intrahepática familiar tipo 3 (PFIC3), fibrosis periimplantacional y asbestosis.

La colestasis se define como una disminución del flujo de bilis debido a una secreción alterada por los hepatocitos (colestasis hepatocelular) o a la obstrucción del flujo de bilis a través de los conductos biliares intra o extrahepáticos (colestasis obstructiva). En la práctica clínica, la colestasis es cualquier afección en la que el flujo de bilis desde el hígado se ralentiza o bloquea.

Los ejemplos de enfermedades inflamatorias, enfermedades fibróticas, enfermedades metabólicas y enfermedades colestásicas incluyen enfermedades hepáticas metabólicas, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedades hepáticas inducidas por fármacos, enfermedades hepáticas inducidas por alcohol, enfermedades hepáticas inducidas por agentes infecciosos, enfermedades inflamatorias del hígado, enfermedades hepáticas mediadas por disfunción del sistema inmunológico, dislipidemia, enfermedades cardiovasculares, reestenosis, síndrome X, síndrome metabólico, diabetes, obesidad, hipertensión, colangiopatías crónicas tales como Colangitis Esclerosante Primaria (PSC), Colangitis Biliar Primaria (PBC), atresia biliar, colestasis intrahepática familiar tipo 3 (PFIC3), enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, queloides, infarto de miocardio antiguo, esclerodermia/esclerosis sistémica, enfermedades inflamatorias, enfermedades neurodegenerativas, cánceres, cáncer de hígado, carcinoma hepatocallular, cáncer gastrointestinal, cáncer gástrico, meningioma asociado con neurofibromatosis, tumores neuroendocrinos pancreáticos, tumores exocrinos pancreáticos, leucemia, enfermedades mieloproliferativas/mielodisplásicas, mastocitosis, dermatofibrosarcoma, tumores sólidos que incluyen cáncer de mama, pulmón, tiroides o colorrectal, cáncer de próstata, fibrosis hepática o cirrosis de cualquier origen, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por enfermedades metabólicas, fibrosis o cirrosis inducida por NAFLD, fibrosis o cirrosis inducida por NASH, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por alcohol, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por fármacos, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por agentes infecciosos, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por infección parasitaria, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por infección bacteriana, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por infección viral, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por infección por VHB, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por infección por VHC, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por infección por VIH, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por infección dual por VHC y VIH, fibrosis o cirrosis inducidas por radiación o quimioterapia, fibrosis del tracto biliar, fibrosis o cirrosis hepáticas debidas a cualquier enfermedad colestásica crónica, fibrosis intestinal de cualquier etiología, fibrosis inducida por enfermedad de Crohn, fibrosis inducida por colitis ulcerosa, fibrosis del intestino (p. ej. intestino delgado), fibrosis del colon, fibrosis del estómago, fibrosis de la piel, fibrosis de la epidermis, fibrosis de la endodermis, fibrosis de la piel debida a esclerodermia/esclerosis sistémica, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar consecutiva a enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias, tales como EPOC, asma, enfisema, pulmón de fumador, tuberculosis, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática (IPF), fibrosis cardíaca, fibrosis renal, fibrosis sistémica nefrogénica, fibrosis muscular, fibrosis de tejidos blandos (p. ej., mediastino o retroperitoneo), fibrosis de la médula ósea, fibrosis de las articulaciones, fibrosis de los tendones, fibrosis del cartílago, fibrosis del páncreas, fibrosis del útero, fibrosis del sistema nervioso, fibrosis de los testículos, fibrosis de los ovarios, fibrosis de la glándula suprarrenal, fibrosis de las arterias, fibrosis de las venas, fibrosis ocular, fibrosis endomiocárdica, fibrosis mediastínica, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal, fibrosis masiva progresiva (una complicación de la neumoconiosis de los trabajadores del carbón), fibrosis proliferativa, fibrosis neoplásica, fibrosis periimplantacional y asbestosis, artrofibrosis, capsulitis adhesiva.

