CN107635566A - 治疗hbv感染的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用于治疗肝炎感染的方法。

Description

治疗HBV感染的组合物和方法
相关申请
本申请主张2016年1月15日提交的美国临时申请号62/279,382、2015年9月18日提交的美国临时申请号62/220,406及2015年4月7日提交的美国临时申请号62/144,300的优先权。每个前述申请的全部公开内容通过引用并入本发明。
关于联邦政府资助的发展研究的声明
本发明是在政府支持下在由美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的授权号R01AI094469下进行。政府在本发明中具有某些权利。
发明领域
本发明是关于适用于治疗病毒感染或感染的组合物及方法。
发明背景
乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染为主要公共卫生问题，且由于HBV相关肝病，例如肝硬化及肝细胞癌(HCC)而在全世界每年造成大约120万人的死亡(Levanchy,D.J ViralHepatol(2004)11：97-107)。据估计，超过20亿人具有曾感染或正在感染HBV的血清学证据，且超过3.5亿人为慢性HBV携带者(Levanchy,D.J Viral Hepatol(2004)11：97-107；KwonH.,Lok.A.S.Nat Rev Gastroenterol Hepatol(2011)8：275-284)。虽然存在针对HBV的安全且有效的预防疫苗，但仍迫切需要改善用于治疗慢性HBV感染的治疗剂。目前对慢性乙型肝炎(CHB)的抗病毒治疗为有限的，且包括核苷和核苷酸类似物和干扰素(IFN)治疗。虽然给药核苷及核苷酸可降低病毒载量且提高对CHB的长期效果，但长期使用很少导致治愈。每年仅2-3％经治疗患者经历可测量的HBV感染的生物标记物的丧失(即HBV表面抗原(HBsAg)的持续丧失)和向抗HBsAg抗体(抗HBs)的血清转化(Kwon H.,Lok.A.S.Nat RevGastroenterol Hepatol(2011)8：275-284)。长期IFN给药也与治疗响应中的治疗限制性副作用和变异性相关，虽然持久的HBsAg损失速率高于核苷和核苷酸类似物，但其仍仅发生于少于10％的患者中。
此外，治疗慢性HBV感染的主要障碍涉及在延长使用目前可用的核苷和核苷酸类似物之后出现了耐药性变异体，许多耐药性变异体靶向病毒性DNA聚合酶。另外，目前治疗需要持续及长期使用，这通常导致不必要的副作用及治疗停止后的复发风险。因此，迫切需要对抗慢性HBV感染的新一代疗法。
发明概述
在一个方面中，本发明的特征在于治疗感染有乙型肝炎病毒的受试者的方法，该方法包括向受试者给药包含剂量为约0.5mg/kg至约100mg/kg的式(I)化合物的药物组合物，从而治疗受试者，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐。在一些实施方案中，式(I)的前药为式(II)化合物，其中该化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，该组合物包含式(I)化合物的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ib)和式(Ic)的混合物。在一些实施方案中，该混合物包含约1:1比率的式(Ib)和式(Ic)化合物(例如，外消旋混合物)。在一些实施方案中，该混合物包含式(Ib)和式(Ic)化合物的比率为约51:49、约52:48、约53:47、约54:46、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5或约99:1。在一些实施方案中，该混合物包含式(Ic)与式(Ib)化合物的比率为约51:49、约52:48、约53:47、约54:46、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5或约99:1。
在一些实施方案中，该组合物包含式(Ib)化合物且包含小于约5％的式(Ic)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ic)化合物，或基本上不含式(Ic)化合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ic)化合物且包含小于约5％的式(Ib)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ib)化合物，或基本上不含式(Ib)化合物。
在一些实施方案中，该组合物包含式(II)化合物的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIb)与式(IIc)的混合物。在一些实施方案中，该混合物包含约1:1比率的式(IIb)与式(IIc)化合物(例如，外消旋混合物)。在一些实施方案中，该混合物包含约51:49、约52:48、约53:47、约54:46、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5或约99:1比率的式(IIb)与式(IIc)化合物。在一些实施方案中，该混合物包含约51:49、约52:48、约53:47、约54:46、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5或约99:1比率的式(IIc)与式(IIb)化合物。
在一些实施方案中，该组合物包含式(IIb)化合物且包含小于约5％的式(IIc)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIc)化合物，或基本上不含式(IIc)化合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIc)化合物且包含小于约5％的式(IIb)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIb)化合物，或基本上不含式(IIb)化合物。
在一些实施方案中，该组合物是经口给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是经口给药。在一些实施方案中，式(II)化合物是经口给药。在一些实施方案中，该组合物是肠胃外(例如，腹膜内)给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是肠胃外(例如，腹膜内)给药。在一些实施方案中，式(II)化合物是肠胃外(例如，腹膜内)给药。
在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，受试者为非人类动物，例如土拔鼠(例如，东方土拔鼠)。
在一些实施方案中，该方法包括每日给药该剂量。在一些实施方案中，给药为每日一次。在一些实施方案中，给药为每日多于一次，例如每日两次、每日三次、每日四次。
在一些实施方案中，该方法包括以少于一日一次的频率，例如每36小时一次、每隔一天一次或一周一次给药该剂量。
在一些实施方案中，该剂量包含约0.5mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，该剂量包含约0.5mg/kg至约95mg/kg、约90mg/kg、约85mg/kg、约80mg/kg、约75mg/kg、约70mg/kg、约65mg/kg、约60mg/kg、约55mg/kg、约50mg/kg、约45mg/kg、约40mg/kg、约35mg/kg、约30mg/kg、约25mg/kg、约20mg/kg、约15mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方案中，该剂量包含约0.5mg/kg至约50mg/kg。在一些实施方案中，该剂量包含约0.5mg/kg至约40mg/kg。
在一些实施方案中，该剂量包含大于约0.5mg/kg，例如约1.0mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg或约90mg/kg直至约100mg/kg。在一些实施方案中，该剂量包含约5mg/kg至约50mg/kg。在一些实施方案中，该剂量包含约10mg/kg至约50mg/kg。在一些实施方案中，该剂量包含约15mg/kg至约50mg/kg。
在一些实施方案中，该剂量包含液体或固体剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸(dragée)或散剂。在一些实施方案中，液体或固体剂型是经口给药。在一些实施方案中，液体或固体形式是肠胃外(例如，腹膜内)给药。
在一些实施方案中，该方法进一步包括给药额外药剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括给药治疗有效量的额外药剂。在一些实施方案中，额外药剂为抗病毒剂或抗癌剂。在一些实施方案中，抗病毒剂包括干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂或非干扰素免疫增强剂。在一些实施方案中，干扰素包含干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素(interferon alfacon-1)或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，该核苷类似物包含拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦(tenofovir)、替诺福韦二匹伏酯(tenofovirdipivoxil)、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦(besifovir)或AGX-1009。在一些实施方案中，抗病毒剂为恩替卡韦。在一些实施方案中，抗病毒化合物包括NOV-225、BAM 205、MyrcludexB、ARC-520、BAY41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，非干扰素免疫增强剂包括日达仙(zadaxin)(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。在一些实施方案中，抗病毒剂为衣壳蛋白抑制剂、进入抑制剂、分泌抑制剂、微RNA、反义RNA剂、RNAi剂或被设计成抑制病毒RNA的其他药剂。在一些实施方案中，抗癌剂选自氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、多柔比星、长春新碱、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、依托泊甙(toposide)、顺铂、表柔比星和甲苯磺酸索拉非尼。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者是初治患者。在一些实施方案中，受试者先前已针对HBV感染进行治疗。在一些实施方案中，对HBV感染的先前治疗已失败。在一些实施方案中，受试者已复发。
在一些实施方案中，受试者先前已用除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂(例如，干扰素、病毒唑)治疗，且患有复发性HBV感染。
在一些实施方案中，受试者患有与丁型肝炎病毒(HDV)共感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HDV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV与HDV共感染。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已诊断出患有肝硬化。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌，且等待肝移植。在一些实施方案中，受试者不具有肝硬化或尚未诊断出患有肝细胞癌。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已进一步诊断出患有HIV感染。在一些实施方案中，HIV感染的病毒株为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HIV-1或HIV-2(例如，病毒株1或病毒株2)。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括直至治疗结束时至少一周一次分析受试者的体重和体温或接受对受试者的体重和体温的分析。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括在治疗结束之前至少一次的分析受试者血液样本或接受对受试者血液样本的分析。在一些实施方案中，分析血液样本的病毒载量及表面抗原含量。在一些实施方案中，分析血液样本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。在一些实施方案中，分析血液样本的抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括在治疗结束之前至少一次的分析受试者肝活检标本或接受对受试者肝活检标本的分析。在一些实施方案中，分析肝活检标本的病毒DNA、病毒RNA、病毒抗原及cccDNA的含量。在一些实施方案中，分析肝活检标本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。在一些实施方案中，分析肝活检标本的抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。在一些实施方案中，分析肝活检标本的肝脏炎症、坏死、脂肪变性或纤维化的减少。
在另一方面中，本发明的特征在于治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，该方法包括向受试者给药式(I)化合物与恩替卡韦或其药学上可接受的盐的组合，从而治疗受试者，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐。
在另一方面中，本发明的特征在于治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，其包括向受试者给药恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程，其中该受试者先前已用式(I)化合物的疗程治疗，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
在另一方面中，本发明的特征在于治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，其中该受试者先前已用恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程治疗，该方法包括向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
在另一方面中，本发明的特征在于治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，该方法包括首先向受试者给药恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程，且随后向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
在另一方面中，本发明的特征在于治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，该方法包括首先向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，且随后向受试者给药恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程，从而治疗受试者。
在前述本发明方面中的任一者中，式(I)的前药为式(II)化合物，其中该化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的疗程为约1天至约24周。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物在整个疗程中至少每周(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次、一周七次)给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物在整个疗程中被每日给药。
在一些实施方案中，恩替卡韦的疗程为约1天至约12周。在一些实施方案中，恩替卡韦在整个疗程中至少每周(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次、一周七次)给药。在一些实施方案中，恩替卡韦在整个疗程中每日给药。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约5mg/kg至约100mg/kg(例如，约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg或约100mg/kg)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg/kg至约50mg/kg(例如，约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg)。
在一些实施方案中，恩替卡韦的剂量为约0.1mg至约5mg(例如，约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约1.25mg、约1.5mg、约1.75mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg或约5mg)。在一些实施方案中，恩替卡韦的剂量为约0.01mg/kg至约10mg/kg(例如，约0.01mg/kg、约0.025mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)。在一些实施方案中，恩替卡韦的剂量为约0.1mg/kg至约5mg/kg(例如，约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.25mg/kg、约1.5mg/kg、约1.75mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg或约5mg/kg)。
在一些实施方案中，该剂量包括液体或固体剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸或散剂。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物或恩替卡韦经口给药(例如，式(I)或式(II)化合物是经口给药，或恩替卡韦是经口给药，或式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦均经口给药)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物或恩替卡韦是肠胃外给药(例如，式(II)化合物是肠胃外给药)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是肠胃外给药，且恩替卡韦是经口给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物与恩替卡韦配制为固定剂量复合剂(例如，配制为液体剂型或固体剂型，例如胶囊或片剂)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物与恩替卡韦配制为固定剂量复合剂(例如，配制为液体剂型或固体剂型，例如胶囊或片剂)用以经口给药。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦的给药具有协同或累加效应。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦的给药具有累加效应。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦的给药具有协同效应。
在一些实施方案中，该组合物包含式(I)化合物(例如，式(Ib)和式(Ic)化合物)的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ib)化合物，且包含小于约5％的式(Ic)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ic)化合物)，或基本上不含式(Ic)化合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ic)化合物，且包含小于约5％的式(Ib)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ib)化合物，或基本上不含式(Ib)化合物)。
在一些实施方案中，该组合物包含式(II)化合物(例如，式(IIb)和式(IIc)化合物)的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIb)化合物，且包含小于约5％的式(IIc)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIc)化合物，或基本上不含式(IIc)化合物)。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIc)化合物，且包含小于约5％的式(IIb)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIb)化合物，或基本上不含式(IIb)化合物)。
在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，受试者为非人类动物，例如土拔鼠(例如，东方土拔鼠)。
在一些实施方案中，该方法进一步包括给药治疗有效量的额外药剂。在一些实施方案中，额外药剂为抗病毒剂或抗癌剂。在一些实施方案中，抗病毒剂包括干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂或非干扰素免疫增强剂。在一些实施方案中，干扰素包含干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，核苷类似物包含拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦、替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦或AGX-1009。在一些实施方案中，抗病毒剂为替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺)。在一些实施方案中，抗病毒剂包括NOV-225、BAM 205、Myrcludex B、ARC-520、BAY 41-4109、REP9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，非干扰素免疫增强剂包含日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。在一些实施方案中，抗病毒剂为衣壳蛋白抑制剂、进入抑制剂、分泌抑制剂、微RNA、反义RNA剂、RNAi剂或被设计成抑制病毒RNA的其他药剂。在一些实施方案中，抗癌剂选自氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、多柔比星、长春新碱、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、依托泊甙、顺铂、表柔比星和甲苯磺酸索拉非尼。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者是初治患者。在一些实施方案中，受试者先前已针对HBV感染进行治疗。在一些实施方案中，对HBV感染的先前治疗已失败。在一些实施方案中，受试者已复发。
在一些实施方案中，受试者先前已用除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂(例如，干扰素、病毒唑)治疗，且患有复发性HBV感染。