En una realización particular, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedades metabólicas del hígado, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedades hepáticas inducidas por fármacos, enfermedades hepáticas inducidas por alcohol, enfermedades hepáticas inducidas por agentes infecciosos, enfermedades inflamatorias del hígado, enfermedades hepáticas mediadas por disfunción del sistema inmunológico, dislipidemia, enfermedades cardiovasculares, reestenosis, síndrome X, síndrome metabólico, diabetes, obesidad, hipertensión, colangiopatías crónicas tales como Colangitis Esclerosante Primaria (PSC), Colangitis Biliar Primaria (PBC), atresia biliar, colestasis intrahepática familiar tipo 3 (PFIC3), enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por enfermedades metabólicas, fibrosis o cirrosis inducidas por NAFLD, fibrosis o cirrosis inducidas por NASH, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por alcohol, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por fármacos, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por agentes infecciosos, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por parásitos, fibrosis o cirrosis hepática inducidas infección bacteriana, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por infección viral, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por infección por VHB, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por infección por VHC, fibrosis o cirrosis hepáticas inducidas por infección por VIH, fibrosis o cirrosis hepática inducidas por infección dual por VHC y VIH, fibrosis o cirrosis inducidas por radiación o quimioterapia, fibrosis del tracto biliar, fibrosis o cirrosis hepáticas debidas a cualquier enfermedad colestásica crónica, fibrosis intestinal de cualquier etiología, fibrosis inducida por enfermedad de Crohn, fibrosis inducida por colitis ulcerosa, fibrosis del intestino (p. ej. intestino delgado), fibrosis del colon, fibrosis del estómago, fibrosis del pulmón, fibrosis del pulmón consecutiva a enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias, tales como EPOC, asma, enfisema, pulmón de fumador, tuberculosis, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática (IPF).

En una realización adicional, la enfermedad es NAFLD, NASH, fibrosis hepática, cirrosis hepática, PBC o PSC.

Los términos "tratamiento" o "tratar" se refieren a terapia, prevención o profilaxis de un trastorno en un sujeto que lo necesita. El tratamiento implica la administración de un producto combinado de la invención a sujetos (p. ej., pacientes) que tienen un trastorno declarado para prevenir, curar, retrasar, revertir o ralentizar la progresión del trastorno, mejorando así el estado de los pacientes. También se puede administrar un tratamiento a sujetos que están sanos o en riesgo de desarrollar un trastorno tal como un trastorno inmunitario (p. ej., autoinmunitario), inflamatorio, fibrótico o colestásico.

El término "sujeto" se refiere a un mamífero y más particularmente a un ser humano. Los sujetos que se van a tratar según la invención se pueden seleccionar apropiadamente basándose en varios criterios asociados con procesos patológicos inmunitarios (p. ej., autoinmunitarios), inflamatorios, fibróticos y colestásicos tales como tratamientos farmacológicos anteriores y/o actuales, patologías asociadas, genotipo, exposición a factores de riesgo, así como cualquier otro biomarcador relevante que pueda evaluarse mediante cualquier método inmunológico, bioquímico o enzimático adecuado.

Los autores de la presente invención muestran en el presente documento que la combinación de un agonista de PPAR y de un agonista de FXR, en particular la combinación de ELA y OCA o INT-767, en particular la combinación de ELA y OCA beneficiaría a una población de pacientes más amplia y podría tener un efecto sinérgico, permitiendo así la reducción de la dosis terapéutica. La reducción de la dosis terapéutica asociada puede disminuir la incidencia de efectos adversos del fármaco. Por consiguiente, la invención también se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad como se define anteriormente, con una incidencia reducida de efectos adversos del fármaco.

La frecuencia y/o cantidad relativas a la administración pueden ser adaptadas por un experto en la técnica, en función del paciente, la patología, la forma de administración, etc. Típicamente, el producto combinado de la presente invención se puede administrar para el tratamiento de una enfermedad a una dosis de ELA comprendida entre 10 mg/día y 1000 mg/día, tal como de 50 mg/día a 500 mg/día, y particularmente de 70 mg/día a 150 mg/día. La dosis de OCA puede estar comprendida entre 5 mg/día y aproximadamente 100 mg/día, tal como una dosis de aproximadamente 10 mg/día a aproximadamente 50 mg/día. En una realización particular de la invención, el OCA se usa combinado con ELA a una dosis comprendida entre 10 mg/día y 25 mg/día para OCA y entre 80 y 120 mg/día para ELA. En una realización particular, se usa OCA a 10 o 25 mg/día y se usa ELA a 80 o 120 mg/día.

En otra realización, la cantidad tanto del agonista de PPAR como del agonista de FXR es una cantidad eficaz sinérgica. Las realizaciones particulares incluyen una reducción en un factor 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 8,5, 10 o de más de 10 del agonista de PPAR y/o del agonista de FXR. En una realización particular adicional que implementa ELA (o una cantidad farmacéuticamente eficaz del mismo) como agonista de PPAR y OCA o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, INT-767 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o LJN452 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como agonista de FXR incluye una reducción en un factor 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 8,5, 10 o de más de 10 de ELA y/o del agonista de FXR. Otras realizaciones particulares que implementan ELA (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) como agonista de PPAR y OCA (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) como agonista de FXR incluyen:

- una reducción en un factor de 1,5 de la cantidad de ambos componentes, utilizándose ELA a una dosis comprendida entre 5 y 80 mg/día y utilizándose OCA a una dosis comprendida entre 7 y 17 mg/día;

- una reducción en un factor de 2 de la cantidad de ambos componentes, utilizándose ELA a una dosis comprendida entre 40 y 60 mg/día y utilizándose OCA a una dosis comprendida entre 5 y 12,5 mg/día;

- una reducción en un factor de 2,5 de la cantidad de ambos componentes, utilizándose ELA a una dosis comprendida entre 32 y 48 mg/día y utilizándose OCA a una dosis comprendida entre 4 y 10 mg/día;

- una reducción en un factor de 3 de la cantidad de ambos componentes, utilizándose ELA a una dosis comprendida entre 27 y 40 mg/día y utilizándose OCA utilizada a una dosis comprendida entre 3 y 8 mg/día;

- una reducción en un factor de 5 de la cantidad de ambos componentes, utilizándose ELA a una dosis comprendida entre 16 y 24 mg/día y utilizándose OCA utilizada a una dosis comprendida entre 2 y 5 mg/día;

- una reducción en un factor de 10 de la cantidad de ambos componentes, utilizándose ELA a una dosis comprendida entre 8 y 12 mg/día y utilizándose OCA utilizada a una dosis comprendida entre 1 y 2,5 mg/día;

- etc.

En una realización particular, la cantidad de cada uno de los componentes del producto combinado de la invención se administra como una dosificación única, una vez al día, o administrando varias veces los componentes, por ejemplo, administrando la mitad de la cantidad diaria dos veces al día, tal como durante las comidas (por ejemplo, durante el almuerzo y la cena).

En una realización particular, el agonista de PPAR y el agonista de FXR se administran de forma simultánea, secuencial o por separado. En una realización particular, el agonista de PPAR y el agonista de FXR se administran secuencialmente, administrándose primero el agonista de PPAR y después el agonista de FXR, o administrándose primero el agonista de FXR y después el agonista de PPAR.

El tiempo de tratamiento puede variar en gran medida dependiendo de la afección que se vaya a tratar y del estadio de dicha afección. Por ejemplo, el producto combinado se puede administrar al menos dos o más días consecutivos, tal como al menos 7, 8, 9 o 10 días o más; al menos una semana o más, tal como al menos 1,2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 60, 70 o 72 semanas o más; al menos un mes o más, tal como al menos 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 o 24 meses o más; o al menos un año o más, tal como al menos 1,2, 3, 4 o 5 años o más.

La invención se describe con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos, no limitantes.

Ejemplos

Materiales y métodos

Evaluación de Elafibranor, OCA y la combinación Elafibranor OCA en un modelo crónico con CDAA colesterol 1% (12 semanas)

Los efectos preventivos de Elafibranor (GFT505) solo, OCA solo y la combinación de ambos se evaluaron en un modelo fibrosante de NASH de ratas alimentadas con una dieta de CDAA colesterol al 1%. Se alimentaron ratas Wistar macho de 150-175 g con una dieta de control (CSAA), dieta de CDAA colesterol al 1%, o dieta de CDAA colesterol al 1% complementada con 1, 3 y 10 mg/kg/día de Elafibranor, 10 y 30 mg/kg/día de OCA o fármacos combinados (1,3 y 10 mg/kg/día de Elafibranor combinados con 10 mg/kg/día de OCA) durante 12 semanas.