在一些实施方案中，受试者患有与丁型肝炎病毒(HDV)共感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HDV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV与HDV共感染。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已诊断出患有肝硬化。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌，且等待肝移植。在一些实施方案中，受试者不具有肝硬化或尚未诊断出患有肝细胞癌。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已进一步诊断出患有HIV感染。在一些实施方案中，HIV感染的病毒株为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HIV-1或HIV-2(例如，病毒株1或病毒株2)。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括直至治疗结束时至少一周一次分析受试者的体重和体温或接受对受试者的体重和体温的分析。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括在治疗结束之前至少一次的分析受试者血液样本或接受对受试者血液样本的分析。在一些实施方案中，分析血液样本的病毒载量及表面抗原含量。在一些实施方案中，分析血液样本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。在一些实施方案中，分析血液样本的抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括在治疗结束之前至少一次的分析受试者肝活检标本或接受对受试者肝活检标本的分析。在一些实施方案中，分析肝活检标本的病毒DNA、病毒RNA、病毒抗原及cccDNA的含量。在一些实施方案中，分析肝活检标本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。在一些实施方案中，分析肝活检标本的抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。在一些实施方案中，分析肝活检标本的肝炎症、坏死、脂肪变性或纤维化的减少。
在任何及所有具体实施方案中，该方法的特征在于一种适用于治疗受试者中乙型肝炎病毒的药物组合物，该组合物包含式(I)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)、式(II)化合物(例如，式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)或其药学上可接受的盐与恩替卡韦的组合，从而治疗受试者。
另一方面，本发明的特征在于在受试者中治疗乙型肝炎病毒的方法，所述方法包括向受试者给药式(I)化合物，其中所述化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐与替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的组合或其药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
另一方面，本发明的特征在于一种治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，该方法包括向受试者给药替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)或其药学上可接受的盐的疗程，其中该受试者先前已用式(I)化合物的疗程治疗，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
另一方面，本发明的特征在于一种治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，其中该受试者先前已用替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)或其药学上可接受的盐的疗程治疗，该方法包括向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
另一方面，本发明的特征在于一种治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，该方法包括首先向受试者给药替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)或其药学上可接受的盐的疗程，且随后向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
另一方面，本发明的特征在于一种治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，该方法包括首先向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，且随后向受试者给药替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)或其药学上可接受的盐的疗程，从而治疗受试者。
在本发明的任何上述方面中，式(I)的前药是式(II)化合物，其中该化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的疗程为约1天至约24周。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物在整个疗程中至少每周(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次、一周七次)给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物在整个疗程中每日给药。
在一些实施方案中，替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的疗程为约1天至约12周。在一些实施方案中，替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)在整个疗程中至少每周(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次、一周七次)给药。在一些实施方案中，替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)在整个疗程中每日给药。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约5mg/kg至约100mg/kg(例如，约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg或约100mg/kg)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg/kg至约50mg/kg(例如，约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg)。
在一些实施方案中，替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的剂量为约10mg至约500mg(例如约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg或约300mg)。在一些实施方案中，替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的剂量为约0.01mg/kg至约20mg/kg(例如约0.01mg/kg、约0.025mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约7.5mg/kg、约10mg/kg、约12.5mg/kg、约15mg/kg、约17.5mg/kg或约20mg/kg)。在一些实施方案中，替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的剂量为约1mg/kg至约20mg/kg(例如约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约12.5mg/kg、约15mg/kg、约17.5mg/kg或约20mg/kg)。
在一些实施方案中，该剂量包括液体或固体剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸或散剂。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物或替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)经口给药(例如，式(I)或式(II)化合物是经口给药，或替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)是经口给药，或式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦均经口给药)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物或替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)是肠胃外给药(例如，式(II)化合物是肠胃外给药)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是肠胃外给药，且替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)是经口给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物与替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)一起配制为固定剂量复合剂，例如配制为液体剂型或固体剂型(例如胶囊或片剂)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物与替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)配制为固定剂量复合剂，例如调配为液体剂型或固体剂型(例如胶囊或片剂)用以经口给药。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的给药具有协同或累加效应。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的给药具有累加效应。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的给药具有协同效应。
在一些实施方案中，该组合物包含式(I)化合物(例如，式(Ib)和式(Ic)化合物)的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ib)化合物，且包含小于约5％的式(Ic)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ic)化合物)，或基本上不含式(Ic)化合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ic)化合物，且包含小于约5％的式(Ib)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ib)化合物，或基本上不含式(Ib)化合物)。
在一些实施方案中，该组合物包含式(II)化合物(例如，式(IIb)和式(IIc)化合物)的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIb)化合物，且包含小于约5％的式(IIc)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIc)化合物，或基本上不含式(IIc)化合物)。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIc)化合物，且包含小于约5％的式(IIb)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIb)化合物，或基本上不含式(IIb)化合物)。
在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，受试者为非人类动物，例如土拔鼠(例如，东方土拔鼠)。
在一些实施方案中，该方法进一步包括给药治疗有效量的额外药剂。在一些实施方案中，额外药剂为抗病毒剂或抗癌剂。在一些实施方案中，抗病毒剂包括干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂或非干扰素免疫增强剂。在一些实施方案中，干扰素包含干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，核苷类似物包含拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、恩替卡韦、拜斯福韦或AGX-1009。在一些实施方案中，抗病毒剂为恩替卡韦。在一些实施方案中，抗病毒化合物包含NOV-225、BAM 205、Myrcludex B、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，非干扰素免疫增强剂包含日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。在一些实施方案中，抗病毒剂为衣壳蛋白抑制剂、进入抑制剂、分泌抑制剂、微RNA、反义RNA剂、RNAi剂或被设计成抑制病毒RNA的其他药剂。在一些实施方案中，抗癌剂选自氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、多柔比星、长春新碱、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、依托泊甙、顺铂、表柔比星和甲苯磺酸索拉非尼。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者是初治患者。在一些实施方案中，受试者先前已针对HBV感染进行治疗。在一些实施方案中，针对HBV感染的先前治疗已失败。在一些实施方案中，受试者已复发。
在一些实施方案中，受试者先前已用除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂(例如，干扰素、病毒唑)治疗，且患有复发性HBV感染。
在一些实施方案中，受试者患有与丁型肝炎病毒(HDV)的共感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HDV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV与HDV共感染。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已诊断出患有肝硬化。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌，且等待肝移植。在一些实施方案中，受试者不具有肝硬化或尚未诊断出患有肝细胞癌。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已进一步诊断出患有HIV感染。在一些实施方案中，HIV感染的病毒株为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HIV-1或HIV-2(例如，病毒株1或病毒株2)。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括直至治疗结束时至少一周一次分析受试者的体重和体温或接受对受试者的体重和体温的分析。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括在治疗结束之前至少一次分析受试者血液样本或接受对受试者血液样本的分析。在一些实施方案中，分析血液样本的病毒载量及表面抗原含量。在一些实施方案中，分析血液样本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。在一些实施方案中，分析血液样本的抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括在治疗结束之前至少一次分析受试者肝活检标本或接受对受试者肝活检标本的分析。在一些实施方案中，分析肝活检标本的病毒DNA、病毒RNA、病毒抗原及cccDNA的含量。在一些实施方案中，分析肝活检标本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。在一些实施方案中，分析肝活检标本的抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。在一些实施方案中，分析肝活检标本的肝脏炎症、坏死、脂肪变性或纤维化的减少。
在任何及所有实施方案中，该方法的特征在于一种用于治疗受试者中乙型肝炎病毒的药物组合物，该组合物包含式(I)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)、式(II)化合物(例如，式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)或其药学上可接受的盐与替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的组合，从而治疗受试者。
在另一方面中，本发明的特征在于一种治疗感染有乙型肝炎病毒(HBV)的耐药性菌株的受试者的方法，该方法包括向受试者给药式(I)化合物，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者，且其中在给药除式(I)化合物以外的抗HBV剂之后，受试者中HBV生物标记物的含量没有显著降低。在一些实施方案中，式(I)的前药为式(II)化合物，其中该化合物选自：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该方法包括向受试者给药式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该方法包括向受试者给药式(II)化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，HBV生物标记物包括病毒载量、HBsAg含量、HBeAg含量或cccDNA含量。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量没有由暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而显著降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后降低了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后降低了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后降低了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后降低了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株对除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂具有抗性，且该抗HBV剂为干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂、免疫增强剂或直接作用的抗病毒剂。在一些实施方案中，干扰素包含干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，核苷类似物包含拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦或AGX-1009。在一些实施方案中，非核苷抗病毒剂包括NOV-225、BAM 205、Myrcludex B、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，免疫增强剂包含日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株为HBV变异株或HBV突变株。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株包含HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的变异体或突变形式。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包含HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列相比。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包含HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括位于100位氨基酸与200位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括在115、118、120、123、126、129、131、133、134、142、143、144、145或154位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括T115N、T118V、P120L、P120Q、T126S、Q129H、T131K、M133I、M133L、F134N、F134H、P142L、P142S、T143L、D144A、D144V、G145R或S154P突变。
在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括位于150位氨基酸与200位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括在161、172、173、175、176、193、194或196位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括F161H、F161L、W172L、W172*、L173F、L175F、L176V、L176*、S193L、V194F、V194S、I195M、W196L、W196S或W196*突变，例如与参考或共有序列相比，其中“*”表示终止密码子。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括位于60位氨基酸与275位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括在80、169、173、180、181、184、169、202、204、215、233、236或250位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括N169T、I169T、V173L、L180M、A181T、A181V、T184A、T184C、T184G、T184I、T184L、T184M、T184S、S202C、S202G、S202I、M204I、M204V、N236T、M250I或M250V突变。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括L180M、M204I、M204V或N236T突变。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(Ib)和式(Ic)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，该混合物包含约1：1比率的式(Ib)和式(Ic)化合物(例如，外消旋混合物)。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(Ib)和式(Ic)化合物。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(Ic)与式(Ib)化合物。
在一些实施方案中，本发明描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物的混合物，包括式(Ib)化合物和小于约5％的式(Ic)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ic)化合物。在一些实施方案中，本发明描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物，所述式(I)化合物基本上不含式(Ic)化合物，而含有式(Ib)化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物的混合物，所述式(I)化合物包括式(Ic)化合物和小于约5％的式(Ib)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ib)化合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物，所述式(I)化合物基本上不含式(Ib)化合物，而含有式(Ic)化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(IIb)和式(IIc)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，该混合物包含约1：1比率的式(IIb)和式(IIc)化合物(例如，外消旋混合物)。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(IIb)和式(IIc)化合物。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(IIc)与式(IIb)化合物。