El peso corporal y la ingesta de alimentos se controlaron dos veces por semana. El último día de tratamiento, las ratas fueron sacrificadas después de un período de ayuno de 6 h. El hígado fue rápidamente extirpado para estudios bioquímicos e histológicos.

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con protocolos normalizados y de acuerdo con las recomendaciones convencionales para el cuidado y uso adecuados de animales de laboratorio.

Histología

Inclusión y seccionamiento de tejidos:

Las rebanadas de hígado se fijaron primero durante 12 horas en una solución de formalina al 4%. A continuación, las porciones de hígado se lavaron durante 30 minutos en PBS y se deshidrataron en soluciones de etanol (baños sucesivos de etanol del 70, 80, 95 y 100%). Las porciones de hígado se incubaron en tres baños diferentes de Xileno (Sigma-Aldrich Núm. de cat. 534056), seguidos de dos baños en parafina líquida (56°C). Después, las porciones de hígado se colocaron en rejillas que se rellenaron suavemente con Histowax® para cubrir completamente el tejido.

Los bloques de parafina que contenían las porciones de tejido se retiraron de las rejillas y se almacenaron a temperatura ambiente. Los bloques de hígado se cortaron en rebanadas de 3 pm.

Tinción hematoxilina / eosina

Las secciones de hígado se desparafinaron, se rehidrataron y se incubaron durante 3 minutos en hematoxilina de Mayer (Microm, Núm. de cat. F/C0303). A continuación, las secciones de hígado se enjuagaron con agua y se incubaron durante 1 minuto en eosina G (VWR, Número cat. 1.09844.1000). Las secciones se enjuagaron con agua, después se deshidrataron y se montaron utilizando el medio CV Mount (Leica, Núm. de cat. 14046430011).

Tinción con Rojo Picrosirius

Las secciones de hígado se desparafinaron, se rehidrataron y se incubaron durante 15 minutos en una solución de Fast Green FCF al 0,1% (Sigma-Aldrich, Núm. de cat. F7258) antes de enjuagar en un baño de ácido acético al 0,5 % (Panreac, Núm. de cat. 131008.1611). A continuación, las secciones de hígado se enjuagaron con agua y se incubaron durante 30 minutos en una solución de Rojo Sirius al 0,1 % (Direct Red 80, Fluka Núm. de cat. 43665) en ácido pícrico acuoso saturado (Sigma-Aldrich Núm. de cat. P6744). Después, las secciones se deshidrataron, y se montaron utilizando el medio CV Mount (Leica, Núm. de cat. 14046430011).

Exámenes histológicos

Un técnico que desconocía el origen de cada espécimen de hígado realizó exámenes histológicos. Las diapositivas virtuales se generaron utilizando el escáner Pannoramic 250 de 3D Histech. Para cada animal, se atribuyó una puntuación que resume las principales lesiones histológicas de NASH según la NASH Clinical Research Network (Kleiner 2005, Brunt 1999). Brevemente, se calificaron la esteatosis, la inflamación lobulillar y el abombamiento de los hepatocitos. La Puntuación de Actividad NAFLD (puntuación NAS) se estableció para cada individuo como la suma no ponderada de la esteatosis, la inflamación lobulillar y la clasificación de la lesión por abombamiento.

Utilizando el soporte lógico Quant Center (3D Histech, incluidos los módulos Pattern Quant e Histo Quant), se cuantificaron las áreas teñidas de colágeno. Brevemente, se utilizó Pattern Quant para detectar el tejido y medir su superficie. A continuación, se utilizó Histo Quant para detectar el contenido de colágeno teñido y medir su superficie, basándose en un método de umbral de color. Después, el área de fibrosis se expresó como el porcentaje de la superficie de colágeno con respecto al tejido total por animal.

Medición del contenido de colágeno hepático

El contenido de colágeno hepático se determinó utilizando el kit QuickZyme apropiado (Ensayo de colágeno total, Núm. de cat. QZB-totcol2). El ensayo se basa en la detección de hidroxiprolina, que es un aminoácido no proteinógeno que se encuentra principalmente en la triple hélice del colágeno. Así, la hidroxiprolina en productos hidrolizados tisulares se puede utilizar como medida directa de la cantidad de colágeno presente en el tejido (sin discriminación entre procolágeno, colágeno maduro y productos de degradación del colágeno).

Se requiere la hidrólisis completa de muestras de tejido en HCl 6 M a 95°C antes de dosificar la hidroxiprolina. El ensayo da como resultado la generación de un cromógeno con una absorbancia máxima a 570 nm. Los resultados se expresan en mg de colágeno/g de hígado.

Análisis de expresión de genes hepáticos

El ARN total se aisló de hígados de rata utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se transcribió de forma inversa a ADNc utilizando M-MLV RT (Transcriptasa Inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney) (Invitrogen Núm. de cat. 28025) en 1x tampón RT (Invitrogen), DTT 0,5 mM (Invitrogen), dNTP 0,18 mM (Promega), 200 ng de pdN6 (Amersham) y 30U de inhibidor de ARNasa (Promega).

A continuación, se llevó a cabo la PCR cuantitativa utilizando el Sistema de Detección por PCR en Tiempo Real CFX96 Touch™ (Biorad). Brevemente, las reacciones de PCR se realizaron en formato 96-WP en 25 gl de volumen total que contenía 1 gl de reacción de transcripción inversa, 0,5 gl de cebadores directos e inversos (10 pmoles cada uno) y 12,5 gl de 2X iQ SYBR Green Supermix (BioRad), utilizando las siguientes secuencias de cebadores:

Los niveles de expresión se normalizaron utilizando la expresión del gen Rplp0 como referencia en las muestras.

Para cada gen, las curvas patrón se dibujaron seleccionando los mejores puntos (al menos tres puntos) para tener una eficiencia de la reacción de PCR cercana a 100% y un coeficiente de correlación cercano a 1. Los niveles de expresión se determinaron utilizando la ecuación de la curva patrón tanto para el gen de constitutivo como para el gen diana (teniendo en cuenta la eficiencia de PCR específica de cada gen diana).

Evaluación de la combinación de Elafibranor y otro agonista de FXR en un modelo in vitro de fibrogénesis hepática

Cultivo de hHSC

Se cultivaron células estrelladas hepáticas primarias humanas (hHSC) (Innoprot) en medio STeCM (ScienCell Núm. de cat. 5301) complementado con suero fetal bovino al 2% (FBS, ScienCell Núm. de cat. 0010), penicilina/estreptomicina al 1% (ScienCell Núm. de cat. 0503) y suplemento de crecimiento de células estrelladas (SteCGS; ScienCell Núm. de cat. 5352). Los matraces de cultivo celular se recubrieron con Poly-L Lysine (Sigma Núm. de cat. P4707) para una mejor adherencia.

Preparación de composiciones: matriz de combinación de 2 componentes (agonista de FXR/Elafibranor)

El agonista de FXR INT-767 (Núm. CAS 1000403-03-1, Núm. de Cat. HY-12434, Núm. de lote 19249) se obtuvo comercialmente de Haoyuan Chemexpress. Para estos experimentos, se generó una matriz en damero. Se disolvieron INT-767 y Elafibranor en dimetilsulfóxido (DMSO, Fluka Núm. de cat. 41640) y se diluyeron en serie en una serie de 5 puntos en una fila (Elafibranor) y una serie de 11 puntos en una columna (INT-767) de una placa de 384 pocillos. Posteriormente, se generó la matriz de combinación 5X11 mezclando 1:1 todas las concentraciones de agente único. Las concentraciones de prueba para cada compuesto se eligieron basándose en la bibliografía (Rizzo et al.; McMahan et al.).