在一些实施方案中，本发明描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物的混合物，包括式(IIb)化合物和小于约5％的式(IIc)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIc)化合物。在一些实施方案中，本发明描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物，所述式(II)化合物基本上不含式(IIc)化合物，而含有式(IIb)化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物的混合物，包括式(IIc)化合物和小于约5％的式(IIb)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIb)化合物。在一些实施方案中，本发明描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物，所述式(II)化合物基本上不含式(IIb)化合物，而含有式(IIc)化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于10μM(例如，式(II)化合物小于10μM)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于1μM(例如，式(II)化合物小于1μM)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于0.1μM(例如，式(II)化合物的IC50值小于0.1μM)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于0.01μM(例如，式(II)化合物的IC50值小于0.1μM)。
在一些实施方案中，在本发明所述的方法中，式(I)或式(II)化合物经口给药。在一些实施方案中，式(I)化合物经口给药。在一些实施方案中，式(II)化合物经口给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)的化合物经肠胃外给药。在一些实施方案中，式(I)化合物经肠胃外给药。在一些实施方案中，式(II)化合物经肠胃外给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物经静脉内给药。在一些实施方案中，式(I)化合物经静脉内给药。在一些实施方案中，式(II)化合物经静脉内给药。
在一些实施方案中，将式(I)或式(II)化合物配制为液体或固体剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂或微胶囊剂型。
在一些实施方案中，该化合物(例如式(I)或式(II)化合物)以约0.5mg/kg至约1000mg/kg的剂量给药。在一些实施方案中，该化合物(例如式(I)或式(II)化合物)以0.5mg/kg至约1000mg/kg、约900mg/kg、约800mg/kg、约700mg/kg、约600mg/kg、约500mg/kg、约400mg/kg、约300mg/kg、约250mg/kg、约200mg/kg、约150mg/kg、约100mg/kg、约75mg/kg、约50mg/kg、约25mg/kg、约10mg/kg、约5mg/kg、约2.5mg/kg或更低的剂量给药。在一些实施方案中，该化合物(例如式(I)或式(II)化合物)以约5mg/kg至约500mg/kg的剂量给药。在一些实施方案中，该化合物(例如式(I)或式(II)化合物)以约5mg/kg至约500mg/kg、450mg/kg、约400mg/kg、约350mg/kg、约300mg/kg、约250mg/kg、约200mg/kg、约150mg/kg、约100mg/kg、约75mg/kg、约50mg/kg、约25mg/kg、约10mg/kg或更低的剂量给药。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg至约1500mg、约1250mg、约1000mg、约900mg、约800mg、约700mg、约600mg、约500mg、约400mg、约300mg、约250mg、约200mg、约150mg、约100mg、约75mg、约50mg、约25mg或更低。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg、约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1250mg和约1500mg。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约50mg和约1000mg。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约200mg至约1000mg。
在一些实施方案中，在本发明所述的方法中，每天给药式(I)或式(II)化合物。在一些实施方案中，将式(I)或式(II)化合物每天给药一次。在一些实施方案中，将式(I)或式(II)化合物每天多次给药，例如每天两次、每天三次、每天四次。在一些实施方案中，将式(I)或式(II)化合物每隔一天、每2天、每3天、每4天或更多天给药一次。在一些实施方案中，将式(I)或式(II)化合物每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、或每周六次给药。
在一些实施方案中，在本发明所述的方法中，该方法的持续时间为一天。在一些实施方案中，该方法的持续时间大于1天，例如约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约2周、约3周、约4周、约1个月、约1.5个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月。在一些实施方案中，该方法的持续时间为约1天至约2周。在一些实施方案中，该方法的持续时间为6天至14天。在一些实施方案中，该方法的持续时间为一周。在一些实施方案中，该方法的持续时间一直持续到受试者的HBV感染被治愈(例如，直到受试者呈现不可检测的HBV RNA水平)为止。
在一些实施方案中，在本发明所述的方法中，式(I)或式(II)化合物被配制为药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV感染。在一些实施方案中，受试者诊断出患有慢性乙型肝炎(CHB)。在一些实施方案中，HBV感染的基因型为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型A(例如，HBV-A1-7)、HBV基因型B(例如，HBV-B2-5)、HBV基因型C(例如，HBV-C1-16)、HBV基因型D(例如，HBV-D1-7)、HBV基因型E、HBV基因型F(例如，HBV-F1-4)、HBV基因型G、HBV基因型H、HBV基因型I或HBV基因型J。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物具有泛基因型活性。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者是初治患者。在一些实施方案中，受试者先前已针对HBV感染进行治疗。在一些实施方案中，针对HBV感染的先前治疗已失败。在一些实施方案中，受试者已复发。
在一些实施方案中，受试者先前已用除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂(例如，干扰素、病毒唑)治疗，且患有复发性HBV感染。
在一些实施方案中，受试者患有与丁型肝炎病毒(HDV)的共感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HDV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV与HDV共感染。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已诊断出患有肝硬化。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌且等待肝移植。在一些实施方案中，受试者不具有肝硬化或尚未诊断出患有肝细胞癌。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已进一步诊断出患有HIV感染。在一些实施方案中，HIV感染的病毒株为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HIV-1或HIV-2(例如，病毒株1或病毒株2)。
在一些实施方案中，受试者先前已用除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂(例如，干扰素、病毒唑)治疗，且患有复发性HBV感染。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者进一步被给药额外药剂或治疗剂或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，额外药剂为干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂、非干扰素免疫增强剂或直接作用的抗病毒剂。在一些实施方案中，额外药剂为干扰素，例如聚乙二醇干扰素α(例如，聚乙二醇干扰素α-2a或聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，额外药剂为核苷类似物，例如拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)、拜斯福韦或AGX-1009。在一些实施方案中，非核苷抗病毒剂包括NOV-225、BAM 205、MyrcludexB、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，免疫增强剂包含日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。在一些实施方案中，额外药剂为恩替卡韦。
在任何及所有具体实施方案中，该方法的特征在于一种用于治疗受试者中乙型肝炎病毒的耐药性菌株的药物组合物，该组合物包含式(I)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)、式(II)化合物(例如，式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)或其药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
在另一方面中，本发明的特征在于一种治疗感染有乙型肝炎病毒(HBV)的耐药性菌株的受试者的方法，该方法包括向受试者给药式(I)化合物，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者，且其中耐药型乙型肝炎病毒株对除式(I)化合物以外的抗HBV剂具有抗性。在一些实施方案中，式(I)的前药为式(II)化合物，其中该化合物选自：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该方法包括向受试者给药式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该方法包括向受试者给药式(II)化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，受试者中的HBV生物标记物的含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，HBV生物标记物的含量没有由于暴露于除式(I)化合物以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，HBV生物标记物的含量没有由于暴露于除式(II)化合物以外的抗HBV剂而明显降低。
在一些实施方案中，HBV生物标记物包括病毒载量、HBsAg含量、HBeAg含量或cccDNA含量。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后降低了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后降低了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后降低了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后降低了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显减少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量由式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株对除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂具有抗性，且抗HBV剂为干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂、免疫增强剂或直接作用的抗病毒剂。在一些实施方案中，干扰素包含干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，核苷类似物包含拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)、拜斯福韦或AGX-1009。在一些实施方案中，非核苷抗病毒剂包含NOV-225、BAM 205、Myrcludex B、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，免疫增强剂包含日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株为HBV变异株或HBV突变株。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株包含HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的变异体或突变形式。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包含HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列相比。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包含HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含位于100位氨基酸与200位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含在115、118、120、123、126、129、131、133、134、142、143、144、145或154位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含T115N、T118V、P120L、P120Q、T126S、Q129H、T131K、M133I、M133L、F134N、F134H、P142L、P142S、T143L、D144A、D144V、G145R或S154P突变。
在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含位于150位氨基酸与200位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含在161、172、173、175、176、193、194或196位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含F161H、F161L、W172L、W172*、L173F、L175F、L176V、L176*、S193L、V194F、V194S、I195M、W196L、W196S或W196*突变，例如与参考序列或共同序列相比，其中“*”表示终止密码子。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包含P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含位于60位氨基酸与275位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含在80、169、173、180、181、184、169、202、204、215、233、236或250位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含N169T、I169T、V173L、L180M、A181T、A181V、T184A、T184C、T184G、T184I、T184L、T184M、T184S、S202C、S202G、S202I、M204I、M204V、N236T、M250I或M250V突变。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含L180M、M204I、M204V或N236T突变。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(Ib)和式(Ic)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，该混合物包含约1：1比率的式(Ib)与式(Ic)化合物(例如，外消旋混合物)。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(Ib)与式(Ic)化合物。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(Ic)与式(Ib)化合物。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物的混合物，包含式(Ib)化合物及小于约5％的式(Ic)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ic)化合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物，所述式(I)化合物基本上不含式(Ic)化合物，而含有式(Ib)化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物的混合物，包含式(Ic)化合物和小于约5％的式(Ib)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ib)化合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物，所述式(I)化合物基本上不含式(Ib)化合物，而含有式(Ic)化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(IIb)和式(IIc)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，该混合物包含约1：1比率的式(IIb)与式(IIc)化合物(例如，外消旋混合物)。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(IIb)与式(IIc)化合物。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(IIc)与式(IIb)化合物。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物的混合物，包含式(IIb)化合物和小于约5％的式(IIc)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIc)化合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物，所述式(II)化合物基本上不含式(IIc)化合物，而含有式(IIb)化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物的混合物，包含式(IIc)化合物和小于约5％的式(IIb)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIb)化合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物，所述式(II)化合物基本上不含式(IIb)化合物，而含有式(IIc)化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于10μM(例如，式(II)化合物小于10μM)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于1μM(例如，式(II)化合物小于1μM)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于0.1μM(例如，式(II)化合物的IC50值小于0.1μM)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于0.01μM(例如，式(II)化合物的IC50值小于0.1μM)。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，式(I)或式(II)化合物是经口给药。在一些实施方案中，式(I)化合物是经口给药。在一些实施方案中，式(II)化合物是经口给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是肠胃外给药。在一些实施方案中，式(I)化合物是肠胃外给药。在一些实施方案中，式(II)化合物是肠胃外给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是经静脉内给药。在一些实施方案中，式(I)化合物是经静脉内给药。在一些实施方案中，式(II)化合物是经静脉内给药。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物配制为液体或固体剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂或微胶囊剂型。
在一些实施方案中，该化合物(例如，式(I)或式(II)化合物)以约0.5mg/kg至约1000mg/kg的剂量给药。在一些实施方案中，该化合物(例如，式(I)或式(II)化合物)以如下剂量给药：约0.5mg/kg至约1000mg/kg、约900mg/kg、约800mg/kg、约700mg/kg、约600mg/kg、约500mg/kg、约400mg/kg、约300mg/kg、约250mg/kg、约200mg/kg、约150mg/kg、约100mg/kg、约75mg/kg、约50mg/kg、约25mg/kg、约10mg/kg、约5mg/kg、约2.5mg/kg或更少。在一些实施方案中，该化合物(例如，式(I)或式(II)化合物)以约5mg/kg至约500mg/kg的剂量给药。在一些实施方案中，该化合物(例如，式(I)或式(II)化合物)以如下剂量给药：约5mg/kg至约500mg/kg、450mg/kg、约400mg/kg、约350mg/kg、约300mg/kg、约250mg/kg、约200mg/kg、约150mg/kg、约100mg/kg、约75mg/kg、约50mg/kg、约25mg/kg、约10mg/kg或更少。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg至约1500mg、约1250mg、约1000mg、约900mg、约800mg、约700mg、约600mg、约500mg、约400mg、约300mg、约250mg、约200mg、约150mg、约100mg、约75mg、约50mg、约25mg或更少。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg、约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1250mg至约1500mg。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约50mg至约1000mg。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约200mg至约1000mg。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，式(I)或式(II)化合物是每日给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是每日给药一次。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是一日多于一次给药，例如一日两次、一日三次、一日四次。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是每隔一天、每2天、每3天、每4天或更久给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次或一周六次给药。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，该方法的持续时间为一天。在一些实施方案中，该方法的持续时间为大于1天，例如约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约2周、约3周、约4周、约1个月、约1.5个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月。在一些实施方案中，该方法的持续时间为约1天至约2周。在一些实施方案中，该方法的持续时间为6天至14天。在一些实施方案中，该方法的持续时间为一周。在一些实施方案中，该方法的持续时间持续至受试者的HBV感染被治愈(例如，直至受试者呈现不可检测的HBV RNA含量)