Activación de hHSC con TGF-p1 y tratamiento los compuestos

Las hHSC se sembraron a una densidad de 6,5 x 103 células/pocillo en placas de 384 pocillos. Al día siguiente, se eliminó el medio de cultivo celular y las células se lavaron con PBS (Invitrogen Núm. de cat. 14190). Las hHSC se mantuvieron durante 24 horas en un medio sin suero y sin SteCGS. Para los tratamientos con INT-767 y Elafibranor y sus combinaciones por pares, las hHSC privadas de suero se preincubaron durante 1 hora con los compuestos seguido de la adición de los estímulos profibrogénicos de TGF-p1 (PeproTech Núm. de cat. 100-21, 1 ng/ml) en medio sin suero y sin SteCGS durante un período adicional de 48 horas.

ELISA para a-SMA

El nivel de a-SMA se midió utilizando un ELISA Sándwich. Brevemente, primero se recubrieron los pocillos de una placa de ELISA con el anticuerpo de captura (anti-ACTA2 monoclonal de ratón, Abnova) a 4°C durante la noche. Después de 3 lavados en PBS Tween 20 al 0,2%, se añadió una solución de bloqueo que consistía en PBS BSA al 0,2% durante una hora seguido de otro ciclo de lavado. Los productos lisados celulares se transfirieron a los pocillos para su unión al anticuerpo de captura durante un período de 2 h a temperatura ambiente. Después del procedimiento de lavado, se añadió el anticuerpo de detección (anti-ACTA2 monoclonal de ratón biotinilado, Abnova) durante 2 horas a temperatura ambiente seguido de 3 lavados. Para la detección, primero se aplicó Estreptavidina conjugada con HRP (R&D Systems Núm. de cat. DY998) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió el sustrato de HRP TMB (BD#555214) y se incubó durante 7 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras la oxidación, el TMB forma un producto de reacción de color azul soluble en agua que se vuelve amarillo con la adición de ácido sulfúrico (parada de la solución), lo que permite una medición precisa de la intensidad a 450 nm utilizando un espectrofotómetro. El color desarrollado es directamente proporcional a la cantidad de a-SMA presente en el producto lisado.

Determinación de la sinergia mediante el método del Exceso Sobre Bliss (EOB)

Los valores obtenidos en los ensayos ELISA de aSMA se transformaron primero en porcentajes de inhibición sobre el control de TGF-p1. A continuación, utilizando estos porcentajes de inhibición, se determinó EOB (Exceso Sobre Bliss) para definir los efectos sinérgicos de las combinaciones de fármacos. La puntuación esperada de aditivismo de Bliss (E) se determinó en primer lugar mediante la ecuación: E = (A B) - (A x B) donde A y B son el porcentaje de inhibición de Elafibranor (A) e INT-767 (B) a una dosis determinada. La diferencia entre la expectativa de Bliss y la inhibición observada de la combinación INT-767/Elafibranor a la misma dosis es la puntuación de "Exceso sobre Bliss".

- Una puntuación de exceso sobre de Bliss = 0 indica que el tratamiento combinado es aditivo (como se esperaba para los efectos de las vías independientes);

- Una puntuación de exceso sobre Bliss > 0 indica una actividad mayor que la aditiva (sinergia);

- Una puntuación de exceso sobre Bliss < 0 indica que la combinación es menos que aditiva (antagonismo).

Para las combinaciones de INT-767/Elafibranor, se calculó una puntuación Bliss total adicional sumando todos los EOB.

Para validar la sinergia, se trazaron los valores experimentales correspondientes a la puntuación EOB máxima para la combinación de agonistas de FXR/Elafibranor en un gráfico de barras.

La importancia de las diferencias observadas entre INT-767/Elafibranor respecto al agente único más alto se determinó mediante una prueba t de Student. * :p<0,05; **:p<0,01; ***:p<0,001.

Resultados y discusión

Evaluación de Elafibranor, OCA y la combinación de Elafibranor OCA en un modelo crónico de CDAA colesterol al 1% (12 semanas)

Los resultados se presentan en la siguiente tabla y en las figuras 1-3.