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，式(I)或式(II)化合物配制为药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物进一步包括药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV感染。在一些实施方案中，受试者诊断出患有慢性乙型肝炎(CHB)。在一些实施方案中，HBV感染的基因型为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型A(例如，HBV-A1-7)、HBV基因型B(例如，HBV-B2-5)、HBV基因型C(例如，HBV-C1-16)、HBV基因型D(例如，HBV-D1-7)、HBV基因型E、HBV基因型F(例如，HBV-F1-4)、HBV基因型G、HBV基因型H、HBV基因型I或HBV基因型J。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物具有泛基因型活性。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者是初治患者。在一些实施方案中，受试者先前已针对HBV感染进行治疗。在一些实施方案中，对HBV感染的先前治疗已失败。在一些实施方案中，受试者已复发。
在一些实施方案中，受试者先前已用除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂(例如，干扰素、病毒唑)治疗，且患有复发性HBV感染。
在一些实施方案中，受试者患有与丁型肝炎病毒(HDV)的共感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HDV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV与HDV共感染。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已诊断出患有肝硬化。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌且等待肝移植。在一些实施方案中，受试者不具有肝硬化或尚未诊断出患有肝细胞癌。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已进一步诊断出患有HIV感染。在一些实施方案中，HIV感染的病毒株为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HIV-1或HIV-2(例如，病毒株1或病毒株2)。
在一些实施方案中，受试者先前已用除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂(例如，干扰素、病毒唑)治疗，且患有复发性HBV感染。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者进一步被给药额外药剂或治疗剂或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，额外药剂为干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂、非干扰素免疫增强剂或直接作用的抗病毒剂。在一些实施方案中，额外药剂为干扰素，例如聚乙二醇干扰素α(例如，聚乙二醇干扰素α-2a或聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，额外药剂为核苷类似物，例如拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)、拜斯福韦或AGX-1009。在一些实施方案中，非核苷抗病毒剂包含NOV-225、BAM 205、MyrcludexB、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，免疫增强剂包含日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。
在任何及所有具体实施方案中，该方法的特征在于一种用于治疗受试者中乙型肝炎病毒的耐药性菌株的药物组合物，该组合物包含式(I)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)、式(II)化合物(例如，式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)或其药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
另一方面，本发明的特征在于一种治疗感染有乙型肝炎病毒(HBV)的受试者的方法，所述受试者先前已经被施用了抗HBV剂，该方法包括向受试者施用式(I)化合物，其中所述化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。在一些实施方案中，式(I)的前药为式(II)化合物，其中该化合物选自：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该方法包括向受试者给药式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，该方法包括向受试者给药式(II)化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，抗HBV剂是除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之外的抗HBV剂。在一些实施方案中，抗HBV剂为干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂、免疫增强剂或直接作用的抗病毒剂。在一些实施方案中，干扰素包含干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，核苷类似物包含拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)、拜斯福韦或AGX-1009。在一些实施方案中，非核苷抗病毒剂包含NOV-225、BAM 205、Myrcludex B、ARC-520、BAY 41-4109、REP9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，免疫增强剂包含日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。
在一些实施方案中，HBV病毒株为耐药型乙型肝炎病毒株。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株对除式(I)或式(II)化合物以外的抗HBV剂具有抗性。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株对除式(I)化合物以外的抗HBV剂具有抗性。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株对除式(II)化合物以外的抗HBV剂具有抗性。
在一些实施方案中，受试者中HBV生物标记物的含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，HBV生物标记物的含量没有由于暴露于除式(I)化合物以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，HBV生物标记物的含量没有由于暴露于除式(II)化合物以外的抗HBV剂而明显降低。
在一些实施方案中，HBV生物标记物包含病毒载量、HBsAg含量、HBeAg含量或cccDNA含量。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而显著降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后降低了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后降低了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后降低了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后降低了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约50％、约40％、约30％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％、约0.5％、约0.1％或更少。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或约99.99％或更多。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株对除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂具有抗性，且该抗HBV剂为干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂、免疫增强剂或直接作用的抗病毒剂。在一些实施方案中，干扰素包含干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，核苷类似物包含拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)、拜斯福韦或AGX-1009。在一些实施方案中，非核苷抗病毒剂包含NOV-225、BAM 205、Myrcludex B、ARC-520、BAY41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，免疫增强剂包含日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株为HBV变异株或HBV突变株。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株包含HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的变异体或突变形式。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包含HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列相比。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包含HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含位于100位氨基酸与200位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含在115、118、120、123、126、129、131、133、134、142、143、144、145或154位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含T115N、T118V、P120L、P120Q、T126S、Q129H、T131K、M133I、M133L、F134N、F134H、P142L、P142S、T143L、D144A、D144V、G145R或S154P突变。
在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含位于150位氨基酸与200位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含在161、172、173、175、176、193、194或196位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。在一些具体实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含F161H、F161L、W172L、W172*、L173F、L175F、L176V、L176*、S193L、V194F、V194S、I195M、W196L、W196S或W196*突变，例如与参考序列或共同序列相比，其中“*”表示终止密码子。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包含P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含位于60位氨基酸与275位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含在80、169、173、180、181、184、169、202、204、215、233、236或250位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含N169T、I169T、V173L、L180M、A181T、A181V、T184A、T184C、T184G、T184I、T184L、T184M、T184S、S202C、S202G、S202I、M204I、M204V、N236T、M250I或M250V突变。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包含L180M、M204I、M204V或N236T突变。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(Ib)和式(Ic)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，该混合物包含约1：1比率的式(Ib)与式(Ic)化合物(例如，外消旋混合物)。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(Ib)与式(Ic)化合物。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(Ic)与式(Ib)化合物。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物的混合物，包含式(Ib)化合物及小于约5％的式(Ic)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ic)化合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物，所述式(I)化合物基本上不含式(Ic)化合物，而含有式(Ib)化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物的混合物，包含式(Ic)化合物及小于约5％的式(Ib)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ib)化合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(I)化合物，所述式(I)化合物基本上不含式(Ib)化合物，而含有式(Ic)化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(IIb)和式(IIc)化合物或其药学上可接受的盐的混合物。在一些实施方案中，该混合物包含约1：1比率的式(IIb)与式(IIc)化合物(例如，外消旋混合物)。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(IIb)与式(IIc)化合物。在一些实施方案中，该混合物包含约51：49、约52：48、约53：47、约54：46、约55：45、约60：40、约65：35、约70：30、约75：25、约80：20、约85：15、约90：10、约95：5或约99：1比率的式(IIc)与式(IIb)化合物。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物的混合物，包含式(IIb)化合物及小于约5％的式(IIc)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIc)化合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物，所述式(II)化合物基本上不含式(IIc)化合物，而含有式(IIb)化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物的混合物，包含式(IIc)化合物及小于约5％的式(IIb)化合物，例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIb)化合物。在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括向受试者给药式(II)化合物，所述式(II)化合物基本上不含式(IIb)化合物，含有式(IIc)化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于10μM(例如，式(II)化合物为小于10μM)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于1μM(例如，式(II)化合物小于1μM)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于0.1μM(例如，式(II)化合物的IC50值小于0.1μM)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于0.01μM(例如，式(II)化合物的IC50值小于0.1μM)。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，式(I)或式(II)化合物是经口给药。在一些实施方案中，式(I)化合物是经口给药。在一些实施方案中，式(II)化合物是经口给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是肠胃外给药。在一些实施方案中，式(I)化合物是肠胃外给药。在一些实施方案中，式(II)化合物是肠胃外给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是经静脉内给药。在一些实施方案中，式(I)化合物是经静脉内给药。在一些实施方案中，式(II)化合物是经静脉内给药。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物配制为液体或固体剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂或微胶囊剂型。
在一些实施方案中，该化合物(例如，式(I)或式(II)化合物)以约0.5mg/kg至约1000mg/kg的剂量给药。在一些实施方案中，该化合物(例如，式(I)或式(II)化合物)以如下剂量给药：约0.5mg/kg至约1000mg/kg、约900mg/kg、约800mg/kg、约700mg/kg、约600mg/kg、约500mg/kg、约400mg/kg、约300mg/kg、约250mg/kg、约200mg/kg、约150mg/kg、约100mg/kg、约75mg/kg、约50mg/kg、约25mg/kg、约10mg/kg、约5mg/kg、约2.5mg/kg或更少。在一些实施方案中，该化合物(例如，式(I)或式(II)化合物)以约5mg/kg至约500mg/kg的剂量给药。在一些实施方案中，该化合物(例如，式(I)或式(II)化合物)以如下剂量给药：约5mg/kg至约500mg/kg、450mg/kg、约400mg/kg、约350mg/kg、约300mg/kg、约250mg/kg、约200mg/kg、约150mg/kg、约100mg/kg、约75mg/kg、约50mg/kg、约25mg/kg、约10mg/kg或更少。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg至约1500mg、约1250mg、约1000mg、约900mg、约800mg、约700mg、约600mg、约500mg、约400mg、约300mg、约250mg、约200mg、约150mg、约100mg、约75mg、约50mg、约25mg或更少。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg、约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1250mg至约1500mg。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约50mg至约1000mg。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约200mg至约1000mg。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，式(I)或式(II)化合物是每日给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是每日给药一次。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是一日多于一次给药，例如一日两次、一日三次、一日四次。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是每隔一天、每2天、每3天、每4天或更久给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次或一周六次给药。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，该方法的持续时间为一天。在一些实施方案中，该方法的持续时间为大于1天，例如约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约2周、约3周、约4周、约1个月、约1.5个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月。在一些实施方案中，该方法的持续时间为约1天至约2周。在一些实施方案中，该方法的持续时间为6天至14天。在一些实施方案中，该方法的持续时间为一周。在一些实施方案中，该方法的持续时间持续至受试者的HBV感染被治愈(例如，直至受试者呈现不可检测的HBV RNA含量)。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，式(I)或式(II)化合物被配制为药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV感染。在一些实施方案中，受试者诊断出患有慢性乙型肝炎(CHB)。在一些实施方案中，HBV感染的基因型为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型A(例如，HBV-A1-7)、HBV基因型B(例如，HBV-B2-5)、HBV基因型C(例如，HBV-C1-16)、HBV基因型D(例如，HBV-D1-7)、HBV基因型E、HBV基因型F(例如，HBV-F1-4)、HBV基因型G、HBV基因型H、HBV基因型I或HBV基因型J。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物具有泛基因型活性。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者是初治患者。在一些实施方案中，受试者先前已针对HBV感染进行治疗。在一些实施方案中，针对HBV感染的先前治疗已失败。在一些实施方案中，受试者已复发。
在一些实施方案中，受试者先前已用除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂(例如，干扰素、病毒唑)治疗，且患有复发性HBV感染。