El estilo de vida occidental está invariablemente relacionado con una alta tasa de incidencia de esteatohepatitis no alcohólica (NASH), una enfermedad hepática crónica que a menudo progresa a fibrosis y cirrosis hepáticas y, en última instancia, puede conducir a un carcinoma hepatocelular. Actualmente, no existe ninguna terapia aprobada para NASH. Las combinaciones de fármacos dirigidas simultáneamente a múltiples dianas terapéuticas tienen el potencial de mejorar drásticamente la respuesta a los fármacos y beneficiar a la población de pacientes más amplia. Las combinaciones de fármacos se probaron previamente en otras enfermedades sistémicas, tales como hipertensión, dislipidemia o diabetes tipo 2 y mostraron un mejor control de las enfermedades subyacentes y una disminución de la morbilidad y la mortalidad. En estudios recientes de fase 2B, tanto elafibranor (agonista de PPARa/5) como OCA (agonista de FXR) han demostrado eficacia en los criterios de valoración de NASH y fibrosis. Los autores de la presente invención quisieron comparar su acción sobre los resultados patológicos relevantes de NASH y buscar beneficios terapéuticos de la combinación.

Para lograr este objetivo, se indujo la fibrosación de NASH alimentando ratas Wistar con una dieta definida con L-aminoácidos deficiente en colina y complementada con colesterol (dieta CDAA/col). Los animales en los grupos de intervención recibieron Elafibranor u OCA o ambos compuestos durante todo el período del estudio. El desarrollo de NASH y fibrosis se evaluaron mediante histología. También se realizaron análisis bioquímicos y moleculares adicionales en diferentes biomarcadores relevantes.

Las ratas Wistar alimentadas con la dieta CDAA/col desarrollaron histología relacionada con NASH y fibrosis con alta penetración de enfermedad grave. Estuvieron presentes esteatosis avanzada, inflamación lobulillar y abombamiento en todos los animales y la puntuación NAS [min 0 - max 8] varió entre 6 y 8. La histología hepática (área positiva de picrosirius) y la bioquímica (concentración de colágeno hepático) mostraron como promedio un aumento de cuatro veces en el contenido de fibrosis hepática y la puntuación de fibrosis fue 3 o 4 para todos los animales con la dieta con CDAA/col que no recibieron tratamiento farmacológico (Figuras 1-2). La expresión de genes relacionados con la inflamación, la remodelación de tejidos y la fibrosis aumentó y fue compatible con las firmas genéticas que se notificaron previamente en pacientes con NASH con enfermedad grave (Figura 3).

La administración de Elafibranor solo atenuó el desarrollo de fibrosis, mientras que la administración de OCA solo no atenuó la fibrosis de manera significativa (Figuras 1 -2). Los tratamientos combinados fueron más potentes para reducir la fibrosis, lo que permitió reducir las dosis, con una eficacia similar sobre la fibrosis lograda con 1 y 3 mg/kg de GFT505 combinado con 10 mg/kg de OCA (Figuras 1-2). La administración de cualquiera de los fármacos candidatos solo atenuó de manera parcial únicamente el aumento de la remodelación del tejido, mientras que la combinación de ambos compuestos fue más eficiente en comparación con cualquier agente único (Figura 3).

Por lo tanto, en el presente documento se demuestra que la acción sinérgica de Elafibranor y OCA sobre la fibrosis hepática en el modelo de NASH inducida por dieta con CDAA/col produjo un beneficio terapéutico comparable a dosis significativamente más bajas de ambos fármacos candidatos, en comparación con cualquier agente único. A partir de este estudio, se espera de manera creíble que las dosis de ambos fármacos candidatos puedan reducirse en un factor de al menos 1,5, 2, 2,5 o incluso al menos 3 para obtener resultados similares a la dosis inicial de cada compuesto utilizado individualmente. Además, Elafibranor mostró un claro efecto protector sobre el daño hepático. Los efectos del OCA sobre el abombamiento y la inflamación lobulillar fueron bastante modestos en este modelo. De este estudio, se puede concluir que la combinación Elafibranor/OCA beneficiaría a una población de pacientes más amplia y la reducción de la dosis terapéutica asociada disminuiría la incidencia de efectos adversos del fármaco.