在一些实施方案中，受试者患有与丁型肝炎病毒(HDV)的共感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HDV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV与HDV共感染。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已诊断出患有肝硬化。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌且等待肝移植。在一些实施方案中，受试者不具有肝硬化或尚未诊断出患有肝细胞癌。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已进一步诊断出患有HIV感染。在一些实施方案中，HIV感染的病毒株为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HIV-1或HIV-2(例如，病毒株1或病毒株2)。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者进一步被给药额外药剂或治疗剂或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，额外药剂为干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂、非干扰素免疫增强剂或直接作用的抗病毒剂。在一些实施方案中，额外药剂为干扰素，例如聚乙二醇干扰素α(例如，聚乙二醇干扰素α-2a或聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，额外药剂为核苷类似物，例如拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)、拜斯福韦或AGX-1009。在一些实施方案中，非核苷抗病毒剂包含NOV-225、BAM 205、MyrcludexB、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，免疫增强剂包含日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。在一些实施方案中，额外药剂为恩替卡韦或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)。
在任何及所有具体实施方案中，该方法的特征在于一种适用于治疗感染有乙型肝炎病毒(HBV)且先前已被给药抗HBV剂的受试者的药物组合物，该组合物包含式(I)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)、式(II)化合物(例如，式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)或其药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
在另一方面中，本发明的特征在于一种治疗受试者中丁型肝炎病毒的方法，该方法包括向受试者给药式(I)化合物，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，与恩替卡韦或其药学上可接受的盐的组合，从而治疗受试者。
在另一方面中，本发明的特征在于一种治疗受试者中丁型肝炎病毒的方法，其包括向受试者给药恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程，其中受试者先前已用式(I)化合物的疗程治疗，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
在另一方面中，本发明的特征在于一种治疗受试者中丁型肝炎病毒的方法，其中该受试者先前已用恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程治疗，该方法包括向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
在另一方面中，本发明的特征在于一种治疗受试者中丁型肝炎病毒的方法，该方法包括首先向受试者给药恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程，且随后向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
在另一方面中，本发明的特征在于一种治疗受试者中丁型肝炎病毒的方法，该方法包括首先向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，且随后向受试者给药恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程，从而治疗受试者。
在任何或所有先前具体实施方案中，式(I)的前药为式(II)化合物，其中该化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的疗程为约1天至约24周。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物在整个疗程中为至少每周给药(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次、一周7次)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物在整个疗程中是每日给药。
在一些实施方案中，恩替卡韦的疗程为约1天至约12周。在一些实施方案中，恩替卡韦在整个疗程中是至少每周给药(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次、一周7次)。在一些实施方案中，恩替卡韦在整个疗程中是每日给药。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约5mg/kg至约100mg/kg(例如，约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg或约100mg/kg)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg/kg至约50mg/kg(例如，约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg)。
在一些实施方案中，恩替卡韦的剂量为约0.1mg至约5mg(例如，约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约1.25mg、约1.5mg、约1.75mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg或约5mg)。在一些实施方案中，恩替卡韦的剂量为约0.01mg/kg至约10mg/kg(例如，约0.01mg/kg、约0.025mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)。在一些实施方案中，恩替卡韦的剂量为约0.1mg/kg至约5mg/kg(例如，约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.25mg/kg、约1.5mg/kg、约1.75mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg或约5mg/kg)。
在一些实施方案中，该剂量包含液体或固体剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸或散剂。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物或恩替卡韦是经口给药(例如，式(I)或式(II)化合物是经口给药，或恩替卡韦是经口给药，或式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦两者均经口给药)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物或恩替卡韦是肠胃外给药(例如，式(II)化合物是肠胃外给药)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是肠胃外给药且恩替卡韦是经口给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物与恩替卡韦配制为固定剂量复合剂(例如，配制为液体剂型或固体剂型，例如胶囊或片剂)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物与恩替卡韦配制为固定剂量复合剂(例如，配制为液体剂型或固体剂型，例如胶囊或片剂)用以经口给药。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦的给药具有协同或累加效应。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦的给药具有累加效应。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦的给药具有协同效应。
在一些实施方案中，该组合物包含式(I)化合物(例如，式(Ib)和式(Ic)化合物)的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ib)化合物且包含小于约5％的式(Ic)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ic)化合物)，或基本上不含式(Ic)化合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ic)化合物且包含小于约5％的式(Ib)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ib)化合物，或基本上不含式(Ib)化合物)。
在一些实施方案中，该组合物包含式(II)化合物(例如，式(IIb)和式(IIc)化合物)的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIb)化合物且包含小于约5％的式(IIc)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIc)化合物，或基本上不含式(IIc)化合物)。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIc)化合物且包含小于约5％的式(IIb)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIb)化合物，或基本上不含式(IIb)化合物)。
在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，受试者为非人类动物，例如土拔鼠(例如，东方土拔鼠)。
在一些实施方案中，该方法进一步包括给药治疗有效量的额外药剂。在一些实施方案中，额外药剂为抗病毒剂或抗癌剂。在一些实施方案中，抗病毒剂包含干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂或非干扰素免疫增强剂。在一些实施方案中，干扰素包含干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，其中核苷类似物包含拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦、替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦或AGX-1009。在一些实施方案中，抗病毒剂为替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺)。在一些实施方案中，抗病毒化合物包含NOV-225、BAM 205、Myrcludex B、ARC-520、BAY41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，非干扰素免疫增强剂包含日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。在一些实施方案中，抗病毒剂为衣壳蛋白抑制剂、进入抑制剂、分泌抑制剂、微RNA、反义RNA剂、RNAi剂或被设计成抑制病毒RNA的其他药剂。在一些实施方案中，抗癌剂选自氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、多柔比星、长春新碱、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、依托泊甙、顺铂、表柔比星和甲苯磺酸索拉非尼。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者是初治患者。在一些实施方案中，受试者先前已针对HBV感染进行治疗。在一些实施方案中，对HBV感染的先前治疗已失败。在一些实施方案中，受试者已复发。
在一些实施方案中，受试者先前已用除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂(例如，干扰素、病毒唑)治疗，且患有复发性HBV感染。
在一些实施方案中，受试者患有与丁型肝炎病毒(HDV)的共感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HDV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有HBV与HDV的共感染。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已诊断出患有肝硬化。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌且等待肝移植。在一些实施方案中，受试者不具有肝硬化或尚未诊断出患有肝细胞癌。
在一些实施方案中，在本发明所描述的方法中，受试者已进一步诊断出患有HIV感染。在一些实施方案中，HIV感染的病毒株为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HIV-1或HIV-2(例如，病毒株1或病毒株2)。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括直至治疗结束时至少一周一次的分析受试者的体重和体温或接受对受试者的体重和体温的分析。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括在治疗结束之前至少一次的分析受试者血液样本或接受对受试者血液样本的分析。在一些实施方案中，分析血液样本的病毒载量及表面抗原含量。在一些实施方案中，分析血液样本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。在一些实施方案中，分析血液样本的抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法进一步包括在治疗结束之前至少一次的分析受试者肝活检标本或接受对受试者肝活检标本的分析。在一些实施方案中，分析肝活检标本的病毒DNA、病毒RNA、病毒抗原及cccDNA的含量。在一些实施方案中，分析肝活检标本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。在一些实施方案中，分析肝活检标本的抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。在一些实施方案中，分析肝活检标本的肝炎症、坏死、脂肪变性或纤维化的减少。
在任何及所有具体实施方案中，该方法的特征在于一种用于治疗感染有丁型肝炎病毒(HDV)的受试者的药物组合物，该组合物包含式(I)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)、式(II)化合物(例如，式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)或其药学上可接受的盐，与恩替卡韦的组合，从而治疗受试者。
在另一方面中，本发明的特征在于包含式(I)化合物的药物组合物，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，以及恩替卡韦或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，式(I)的前药为式(II)化合物，且该化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，药物组合物包含口服剂型。在一些实施方案中，口服剂型为液体剂型或固体剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸或散剂。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约5mg/kg至约100mg/kg(例如，约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg或约100mg/kg)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg/kg至约50mg/kg(例如，约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg)。
在一些实施方案中，恩替卡韦的剂量为约0.1mg至约5mg(例如，约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约1.25mg、约1.5mg、约1.75mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg或约5mg)。在一些实施方案中，恩替卡韦的剂量为约0.01mg/kg至约10mg/kg(例如，约0.01mg/kg、约0.025mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)。在一些实施方案中，恩替卡韦的剂量为约0.1mg/kg至约5mg/kg(例如，约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.25mg/kg、约1.5mg/kg、约1.75mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg或约5mg/kg)。
在一些实施方案中，该剂量包含液体或固体剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸或散剂。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物或恩替卡韦是经口给药(例如，式(I)或式(II)化合物是经口给药，或恩替卡韦是经口给药，或式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦两者均经口给药)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物或恩替卡韦是肠胃外给药(例如，式(II)化合物是肠胃外给药)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是肠胃外给药且恩替卡韦是经口给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物与恩替卡韦被配制为固定剂量复合剂(例如，配制为液体剂型或固体剂型，例如胶囊或片剂)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物与恩替卡韦被配制为固定剂量复合剂(例如，配制为液体剂型或固体剂型，例如胶囊或片剂)用以经口给药。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦的给药具有协同或累加效应。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦的给药具有累加效应。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦的给药具有协同效应。
在一些实施方案中，该组合物包含式(I)化合物(例如，式(Ib)和式(Ic)化合物)的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ib)化合物且包含小于约5％的式(Ic)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ic)化合物)，或基本上不含式(Ic)化合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ic)化合物且包含小于约5％的式(Ib)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ib)化合物，或基本上不含式(Ib)化合物)。
在一些实施方案中，该组合物包含式(II)化合物(例如，式(IIb)和式(IIc)化合物)的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIb)化合物且包含小于约5％的式(IIc)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIc)化合物，或基本上不含式(IIc)化合物)。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIc)化合物且包含小于约5％的式(IIb)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIb)化合物，或基本上不含式(IIb)化合物)。
在另一方面中，本发明的特征在于一种包含式(I)化合物的药物组合物，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，以及替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，式(I)的前药为式(II)化合物，且该化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，药物组合物包含口服剂型。在一些实施方案中，口服剂型为液体剂型或固体剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸或散剂。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约5mg/kg至约100mg/kg(例如，约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg或约100mg/kg)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg/kg至约50mg/kg(例如，约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg或约50mg/kg)。
在一些实施方案中，替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的剂量为约10mg至约500mg(例如，约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg或约300mg)。在一些实施方案中，替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的剂量为约0.01mg/kg至约20mg/kg(例如，约0.01mg/kg、约0.025mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约7.5mg/kg、约10mg/kg、约12.5mg/kg、约15mg/kg、约17.5mg/kg或约20mg/kg)。在一些实施方案中，替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的剂量为约1mg/kg至约20mg/kg(例如，约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约12.5mg/kg、约15mg/kg、约17.5mg/kg或约20mg/kg)。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)是经口给药(例如，式(I)或式(II)化合物是经口给药，或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)是经口给药，或式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦两者均经口给药)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)是肠胃外给药(例如，式(II)化合物是肠胃外给药)。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物是肠胃外给药且替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)是经口给药。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物与替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)被配制为固定剂量复合剂，例如配制为液体剂型或固体剂型，例如胶囊或片剂。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物与替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)被配制为固定剂量复合剂，例如配制为液体剂型或固体剂型，例如胶囊或片剂，用以经口给药。
在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物及替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的给药具有协同或累加效应。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物及替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的给药具有累加效应。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物及替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的给药具有协同效应。
在一些实施方案中，该组合物包含式(I)化合物(例如，式(Ib)和式(Ic)化合物)的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ib)化合物且包含小于约5％的式(Ic)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ic)化合物)，或基本上不含式(Ic)化合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(Ic)化合物且包含小于约5％的式(Ib)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ib)化合物，或基本上不含式(Ib)化合物)。
在一些实施方案中，该组合物包含式(II)化合物(例如，式(IIb)和式(IIc)化合物)的混合物。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIb)化合物且包含小于约5％的式(IIc)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIc)化合物，或基本上不含式(IIc)化合物)。在一些实施方案中，该组合物包含式(IIc)化合物且包含小于约5％的式(IIb)化合物(例如，小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIb)化合物，或基本上不含式(IIb)化合物)。
附图说明
图1为显示在腹膜内给药式(Ia)化合物之后直至第16周，式(Ia)化合物在慢性WHV感染的土拨鼠中的抗病毒活性的图。
图2A-2F为显示在式(IIa)化合物治疗之后慢性WHV携带者土拨鼠中血清病毒血症及抗原血症的剂量依赖性暂态抑制的图。在给药低剂量(15mg/kg，图2A、2D)或高剂量(30mg/kg，图2B、2E)的各土拨鼠中用式(IIa)化合物每日口服治疗12周的期间，WHV DNA(图2A至2C)和WHsAg(图2D至2F)的血清含量相对于T0(治疗前基线)的变化，以及各组的平均值(图2C、2F，空心圆：低剂量；实心圆：高剂量)。误差条表示平均值的标准误差。
图3A-3C为显示在式(IIa)化合物治疗之后肝脏WHV核酸含量的剂量依赖性暂态减少的图。响应于低剂量(15mg/kg，空心圆)或高剂量(30mg/kg，实心圆)的式(IIa)化合物治疗，肝脏WHV cccDNA(图3A)、WHV RI DNA(图3B)和WHV RNA(图3C)的平均含量相对于第-1周(治疗前基线)的变化。误差条表示平均值的标准误差。
图4A-4E为显示在慢性WHV携带者土拨鼠中式(IIa)化合物剂量对WHV复制的作用的图。观察到响应于低剂量(LD；15mg/kg)或高剂量(HD；30mg/kg)的式(IIa)化合物治疗，血清WHV DNA(图4A)和WHsAg(图4B)和肝脏WHV cccDNA(图4C)、WHV RI DNA(图4D)和WHV RNA(图4E)的最大减少。血清和肝的病毒参数的变化是分别相对于T0或第-1周(治疗前基线)计算的。条形图的高度表示各组的平均值，且误差条表示平均值的标准误差。紧接着条形图下方的星号表示相对于治疗前基线的统计学显著性水平：**p<0.01及***p<0.001。水平线下方的p值表示两组之间的统计学显著性水平。根据本发明所描述的取样方案，以下数据包括在分析中：血清WHV DNA及WHsAg在0至12周的最大减少，以及肝脏WHV cccDNA、RI DNA和RNA在第6周及第12周的最大减少。
图5A-5D为显示在慢性WHV携带者土拨鼠的肝中式(IIa)化合物治疗对WHV抗原表达及炎症的作用的图。示出了响应于低剂量(15mg/kg，图5A、5C)或高剂量(30mg/kg，图5B、5D)的式(IIa)化合物治疗，细胞质WHcAg表达(图5A、5B)及肝组织学(图5C、5D)的平均评分的变化。将平均血清WHV DNA(空心圆)相对于T0(治疗前基线)的变化绘制在左侧y轴上。将肝中的细胞质WHcAg表达的平均免疫组织化学(IHC)评分(图5A、5B)和门脉与小叶窦小管(sinusoidal)肝炎的平均肝组织学评分(图5C、5D)绘制在右侧y轴上。IHC评分是由染色的肝细胞百分比评分的平均值结合染色强度评分的平均值获得的。复合IHC评分0表示所有肝细胞中不存在WHcAg染色(0％)，而8表示81-100％肝细胞中存在强WHcAg染色。具体地，WHcAg染色的肝细胞的百分比按0-5级评分，其中0表示0％，1表示1-20％，2表示21-40％，3表示41-60％，4表示61-80％且5表示81-100％的染色细胞。WHcAg染色强度按0-3级评分，其中0表示无染色，1表示弱染色，2表示中度染色且3表示强染色。肝组织学评分是由小叶窦小管肝炎评分的平均值结合门脉肝炎评分(检查n＝1-5个肝门束)的平均值获得的。复合组织学评分0表示不存在肝炎，>0-2表示轻度肝炎，>2-4表示中度肝炎且>4表示明显的至严重肝炎。误差条表示平均值的标准误差。
图6A-6B为显示式(IIa)化合物治疗慢性WHV携带者土拨鼠对肝酶含量的作用的图。观察到响应于低剂量(15mg/kg，图6A)或高剂量(30mg/kg，图6B)的式(IIa)化合物治疗，SDH、AST和ALT的平均血清含量的变化。将平均血清WHV DNA(空心圆)相对于T0(治疗前基线)的变化绘制在左侧y轴上。将SDH、AST及ALT三者的平均血清变化都绘制在右侧y轴上。误差条表示平均值的标准误差。
图7A-7D为显示式(IIa)化合物治疗对I型IFN、细胞因子和ISG在慢性WHV携带者土拨鼠的外周血中的表达水平的作用的图。示出了响应于低剂量(15mg/kg，图7A、7C)或高剂量(30mg/kg，图7B、7D)的式(IIa)化合物治疗，IFN-α、IFN-β和IL-6(图7A、7B)以及CXCL10、OAS1和ISG15(图7C、7D)的平均血液转录水平的变化。将平均血清WHV DNA(空心圆)相对于T0(治疗前基线)的变化绘制在左侧y轴上。将平均血液IFN-α、IFN-β和IL-6三者的变化都绘制在顶部图的右侧y轴上。将平均血液CXCL10、OAS1和ISG15三者的变化都绘制在底部图的右侧y轴上。误差条表示平均值的标准误差。
图8A-8D为显示式(IIa)化合物治疗对I型IFN、细胞因子和ISG在慢性WHV携带者土拨鼠的肝中的表达水平的作用的图。示出了响应于低剂量(15mg/kg，图8A、8C)或高剂量(30mg/kg，图8B、8D)的式(IIa)化合物治疗，IFN-α、IFN-β和IL-6(图8A、8B)以及CXCL10、OAS1和ISG15(图8C、8D)的平均肝转录水平的变化。将平均血清WHV DNA(黑色空心圆)相对于T0(治疗前基线)的变化绘制在左侧y轴上。将平均肝IFN-α、IFN-β和IL-6三者的变化都绘制在顶部图的右侧y轴上。将平均肝CXCL10、OAS1和ISG15三者的变化都绘制在底部图的右侧y轴上。误差条表示平均值的标准误差。
图9A-9B为显示在用式(IIa)化合物治疗之后RIG-I/NOD2途径的持久活化的图。示出了响应于低剂量(15mg/kg，n＝3，图9A)或高剂量(30mg/kg，n＝3，图9B)的式(IIa)化合物治疗，在土拨鼠的子集中响应于式(IIa)化合物治疗的RIG-I、NOD2、TMEM173(即，STING)和IRF3的平均肝转录水平的变化。
图10A-10F是进一步显示在式(IIa)化合物治疗之后RIG-I/NOD2途径的持久活化的图。示出了在20周疗程内肝中RIG-I(图10A)和NOD2(图10B)表达的IHC评分的变化。在治疗前以及在第6周、第12周和第20周时间点示出了两只土拨鼠的RIG-I(图10C、10E)和NOD2(图10D、10F)染色的肝细胞的照片，其各自用式(IIa)化合物治疗，且作为高剂量组的一部分。
图11A-11B为显示在给药低剂量(15mg/kg，图9A)或高剂量(30mg/kg，图9B)的土拨鼠中用式(IIa)化合物每日口服治疗12周期间，WHV DNA的平均血清含量相对于T0(治疗前基线)的变化及式(Ia)化合物的平均血浆含量变化的图。将血清WHV DNA绘制在左侧y轴上。将血浆式(Ia)绘制在右侧y轴上。误差条表示平均值的标准误差。
图12A-12B为显示在给药低剂量(15mg/kg，图10A)或高剂量(30mg/kg，图10B)的各土拨鼠中用式(IIa)化合物每日口服治疗12周期间，WHV DNA的血清含量相对于T0(治疗前基线)的各自变化以及式(Ia)化合物的血浆含量的各自变化的图。将血清WHV DNA(黑色空心圆)绘制在左侧y轴上。将式(Ia)化合物(红色圆圈)绘制在右侧y轴上。
图13A-13F为显示在给药低剂量(15mg/kg，图11A、11C、11E)或高剂量(30mg/kg，图11B、11D、11F)的各土拨鼠中用式(IIa)化合物每日口服治疗12周期间，WHV cccDNA(图11A、11B)、WHV RI DNA(图11C、11D)和WHV RNA(图11E、11F)的肝脏含量相对于第-1周(治疗前基线)的图。
图14A-14B为显示在给药低剂量(15mg/kg，图12A)或高剂量(30mg/kg，图12B)的各土拨鼠中用式(IIa)化合物每日口服治疗12周期间，WHV DNA的血清含量相对于T0(治疗前基线)的各自变化及肝中细胞质WHcAg表达的免疫组织化学(IHC)评分的各自变化的图。将血清WHV DNA(空心圆)绘制在左侧y轴上，且将IHC评分绘制在右侧y轴上。IHC评分是由染色的肝细胞百分比评分的平均值结合染色强度评分的平均值获得的。复合IHC评分0表示所有肝细胞中不存在WHcAg染色(0％)，而8表示81-100％肝细胞中存在强WHcAg染色。具体地，WHcAg染色的肝细胞的百分比按0-5级评分，其中0表示0％，1表示1-20％，2表示21-40％，3表示41-60％，4表示61-80％且5表示81-100％的细胞被染色。WHcAg染色强度按0-3级评分，其中0表示无染色，1表示弱染色，2表示中度染色且3表示强染色。ND＝不确定，因为未收集肝活检组织。
图15A-15B为显示在给药(a)低剂量(15mg/kg)或(b)高剂量(30mg/kg)的各土拨鼠中用式(IIa)化合物每日口服治疗12周期间，WHV DNA的血清含量相对于T0(治疗前基线)的各自变化及肝组织学评分的各自变化的图。将血清WHV DNA(黑色空心圆)绘制在左侧y轴上，且将肝组织学评分(棕色条形图)绘制在右侧y轴上。肝组织学评分是由小叶窦小管肝炎评分的平均值结合门脉肝炎评分(检查n＝1-5个肝门束)的平均值获得的。复合组织学评分0表示不存在肝炎，>0-2表示轻度肝炎，>2-4表示中度肝炎且>4表示明显至严重肝炎。ND＝不确定，因为未收集肝活检组织。
图16A-16E为显示在式(IIa)化合物治疗期间及在完成式(IIa)化合物治疗之后肝酶的组血清含量相对于治疗前含量的变化的图。响应于低剂量(LD；15mg/kg)或高剂量(HD；30mg/kg)的式(IIa)化合物治疗，血清SDH(图14A)、AST(图14B)、ALT(图14C)、ALP(图14D)和GGT(图14E)的最大增加。肝酶的血清含量的变化是相对于T0(治疗前基线)计算的。条形图的高度表示各组的平均值，且误差条表示平均值的标准误差。紧接着条形图上方的星号表示相对于治疗前基线的统计学显著性水平：*p<0.05。水平线上方的p值表示两组之间及各组在治疗与随访之间的统计学显著性水平。根据本发明所描述的取样方案，以下肝酶数据包括在分析中：在第4周、第8周及第12周治疗期间的最大增加，及在第16周及第20周随访期间的最大增加。SDH、AST、ALT、ALP及GGT的T0(治疗前基线)含量在低剂量组中为73.0、57.6、7.2、47.4、5.2IU/mL，且在高剂量组中为94.6、69.8、7.6、24.2、5.4IU/mL。
图17A-17B为显示在给药低剂量(15mg/kg，图15A)或高剂量(30mg/kg，图15B)的各土拨鼠中用式(IIa)化合物每日口服治疗12周期间，WHV DNA的血清含量相对于T0(治疗前基线)的各自变化以及SDH、AST和ALT的血清含量的各自变化的图。将血清WHV DNA(空心圆)绘制在左侧y轴上。将SDH、AST及ALT三者都绘制在右侧y轴上。
图18A-18F为显示在式(IIa)化合物治疗期间及在完成式(IIa)化合物治疗之后I型IFN、细胞因子及ISG在外周血中的组表达水平相对于治疗前水平的变化的图。响应于低剂量(LD；15mg/kg)或高剂量(HD；30mg/kg)的式(IIa)化合物治疗，IFN-α(图16A)、IFN-β(图16B)、IL-6(图16C)、CXCL10(图16D)、OAS1(图16E)和ISG15(图16F)的血液转录的最大增加。宿主先天性免疫应答基因的转录水平的变化是相对于T0(治疗前基线)计算的。条形图的高度表示各组的平均值，且误差条表示平均值的标准误差。紧接着条形图上方的星号表示相对于治疗前基线的统计学显著性水平：*p<0.05、**p<0.01及***p<0.001。水平线上方的p值表示两个剂量组之间及各剂量组在治疗与随访之间的统计学显著性水平。根据实验程序中所描述的取样方案，以下免疫应答基因的转录水平数据包括在分析中：在第6周及第12周治疗期间的最大增加，以及在第18周随访期间的最大增加。
图19A-19B为显示在给药低剂量(15mg/kg，图17A)或高剂量(30mg/kg，图17B)的各土拨鼠中用式(IIa)化合物每日口服治疗12周期间，WHV DNA的血清含量相对于T0(治疗前基线)的变化以及IFN-α、IFN-β和IL-6的血液转录水平的变化的图。将血清WHV DNA(空心圆)绘制在左侧y轴上。将IFN-α、IFN-β和IL-6三者都绘制在右侧y轴上。
图20A-20B为显示在给药低剂量(15mg/kg，图18A)或高剂量(30mg/kg，图18B)的各土拨鼠中用式(IIa)化合物每日口服治疗12周期间，WHV DNA的血清含量相对于T0(治疗前基线)的各自变化及CXCL10、OAS1和ISG15的血液转录水平的各自变化的图。将血清WHV DNA(空心圆)绘制在左侧y轴上。将CXCL10、OAS1及ISG15三者都绘制在底部图的右侧y轴上。
图21A-21F为显示I型IFN、细胞因子及ISG在年龄匹配的未经治疗的慢性WHV携带者土拨鼠的外周血中的基础表达水平与经式(IIa)化合物治疗的土拨鼠中的治疗前水平的比较图。示出了在五只未经治疗的对照土拨鼠中及在合并的低剂量(LD)和高剂量(HD)组的十只土拨鼠中，IFN-α(图21A)、IFN-β(图21B)、IL-6(图21C)、CXCL10(图21D)、OAS1(图21E)和ISG15(图21F)的平均血液转录水平。在治疗前基线(T0)获得LD和HD组的土拨鼠的宿主先天性免疫应答基因的转录水平。条形图的高度表示各组的平均值。水平线上方的p值表示各组之间的统计学显著性水平。
图22A-22F为显示在式(IIa)化合物治疗期间及在完成式(IIa)化合物治疗之后I型IFN、细胞因子及ISG在肝中的组表达水平相对于治疗前水平的变化的图。响应于低剂量(LD；15mg/kg)或高剂量(HD；30mg/kg)的式(IIa)化合物治疗，IFN-α(图19A)、IFN-β(图19B)、IL-6(图19C)、CXCL10(图19D)、OAS1(图19E)和ISG15(图19F)的肝转录的最大增加。宿主免疫应答基因的转录水平的变化是相对于第-1周(治疗前基线)计算的。条形图的高度表示各组的平均值，且误差条表示平均值的标准误差。紧接着条形图上方的星号表示相对于治疗前基线的统计学显著性水平：*p<0.05、**p<0.01及***p<0.001。水平线上方的p值表示两组之间及各组在治疗与随访之间的统计学显著性水平。根据实验程序中所描述的取样方案，以下免疫应答基因的转录水平的数据包括在分析中：在第6周及第12周治疗期间的最大增加，及在第20周随访期间的最大增加。
图23A-23B为显示在给药低剂量(15mg/kg，图20A)或高剂量(30mg/kg，图20B)的各土拨鼠中用式(IIa)化合物每日口服治疗12周期间，WHV DNA的血清含量相对于T0(治疗前基线)的变化及IFN-α、IFN-β和IL-6的肝转录水平的变化的图。将血清WHV DNA(空心圆)绘制在左侧y轴上。将IFN-α、IFN-β和IL-6三者都绘制在右侧y轴上。
图24A-24B为显示在给药低剂量(15mg/kg，图21A)或高剂量(30mg/kg，图21B)的各土拨鼠中用式(IIa)化合物每日口服治疗12周期间，WHV DNA的血清含量相对于T0(治疗前基线)的各自变化以及CXCL10、OAS1及ISG15肝转录水平的各自变化的图。将血清WHV DNA(空心圆)绘制在左侧y轴上。将CXCL10、OAS1和ISG15三者都绘制在底部图的右侧y轴上。
图25A-25F为显示I型IFN、细胞因子和ISG在年龄匹配的未经治疗的慢性WHV携带者土拨鼠的肝中的基础含量与经式(IIa)化合物治疗的土拨鼠中的治疗前含量的比较图。示出了在五只未经治疗的对照土拨鼠中及在合并的低剂量(15mg/kg)和高剂量(30mg/kg)组的十只土拨鼠中，IFN-α(图25A)、IFN-β(图25B)、IL-6(图25C)、CXCL10(图25D)、OAS1(图25E)和ISG15(图25F)的平均肝转录水平。在T0(治疗前基线)获得低剂量和高剂量组的土拨鼠的宿主反应基因的转录水平，且条形图的高度表示各组的平均值。水平线上方的p值是指各组之间的统计学显著性水平。
图26为总结用于确定血液和肝中的宿主免疫应答的寡核苷酸的表格。F：正向引物；R：反向引物；P：探针。
图27A-27B为比较如实施例3中所描述的两组五只慢性WHV感染的土拨鼠中血清WHV DNA的下降的图。在用式(IIa)化合物治疗之前(第2组，图27A)或之后(30mg/kg，第2组，图27B)给药恩替卡韦(0.5mg/kg)持续16周，且监测对血清WHV DNA的作用。
图28A-28B为比较如实施例3中所描述的两组五只慢性WHV感染的土拨鼠中血清WHV DNA的下降的图。在用式(IIa)化合物治疗之前(第2组，图28A)或之后(30mg/kg，第2组，图28B)给药恩替卡韦(0.5mg/kg)持续16周，且监测对血清WHV DNA的作用。
图29为比较在慢性WHV感染的土拨鼠中单独用式(IIa)化合物(15mg/kg/天和30mg/kg/天)治疗与用式(IIa)化合物(30mg/kg/天)随后用恩替卡韦(0.5mg/kg/天)治疗对血清WHV DNA(log10)含量的作用的图。
图30为比较在慢性WHV感染的土拨鼠中单独用式(IIa)化合物(15mg/kg/天和30mg/kg/天)治疗与用式(IIa)化合物(30mg/kg/天)随后用恩替卡韦(0.5mg/kg/天)治疗对血清WHsAg含量的作用的图。
图31描述总结在使用慢性感染HBV的六种不同细胞样本的分析中式(IIa)化合物和抗病毒核苷类似物拉米夫定(3TC)与阿德福韦二匹伏酯(ADV)的体外活性(EC50，μM)的表格。在各分析中，每日向细胞中添加式(IIa)化合物、3TC或ADV，连续九天。各细胞样本感染有野生型HBV或变异HBV病毒株，所述变异HBV病毒株包含HBV聚合酶(P)中的突变(例如，M204V、M204I、L180M、L180M/M204V或N236T)。
发明内容
本发明涉及治疗感染有乙型肝炎病毒的受试者的方法，该方法包括给药式(I)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)，或其前药(例如式(II)化合物，例如式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)或其药学上可接受的盐。
定义
如本发明所用，冠词“一("a"和"an")”是指一个或超过一个(例如，至少一个)物品的语法对象。
“约”和“大约”一般意味着在考虑了测量的性质或精度的情况下测得量的可接受的误差程度。示例性误差程度在指定值或值范围的20％以内，典型地在10％以内，且更典型地在5％以内。
如本发明所用，术语“获取(“acquire”或“acquiring”)”作为本发明所用的术语是指通过“直接获取”或“间接获取”物理实体或值来获得该物理实体(例如样本，例如血液样本或肝活检标本)或值(例如，数值)的所有权。“直接获取”指的是进行一个过程(例如，分析方法)来获得物理实体或值。“间接获取”是指接收来自另一方或来源(例如，直接获取物理实体或值的第三方实验室)的物理实体或值。直接获取一个值包括进行一个过程，其包括样本或另一物质的物理变化，例如进行一个分析过程，其包括物质(例如，样本)的物理变化，进行一种分析方法，例如本发明所描述的方法，例如对体液(例如血液)样本的分析，例如通过如质谱分析(例如，LC-MS)或PCR(例如，RT-PCR)。
如本发明所用，能有效地治疗病症(例如，本发明所描述的病症)的化合物、复合物或物质的量，“治疗有效量”、“有效量”或“有效疗程”是指在向受试者单剂量或多剂量给药之后有效地治疗受试者或使患有病症(例如，HBV感染或HBV/HDV共感染)的受试者治愈、缓解、减轻或改良的化合物、物质或组合物的量，其超出在不存在此类治疗的情况下的预期。
如本发明所用，用于病症或疾病的上下文中的术语“预防”("prevent"或"preventing")是指向受试者给药药剂，例如向受试者给药本发明化合物(例如，式(I)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)或前药(例如式(II)化合物，例如式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)，使得与没有施用所述药剂时将看到的相比，所述病症或疾病的至少一种症状的发作被延迟。
如本发明所用，术语“前药”是指在代谢(例如，体内或体外)时产生活性化合物的化合物。在一些实施方案中，前药可为无活性的，或具有低于游离药物的活性，但可提供有利处理、给药或代谢特性。本发明的示例性前药部分可通过羟基、氨基、磷酸酯或核苷酸的硫代磷酸酯主链与游离药物连接，且可包含酯、氨基甲酸酯、羰基、硫酯、酰胺、异氰酸酯、脲、硫脲或其他生理学上可接受的代谢不稳定基团。在一些实施方案中，前药通过酶促水解活化。
如本发明所用，术语“耐受性”或“抗性”是指在给药抗HBV剂之后没有明显减少或灭活的HBV病毒株。在一些实施方案中，耐受性HBV病毒株包含蛋白质(例如，HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白)，其在已知抑制、结合至或改变所述蛋白质的抗HBV剂存在下基本上维持其活性、功能或结构。在一些实施方案中，耐受性HBV病毒株包括与所述蛋白质的参考序列相比具有氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)的蛋白质。在一些实施方案中，具有氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)的HBV蛋白可导致该蛋白质的功能异常或影响抗HBV剂对该蛋白质的抑制。在一些实施方案中，耐受性程度可通过样本(例如，血清样本)中的病毒载量或其他生物标记物的测量，或通过样本(例如，血清样本)中除式(I)或式(II)化合物以外的其他药剂(特定抗病毒剂)的IC50值的测定来确定。
如本发明所用，术语“受试者”意欲包括人类和非人类动物。示例性人类受试者包括患有病症(例如，本发明所描述的病症)的人类患者，或正常受试者。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸡、两栖动物、爬行动物)及哺乳动物，例如非人类灵长类动物、家养和/或农业上使用的动物，例如羊、狗、猫、牛、猪等。在本发明的示例性实施方案中，受试者为土拔鼠(例如，东方土拔鼠(Marmota monax))。
如本发明所用，术语“治疗”患有病症或疾病的受试者是指使受试者经受一种方案，例如给药式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)或药学上可接受的盐，或包含式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)或药学上可接受的盐的组合物，使得该病症或疾病的至少一种症状被治愈、愈合、缓解、减轻、改变、补救、改善或改良。治疗包括给药能有效地缓解、减轻、改变、补救、改善、改良或影响病症或疾病或病症或疾病的症状的量。治疗可抑制病症或疾病的症状的劣化或恶化。
本发明提供了多个范围，例如每天所给药的药物的量的范围。在一些实施方案中，范围包括两个端点。在其他实施方案中，范围不包括一个端点或两个都不包括。作为实例，范围可不包括较低端点。因此，在此类实施方案中，250至400mg/天的范围(不包括较低端点)将涵盖大于250mg/天且小于或等于400mg/天的量。
如本发明在给药疗法的情形下所用的“共同给药”("Co-administration"或"co-administering")或“共同提供”是指同时给药、在给药第二疗法之前(例如，紧接着在小于约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约16小时、约20小时、约24小时、约48小时、约72小时或更多小时之前)给药一种疗法。
如本发明所提及的“疗程”或“治疗的疗程”包括治疗剂(例如，式(I)化合物)或其前药(例如，式(II)化合物)或药学上可接受的盐与恩替卡韦的组合的一次或多次的分开给药。治疗的疗程可包括一个或多个周期的治疗剂。在一些实施方案中，在治疗的疗程内至少一次、至少两次、至少三次、至少四次或更多次向受试者给药治疗剂。受试者可被给药一或多个治疗的疗程。在一些实施方案中，休息时段可插入于治疗的疗程之间。例如，休息时段的长度可为约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约16小时、约20小时或约24小时；或约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天；或约1周、约2周、约3周、约4周或更多周。