Evaluación de la combinación de Elafibranor y otro agonista de FXR en un modelo in vitro de fibrogénesis hepática

Los resultados se presentan en las figuras 4-5.

La persistencia anormal de miofibroblastos diferenciados es una característica de muchas enfermedades fibróticas. Después de una lesión hepática, las HSC quiescentes se someten a un proceso de activación que se caracteriza por una diferenciación a miofibroblastos positivos para (a-SMA).

El agonista de PPAR Elafibranor revela una actividad antifibrótica en hHSC activadas con la citocina profibrogénica TGFpl. El marcador a-SMA se redujo hasta en 68% con la dosis más alta de Elafibranor probada (5 pM) (Fig.4A). INT-767 solo inhibió únicamente apenas la producción de a-SMA en 13% con la dosis más alta probada (30 pM) (Fig. 4B). Para evaluar si una combinación de Elafibranor con INT-767 podría reducir la fibrosis de forma sinérgica, se realizaron experimentos con matrices combinadas en HSC inducidas por TGFp. Brevemente, las soluciones de INT-767 y Elafibranor se diluyeron en serie en un formato de damero generando una matriz de 55 combinaciones que cubría un gran panel de razones de INT-767/Elafibranor. La sinergia se determinó primero calculando las puntuaciones de Exceso Sobre Bliss. Estos experimentos revelaron que Elafibranor podría tener sinergia con INT-767 para reducir la producción de a-SMA en HSC activadas (Fig. 5). Uno de los mejores ejemplos de sinergia se muestra en la Fig. 5C con Elafibranor 2,5 pM e INT-767 1,9 pM. Aunque INT-767 1,9 pM solo no muestra ninguna actividad antifibrótica, su adición a Elafibranor 2,5 pM aumentó sinérgicamente la actividad de Elafibranor y alcanzó hasta 69% de inhibición (en comparación con 26% con Elafibranor 2,5 pM solo). En conclusión, la acción sinérgica de Elafibranor y diferentes clases de agonistas de FXR sobre la fibrogénesis muestra el beneficio potencial de tales combinaciones en múltiples tipos de enfermedades fibróticas.

Referencias

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un producto combinado que comprende:

(i) Elafibranor (ELA) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

(ii) un agonista de FXR, en donde el agonista de FXR es Ácido obeticólico (OCA) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o INT-767 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El producto combinado según la reivindicación 1, en donde el agonista de FXR es Ácido obeticólico (OCA) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. El producto combinado según la reivindicación 1, en donde el agonista de FXR es INT-767 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

4. El producto combinado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el producto combinado es una composición que comprende (i) y (ii) y un portador farmacéuticamente aceptable.

5. El producto combinado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el producto combinado es un kit de partes que comprende (i) y (ii).

6. El producto combinado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde (i) y (ii) están en una cantidad eficaz sinérgica para el tratamiento de una enfermedad.

7. El producto combinado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en un método para el tratamiento de una enfermedad inmunitaria, inflamatoria, metabólica, fibrótica o colestásica.

8. El producto combinado para uso según la reivindicación 7, en donde la enfermedad es NAFLD, NASH, fibrosis hepática, cirrosis hepática, PBC o PSC.

9. El producto combinado para uso según la reivindicación 7 u 8, en donde:

- ELA se administra a una dosis comprendida entre 5 y 80 mg/día y OCA se administra a una dosis comprendida entre 7 y 17 mg/día;

- ELA se administra a una dosis comprendida entre 40 y 60 mg/día y OCA se administra a una dosis comprendida entre 5 y 12,5 mg/día;

- ELA se administra a una dosis comprendida entre 32 y 48 mg/día y OCA se administra a una dosis comprendida entre 4 y 10 mg/día;

- ELA se administra a una dosis comprendida entre 27 y 40 mg/día y OCA se administra a una dosis comprendida entre 3 y 8 mg/día;

- ELA se administra a una dosis comprendida entre 16 y 24 mg/día y OCA se administra a una dosis comprendida entre 2 y 5 mg/día; o

- ELA se administra a una dosis comprendida entre 8 y 12 mg/día y OCA se administra a una dosis comprendida entre 1 y 2,5 mg/día.