如本发明在药物给药周期的情形下所用的“周期”是指向患者给药药物的时间段。例如，如果药物给药4周天数的周期，则周期性给药，例如每日或每日两次则持续4周。药物可给药超过一个周期。在一些实施方案中，第一和第二或后续周期在持续时间和周期性给药中的一个或两者方面相同。在实施方案中，第一和第二或后续周期在持续时间和周期性给药中的一个或两者方面不同。休息时段可插入于周期之间。休息周期的长度可为约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约16小时、约20小时或约24小时；或约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天；或约1周、约2周、约3周、约4周或更多周。
化合物及治疗剂
本发明的特征在于治疗感染有HBV或其耐受性变异体的受试者的方法，其包括给药包含式(I)化合物或其前药或药学上可接受的盐的组合物。活性剂为式(I)化合物，其可通过式(Ia)、式(Ib)和式(Ic)化合物或其组合中的任一个描述：
本发明的组合物可包括式(I)的前药，其中前药部分包含羟基、氨基、磷酸酯、酯、氨基甲酸酯、羰基、硫酯、酰胺、异氰酸酯、脲、硫脲或其他生理学上可接受的代谢不稳定基团。在一些实施方案中，前药通过酶促水解活化。
在一些实施方案中，该前药为式(II)化合物。其前药(例如，式(II)化合物)可通过式(IIa)、式(IIb)和式(IIc)化合物或其组合中的任一个描述：
式(I)及其前药式(II)为结合抗病毒和免疫调节活性的小分子核酸杂交体(二核苷酸)化合物。后一种活性通过刺激先天性免疫应答来介导被病毒感染的肝细胞的受控细胞凋亡，这类似于在HBV感染的患者中通过IFN-α治疗所实现的。
在不希望受理论束缚的情况下，式(I)化合物及其前药式(II)化合物的作用机制可分割成两个部分。第一部分涉及式(I)化合物的宿主免疫刺激活性，其通过病毒传感器蛋白，例如视黄酸诱导性基因1(RIG-I)和含有核苷酸结合寡聚化结构域的蛋白质2(NOD2)的活化来诱导内源性IFN(Takeuchi,O.和Akira S.Cell(2010)140：805-820；Sato,S.等人Immunity(2015)42：123-132；Sabbah,A.等人Nat Immunol(2009)10：1073-1080)。活化可通过式(I)化合物结合在RIG-I/NOD2蛋白的核苷酸结合域处而发生。RIG-I及NOD2蛋白位于细胞(包括肝细胞)的胞质溶胶中，且通常识别外来核酸的签名模式，例如病原体相关的分子模式(PAMP)。一旦识别出病毒RNA或DNA内的PAMP，RIG-1和NOD2就可能被激活并引发IFN信号级联，从而导致产生IFN和干扰素刺激基因(ISG)并诱导细胞中抗病毒状态。在HBV的情况下，据信PAMP为具有被称为ε结构的显著双链RNA结构的前基因组RNA。
式(I)化合物及其前药式(II)化合物的作用机制的第二部分涉及其直接抗病毒活性，其通过病毒聚合酶的空间位阻来抑制病毒核酸合成。位阻可通过式(I)化合物与如上文所描述的RIG-I和NOD2相互作用，随后继而可阻止聚合酶与病毒核酸复制模板(即，HBV前基因组的RNA)结合来进行复制。式(II)化合物(例如，式(IIa)化合物)的细胞毒性潜力已使用一组细胞系初步评估。类似于母体药物，式(II)化合物表现出优异的安全性，其中50％的细胞毒性浓度(CC50)大于1000μM(Coughlin,J.E.等人Bioorg Med Chem Lett(2010)20：1783-1786)。式(II)化合物在针对野生型HBV和针对抗拉米夫定-(3TC)和阿德福韦酯(ADV)的突变HBV的基于细胞的测定中被进一步评价了其抗HBV活性。发现式(II)化合物具有针对野生型HBV的抗病毒活性，其效力在ADV范围内(但小于3TC的效力)。
在一些实施方案中，本发明所描述的方法包括给药式(I)化合物(例如式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)或其药学上可接受的盐。在其他实施方案中，本发明所描述的方法包括给药式(I)的前药(例如式(II)化合物，如式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)或其药学上可接受的盐。在其他实施方案中，本发明方法描述给药由式(I)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)和式(II)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)或其药学上可接受的盐的组合组成的组合物。已经证实，前药式(I)化合物在给药后已显示转化为活性药物式(I)化合物(例如，Rp-和Sp-式(I)异构体)。
本发明所提供的化合物可含有一或多个不对称中心，且因此存在外消旋体及外消旋混合物、单一对映异构体、个别非对映异构体和非对映异构体混合物。这些化合物的所有这些异构形式明确地包括在该范围内。除非另外表示，当化合物由结构命名或描述而没有指定立体化学并具有一个或多个手性中心时，应理解为这代表该化合物的所有可能的立体异构体。在此提供的化合物也可含有连接基(例如，碳-碳键、磷-氧键或磷-硫键)或可限制键旋转(例如由环或双键的存在产生的限制)的取代基。
HBV感染
本发明涉及通过给药式(I)化合物或前药式(II)化合物或其药学上可接受的盐治疗感染有HBV的受试者的方法。HBV是一种包膜DNA病毒，被归类为正嗜肝性DNA病毒属类型，其包含三种其他种类：土拨鼠肝炎病毒(WHV)、绒猴乙型肝炎病毒和地松鼠肝炎病毒。病毒基于存在于病毒包膜蛋白上的抗原性表位被特性化为四种主要血清型(adr、adw、ayr、ayw)，并根据病毒基因组的总核苷酸序列被特性化为八种基因型(基因型A至H)。在一些实施方案中，本发明所描述的方法用于治疗患有任何已知形式的HBV感染(例如，HBV的任何基因型或血清型或其组合)的受试者。
虽然存在对慢性HBV感染的有效抗病毒治疗，但受感染患者通常需要长期或终身治疗。存在用于治疗HBV的五种市售的核苷及核苷酸类似物(例如，拉米夫定、阿德福韦、替诺福韦、替比夫定及恩替卡韦)，但其使用受到限制，因为在治疗期间出现耐药性变异体、在治疗停止之后的复发风险和不必要的副作用。目前HBV治疗的主要挑战为清除肝细胞的细胞核内的病毒性共价闭合环状(ccc)DNA分子，该分子代表HBV基因组，且该病毒被用作合成复制所需的前基因组RNA的模板。目前还没有可用于患者中的直接靶向HBV cccDNA的药物。此病毒分子被治疗诱导的减少的间接证据包括HBV表面抗原(HBsAg)损失，但即使在用目前可用的核苷及核苷酸类似物治疗5年之后，HBsAg的清除以及随后向抗HBsAg(抗-HB)的抗体的血清转化也是罕见事件，并且仅在不到10％的治疗患者中实现。另外，具有抗病毒应答的成功治疗的患者仍显示出HBV诱导的肝病程度显著高于未感染受试者中的程度。
干扰素(例如IFN-α)和替代制剂(例如聚乙二醇化IFN-α)也被许可用于治疗HBV，但是由于不需要的副作用，它们的使用受到限制。另外，在单独给药或与核苷和/或核苷酸类似物组合给药的IFN-α的情况下仍常常的观测到慢性HBV携带者的治疗反应的差异性，但总体大约25-30％的这些患者在2年的药物给药之后达成持续抗病毒应答，包括HBsAg损失。因此，目前HBV治疗的一个目标为研发新的抗病毒化合物，其可在超过三分之一经治疗患者中模拟IFN-α治疗的益处但诱导对HBV复制的抑制、HBsAg清除及抗HBs的血清转化。
HBV及耐药性
本发明进一步涉及通过给药式(I)化合物或前药式(II)化合物或其药学上可接受的盐治疗感染有耐受性HBV变异体的受试者的方法。HBV基因组由编码被称为C、X、P及S的四个已知基因的环状部分双链DNA组成。多个开放阅读框和/或所得基因产物的蛋白酶解加工产生HBV蛋白，其包括表面抗原(HBsAg)、核心蛋白(HBcAg或C)、E抗原(HBeAg或前C)、长表面蛋白(L)、中表面蛋白(M)、聚合酶(P)及X蛋白。
自然地，HBV在宿主内以基因不同但密切相关的病毒体的群体形式存在，部分是由于病毒逆转录酶或聚合酶P的保真度低(Locarnini,S.及Warner,N.Antivir Ther(2007)12增刊3：H15-H23；Coleman,P.F.Emer Infect Dis(2006)12：198-203)。用标准抗HBV剂治疗可消除一些或几乎所有HBV群体，且容易选出对该治疗具有抗性且能够发展成慢性感染的小且可能不可检测的HBV群体。耐药性进一步受其他因素影响，包括但不限于病毒突变频率、抗病毒靶点的可突变性、由抗病毒剂施加的特定选择压力以及抗性株的总体复制适合度(Locarnini,S.及Warner,N.Antivir Ther(2007)12增刊3：H15-H23)。已报告对多种标准抗HBV剂(包括拉米夫定和阿德福韦二匹伏酯)具有抗性的HBV病毒株。
在不受任何特定理论束缚的情况下，耐药型乙型肝炎病毒株可包括特定蛋白质中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，其可导致结构变化，例如构型或空间变化，这影响抗HBV剂结合至该蛋白质并调节其活性的能力(例如通过抑制HBV复制或致病性)。特别地，在活性位点中及周围或抑制剂结合位点附近的氨基酸可以突变，使得蛋白质活性受影响。在一些情况下，氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)可为保守的且不会明显地影响蛋白质的结构或功能。例如，在某些情况下，丝氨酸残基经苏氨酸残基取代不会显著影响蛋白质功能。在其他情况下，氨基酸突变可为更显著的，例如带电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸或赖氨酸)被较大的非极性氨基酸(例如，苯丙氨酸或色氨酸)取代，且因此可对蛋白质功能具有实质性影响。使HBV病毒株对一或多种抗病毒剂具有抗性的突变性质可容易地使用本领域中熟知的标准测序技术(例如，深度测序技术)识别。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株包括HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的变异体或突变形式。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株包括HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的变异体或突变形式(与所述蛋白的可接受的共同序列相比)。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸突变为氨基酸取代。在一些实施方案中，HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸突变为氨基酸加成。在一些实施方案中，HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸突变为氨基酸缺失。
在一些实施方案中，HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸突变包括存在于序列特定位置处的野生型氨基酸残基被选自天然存在的氨基酸之一的另一氨基酸取代。在一些实施方案中，HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白序列中的氨基酸突变包括存在于序列中特定位置处的野生型氨基酸残基被丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸残基的氨基酸取代。
在一些实施方案中，HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸突变包括选自天然存在的氨基酸之一的氨基酸向特定位置处的野生型序列中的氨基酸加成。在一些实施方案中，HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸突变包括选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸残基向特定位置处的野生型序列中的氨基酸加成。
在一些实施方案中，HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸突变包括在野生型序列的特定位置处的氨基酸缺失。在一些实施方案中，HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的氨基酸缺失包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸残基的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括100位氨基酸至200位氨基酸的突变，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括105位氨基酸至160位氨基酸的突变，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括115位氨基酸至155位氨基酸的突变，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括在115、118、120、123、126、129、131、133、134、142、143、144、145或154位氨基酸处的突变，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括T115N、T118V、P120L、P120Q、T126S、Q129H、T131K、M133I、M133L、F134N、F134H、P142L、P142S、T143L、D144A、D144V、G145R或S154P突变。
在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括150位氨基酸至200位氨基酸的突变，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括160位氨基酸至200位氨基酸的突变，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括在161、172、173、175、176、193、194或196位氨基酸处的突变，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括F161H、F161L、W172L、W172*、L173F、L175F、L176V、L176*、S193L、V194F、V194S、I195M、W196L、W196S或W196*突变，例如与参考序列或共同序列相比，其中“*”表示终止密码子。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括60位氨基酸至275位氨基酸的突变，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括80位氨基酸至250位氨基酸的突变，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括在80、169、173、180、181、184、169、202、204、215、233、236或250位氨基酸处的突变，例如与参考序列或共同序列相比。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括在180、204或236位氨基酸处的突变，例如与参考序列或共同序列相比。
在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括N169T、I169T、V173L、L180M、A181T、A181V、T184A、T184C、T184G、T184I、T184L、T184M、T184S、S202C、S202G、S202I、M204I、M204V、N236T、M250I或M250V突变。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括L180M、M204I、M204V或N236T突变，例如如图1中所描绘。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括L180M突变，例如如图1中所描绘。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括M204I突变，例如如图1中所描绘。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括M204V突变，例如如图1中所描绘。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括L180M和M204V突变，例如如图1中所描绘。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括N236T突变，例如如图1中所描绘。
在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括L180M、M204V/I、I169T、V173L及M250V突变。在一些实施方案中，P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括L180M、M204V/I、T184G及S202I/G突变。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括HBsAg和P蛋白两者的序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列或共同序列相比。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括HBcAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括HBeAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括L蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括M蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括X蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的超过一个氨基酸的突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的序列中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个或更多氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白中的仅一个的序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株包括HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或所有序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株可包含除HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白以外的蛋白质中的氨基酸突变。
在上述具体实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括与所述蛋白的可接受的共同序列或参考序列相比，HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的变异体或突变形式。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株对除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的化合物以外的抗HBV剂具有抗性。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株对干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂、非干扰素免疫增强剂或直接作用的抗病毒剂具有抗性，其中每一个都不包括式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株对干扰素(例如，聚乙二醇干扰素)、病毒唑、拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦或AGX-1009或其组合具有抗性。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株对干扰素(例如，聚乙二醇干扰素)具有抗性。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株对病毒唑具有抗性。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株对干扰素(例如，聚乙二醇干扰素)和病毒唑具有抗性。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株对拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦具有抗性。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株对拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯或恩替卡韦具有抗性。在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒变异株对超过一种抗HBV剂具有抗性。
在一些实施方案中，除式(I)或式(II)化合物以外的抗HBV剂在感染有耐药型乙型肝炎病毒变异株的样本中的IC50高于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐的IC50。在一些实施方案中，除式(I)或式(II)化合物以外的抗HBV剂的IC50比式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐的IC50高多于约5％、多于约10％、多于约15％、多于约20％、多于约25％、多于约30％、多于约35％、多于约40％、多于约45％、多于约50％、多于约55％、多于约60％、多于约65％、多于约70％、多于约75％、多于约80％、多于约85％、多于约90％或多于约95％。在一些实施方案中，除式(I)或式(II)化合物以外的抗HBV剂的IC50为式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐的IC50的约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约35倍或约50倍。
HDV感染
本发明进一步涉及通过给药式(I)化合物或前药式(II)化合物或其药学上可接受的盐与恩替卡韦或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺)的组合治疗患有HDV(例如，HBV与HDV共感染)的受试者的方法。丁型肝炎(HDV)为小环状包膜RNA病毒且为δ病毒属的唯一成员。环状基因组包含1,700个核苷酸且仅编码单一蛋白质，即HDV表面抗原(HDAg)。由于HDV不产生包膜蛋白，病毒不能自行产生子代病毒粒子且需要宿主细胞与HBV共感染以完成病毒复制。病毒复制机制使用HBV衍生的包膜蛋白来产生并包裹成熟病毒体以传播毒性。HDV根据病毒基因组的总核苷酸序列被特性化为八种主要血清型(HDV-1、HDV-2、HDV-3、HDV-4、HDV-5、HDV-6、HDV-7和HDV-8)。在一些实施方案中，本发明所描述的方法使用与恩替卡韦或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺)的组合来治疗患有HBV和HDV共感染的受试者。HBV和HDV可包括任何HBV或HDV基因型，或HBV和HDV的不同基因型的组合。
药物组合物
本发明的特征在于治疗感染有HBV的受试者的方法，所述方法包括给药式(I)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)或其前药(例如式(II)化合物，例如式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)或其药学上可接受的盐。HBV感染可包括具有一或多个耐受性HBV病毒株的感染。本发明进一步包括治疗感染有HBV或HDV(例如，HBV和HDV的共感染)的受试者的方法，所述方法包括给药式(I)化合物(例如，式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)化合物)或其前药(例如式(II)化合物，例如式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)或其药学上可接受的盐，与恩替卡韦或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺)的组合。
虽然本发明化合物(例如，式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)可单独给药，但优选所述化合物作为药物组合物或制剂给药，其中所述化合物与一或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体组合。根据本发明的化合物可配制用于以适用于人类或兽用药物的任何适宜方式给药。在一些实施方案中，包括在药物制剂中的化合物自身可具有活性，或可为前药(例如式(II)化合物，例如式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)化合物)，例如能够在生理环境下转化为活性化合物。无论选择何种给药途径，例如下文所描述的或者通过本领域技术人员已知的其他常规方法，可以以合适的水合物形式使用的本发明化合物和/或本发明的药物组合物被配制成药学上可接受的剂型。
本发明化合物(例如，式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)在药物组合物中的量和浓度，以及向受试者给药的药物组合物的量可基于临床相关因素选择，例如受试者的医学相关特征(例如，年龄、体重、性别、其他医学病状等)、化合物在药物组合物中的溶解性、化合物的效力和活性、以及药物组合物的给药方式。对于给药途径和剂量方案的进一步信息，读者参考Comprehensive Medicinal Chemistry第5卷第25.3章(Corwin Hansch；Chairman of Editorial Board)，Pergamon Press 1990。
因此，本发明的另一方面提供药学上可接受的组合物，其包含治疗有效量或预防有效量的本发明所描述的化合物(例如，式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)，其与一或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。如下文详细描述的，本发明的药物组合物可专门配制用于以固体或液体形式给药，包括适于经口或肠胃外给药的那些形式，例如通过口服剂量，或通过皮下、肌内或静脉内注射例如无菌溶液或悬浮液。然而，在一些实施方案中，主题化合物可以仅仅是溶解或悬浮在无菌水中。在一些实施方案中，药物制剂是无热原的，即不提高患者的体温。
如本发明所用的术语“全身给药”、“全身地给药”、“外周给药”和“外周地给药”指的是该化合物不是直接施用到中枢神经系统中，而是进入患者的系统，因此进行代谢和其他类似的过程，例如皮下给药。
术语“药学上可接受的”在本发明中用于指在合理医学判断范畴内，适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理益处/风险比相匹配的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
如本发明所用的术语“药学上可接受的载体”指的是药学上可接受的物质、组合物或介质，例如液体或固体填充剂、稀释剂、稳定剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其涉及将主题拮抗剂从身体的一个器官或部分携带或运输到身体的另一个器官或部分。每种载体在与制剂的其他成分相容并且对病人无害的意义上必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的物质的一些实例包括但不限于：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如丙三醇、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)抗坏血酸；(17)无热原的水；(18)等渗盐水；(19)林格氏溶液；(20)乙醇；(21)磷酸盐缓冲溶液；(22)环糊精，例如和(23)药物制剂中使用的其他无毒相容的物质，例如抗氧化剂和抗菌剂。
如上文所述，本发明所描述的化合物的一些实施方案可含有碱性官能团，例如胺，且因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。就此而言，术语“药学上可接受的盐”是指相对无毒的本发明化合物的无机和有机酸加成盐。这些盐可在本发明化合物最终分离和纯化期间原位制备，或者通过将纯化的游离碱形式的本发明化合物与合适的有机或无机酸单独反应，并分离由此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等(参见，例如Berge等人(1977)"Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.66：1-19)。
在其他情况下，本发明化合物可含有一或多个酸性官能团，且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”在这些情况下是指本发明化合物(例如，式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物))的相对无毒的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可在化合物最终分离和纯化期间原位制备，或者通过将游离酸形式的纯化化合物与合适的碱(例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、与氨或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺单独反应来制备。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见例如，Berge等人，见上文)。
湿润剂、乳化剂和润滑剂(例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包衣料、甜味剂、调味剂和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
药学上可接受的载体以及湿润剂、乳化剂、润滑剂、着色剂、脱模剂、包衣衣料、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂以及其他额外组分可以本发明所描述的组合物的约0.001％至99％的量存在。例如，所述药学上可接受的载体以及湿润剂、乳化剂、润滑剂、着色剂、脱模剂、包衣衣料、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂以及其他额外组分可以本发明所描述的组合物的约0.005％、约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.25％、约0.5％、约0.75％、约1％、约1.5％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约85％、约90％、约95％或约99％存在。
本发明的药物组合物可呈适合于经口给药的形式，例如液体或固体口服剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、散剂、糖衣丸或散剂。该药物组合物可呈适合于单次给药精确剂量的单位剂型。除本发明所描述的化合物(例如，式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物))或其药学上可接受的盐之外，药物组合物还可包含药学上可接受的载体，且可任选进一步包括一或多种药学上可接受的赋形剂，例如稳定剂(例如粘合剂，例如聚合物，例如沉淀抑制剂、稀释剂、粘合剂及润滑剂。
在一些实施方案中，本发明所描述的组合物包含用于经口给药的液体剂型，例如溶液或悬浮液。在其他具体实施方案中，本发明所描述的组合物包含用于经口给药且能够直接压成片剂的固体剂型。另外，所述片剂可包含其他药用或医药试剂、载体和/或佐剂。示例性药物组合物包括压制片剂(例如，直接压制片剂)，例如包含本发明化合物(例如，式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物))或其药学上可接受的盐。
本发明的制剂包括适合于肠胃外给药的那些制剂。制剂可适宜地以单位剂量形式呈现，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主、特定给药模式而变化。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量一般为产生治疗作用的化合物的量。一般而言，此量(以百分比计)将为约1％至约99％的活性成分，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。适合于肠胃外给药的本发明药物组合物包括本发明化合物以及一或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，或可以在使用之前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌散剂，该组合物可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得制剂与指定接受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。
在一些实施方案中，提供本发明化合物(例如，式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物))与额外药剂(例如，恩替卡韦或替诺福韦)的组合作为组合物。例如，化合物可与恩替卡韦或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)组合制备为固定剂量复合剂。该固定剂量复合剂可配制用于经口给药，例如呈固体剂型或液体剂型。在一些实施方案中，该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。在一些实施方案中，该固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸或散剂。
可用于本发明的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。例如，通过使用如卵磷脂的包衣材料，通过在分散体的情况下维持所需的粒度，并通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物也可含有佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等来确保对微生物作用的预防。将等渗剂如糖、氯化钠等包括在组合物中也是可取的。另外，可注射的药用形式的延长吸收可通过包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来达成。
在一些情况下，为了延长本发明化合物(例如，式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物))的效果，可需要减缓药物自皮下或肌内注射的吸收。这可以通过使用具有差的水溶性的结晶或无定形材料的液体悬浮液来完成。药物的吸收速率取决于其溶出速率，其又取决于晶体大小和晶型。或者，通过使化合物溶解或悬浮于油性介质中来实现本发明化合物的肠胃外给药形式的延迟吸收。
在一些实施方案中，持续施用本发明的化合物(例如式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物))可以是有利的。应当理解，可使用提供持续吸收特征的任何制剂。在一些实施方案中，持续吸收可通过将本发明的化合物与减缓其释放特性的其它药学上可接受的成分、稀释剂或载体组合到体循环中来实现。
给药途径
正如本领域技术人员将理解的，用于本发明所描述的方法中的化合物和组合物可根据所选给药途径以各种形式给药至受试者。用于本发明所描述的方法的组合物的示例性给药途径包括局部、经肠或肠胃外施用。局部施用包括但不限于经皮、吸入、灌肠、滴眼剂、滴耳剂及通过体内粘膜施用。经肠施用包括经口给药、直肠给药、阴道给药及胃饲管。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、囊内、眶内、心内、真皮内、经气管、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、胸骨内(intrastemal)、腹膜内、皮下、肌内、经上皮、经鼻、肺内、鞘内、直肠和局部给药模式。可通过在所选时间段内连续输注来进行肠胃外给药。在本发明的一些实施方案中，本发明所描述的包含式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)的组合物是经口给药。在本发明的其他具体实施方案中，本发明所描述的包含式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)的组合物是经静脉内给药。
在实施方案中，本发明所描述的包含式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)的组合物与恩替卡韦或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)组合经口给药。在实施方案中，在经口给药恩替卡韦或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)之前或之后经口给药本发明所描述的包含式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)的组合物。
在本发明的其他实施方案中，本发明所描述的包含式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)的组合物是肠胃外(例如，腹膜内)给药。在实施方案中，本发明所描述的包含式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)的组合物与恩替卡韦或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)组合经肠胃外给药。在实施方案中，在经口给药恩替卡韦或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)之前或之后经肠胃外给药本发明所描述的包含式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)的组合物。
对于静脉内、腹膜内或鞘内递送或直接注射，该组合物必须为无菌的且流动程度使组合物可通过注射器递送。除水之外，载体可为等渗缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可通过使用例如卵磷脂的包衣料，通过在分散体的情况下维持所需粒度并通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇或山梨糖醇)和氯化钠。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝或明胶来实现。
给药途径的选择将根据是否实现局部或全身效果而定。例如，对于局部效果，该组合物可配制用于局部给药且在需要其作用的部位直接施用。对于全身长期效果，可将该组合物配制用于经肠给药并通过消化道给予。对于全身性、即时性和/或短期效果，可将组合物配制成肠胃外给药，并通过消化道以外的途径给予。
剂量
通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的组合物配制成可接受的剂型。本发明组合物(例如式(I)化合物或其前药(例如式(II)化合物)中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得一定量的活性成分，其对于特定受试者、组合物和给药模式而言有效地实现了期望的治疗反应，而不会对受试者产生毒性。所选剂量水平将根据多种药物代谢动力学因素而定，该因素包括所用的本发明特定组合物的活性；给药途径；给药时间；待使用的特定药剂的吸收速率；治疗持续时间；与所用特定组合物组合使用的其他药物、物质和/或材料；待治疗受试者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和先前医疗史；以及医学技术中熟知的类似因素。具有本领域普通技术的医生或兽医可以容易地确定和开具有效量的所需组合物。例如，医生或兽医可以以低于为了实现所需治疗效果所需水平的水平开始在组合物中使用的本发明物质的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。一般而言，本发明组合物的合适每日剂量将为能有效地产生治疗效果的最低剂量的物质的量。该有效剂量一般将根据上文所描述的因素而定。优选地，治疗性组合物的有效每日剂量可以以在一天中以适当的间隔分开施用的2、3、4、5、6或更多个亚剂量、任选地以单位剂量形式给药。
优选的治疗剂量水平为每天向患有本发明所描述的病症(例如，HBV感染)的受试者给药(例如，经口或腹膜内)约0.1mg/kg至约1000mg/kg(例如，约0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg或1000mg/kg)的组合物。优选的预防剂量水平为每天向受试者给药(例如，经口或腹膜内)约0.1mg/kg至约1000mg/kg(例如，约0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg或1000mg/kg)的组合物。该剂量也可被滴定(例如，剂量可逐渐递增直至出现毒性病征，例如头痛、腹泻或恶心)。
治疗频率也可变化。受试者可每天进行一次或多次(例如，一次、两次、三次、四次或更多次)治疗或每若干小时(例如，约每2、4、6、8、12或24小时)进行一次治疗。该组合物可每24小时给药1或2次。治疗时程可为不同持续时间，例如两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天或更多天、两周、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月或超过一年。例如，治疗可为一日两次持续三天，一日两次持续七天，一日两次持续十天。治疗周期可以例如每周一次、两月一次或每月一次的时间间隔重复，其由不给予治疗的时段间隔开。治疗可为单次治疗或可持续长达受试者的寿命(例如，许多年)。
患者选择及监测
本发明所描述的本发明方法涉及给药式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)或其药学上可接受的盐以用于治疗HBV感染(例如，耐受性HBV感染)。本发明所描述的方法进一步涉及给药式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)或其药学上可接受的盐与恩替卡韦或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的组合以用于治疗感染有HBV或HDV(例如，HBV与HDV共感染)的受试者。因此，可通过首先评估患者和/或受试者以确定受试者是否感染有HBV或HDV并确定病毒的血清型和基因型分类来选择患者和/或受试者，以用于使用式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)或其药学上可接受的盐治疗。可使用本领域已知的方法评估受试者具有HBV或HDV感染。也可例如在给药本发明所描述的化合物(例如，式(I)化合物或其前药(例如，式(II)化合物)或其药学上可接受的盐之后监测受试者。
在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，受试者为成人。在一些实施方案中，受试者患有急性形式的HBV感染。在一些实施方案中，受试者患有慢性形式的HBV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有乙型肝炎(例如，急性或慢性乙型肝炎)。
在一些实施方案中，HBV感染的基因型为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型A(例如，HBV-A1-7)、HBV基因型B(例如，HBV-B2-5)、HBV基因型C(例如，HBV-C1-16)、HBV基因型D(例如，HBV-D1-7)、HBV基因型E、HBV基因型F(例如，HBV-F1-4)、HBV基因型G、HBV基因型H、HBV基因型I或HBV基因型J。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型A(例如，HBV-A1-7)、HBV基因型B(例如，HBV-B2-5)、HBV基因型C(例如，HBV-C1-16)、HBV基因型D(例如，HBV-D1-7)、HBV基因型E、HBV基因型F(例如，HBV-F1-4)、HBV基因型G或HBV基因型H。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型A(例如，HBV-A1-7)。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型B(例如，HBV-B2-5)。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型C(例如，HBV-C1-16)。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型D(例如，HBV-D1-7)。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型E。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型F(例如，HBV-F1-4)。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型G。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型H。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型I。在一些实施方案中，受试者感染有HBV基因型J。
在一些实施方案中，耐药型乙型肝炎病毒株包括HBV基因型A(例如，HBV-A1-7)、HBV基因型B(例如，HBV-B2-5)、HBV基因型C(例如，HBV-C1-16)、HBV基因型D(例如，HBV-D1-7)、HBV基因型E、HBV基因型F(例如，HBV-F1-4)、HBV基因型G、HBV基因型H、HBV基因型I或HBV基因型J。
在一些实施方案中，受试者为非人类哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为土拔鼠，例如东方土拔鼠。东方土拔鼠(Marmota monax)天生地感染有土拔鼠肝炎病毒(WHV)，其为在基因上与人类HBV密切相关的嗜肝性DNA病毒。土拨鼠的WHV新生儿感染类似人类慢性HBV感染(垂直)传播的主要途径，且显示类似于HBV感染患者的疾病时程。因此，土拨鼠中慢性WHV感染为研究CHB和HBV诱导的HCC的完全免疫活性模型，且已广泛使用慢性WHV携带者来评估目前的和新的HBV治疗剂的功效和安全性。近期对患有急性自限性和慢性嗜肝病毒感染的土拨鼠和人类的肝脏转录谱进行比较，发现其在抗病毒免疫应答方面具有重要的相似性，并在WHV和HBV诱导的HCC中表现出分子相似性。由于这些研究已确定此动物模型的CHB的翻译值，患有慢性WHV感染的土拨鼠可用于评估与治疗相关的抗病毒功效、安全性和药效学。
在一些实施方案中，受试者是初治患者。在一些实施方案中，受试者先前已针对HBV感染进行治疗。在一些实施方案中，受试者患有复发性HBV感染。在一些实施方案中，受试者已用除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂治疗，且患有复发性HBV感染。在一些实施方案中，受试者已用干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂或免疫增强剂治疗，且患有复发性HBV感染。在一些实施方案中，受试者已用干扰素，例如聚乙二醇干扰素α(例如，聚乙二醇干扰素α-2a或聚乙二醇干扰素α-2b)治疗，且患有复发性HBV感染。在一些实施方案中，受试者已用病毒唑治疗，且患有复发性HBV感染。在一些实施方案中，受试者已用核苷类似物，例如拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦或AGX-1009治疗，且患有复发性HBV感染。在一些实施方案中，受试者已用非核苷抗病毒剂，例如NOV-225、BAM 205、Myrcludex B、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV治疗，且患有复发性HBV感染。在一些实施方案中，受试者已用免疫增强剂，例如日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620治疗，且患有复发性HBV感染。
在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝硬化。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有肝细胞癌且等待肝移植。
在一些实施方案中，受试者已进一步诊断出患有HIV感染。在一些实施方案中，HIV感染的病毒株为已知的。在一些实施方案中，受试者感染有HIV-1或HIV-2(例如，病毒株1或病毒株2)。
在一些实施方案中，受试者患有HBV感染和HDV感染(例如，HBV和HDV共感染)。在一些实施方案中，受试者患有慢性形式的HBV或HDV感染。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有乙型肝炎(例如急性或慢性乙型肝炎，例如急性或慢性乙型肝炎的耐受性变异体)。在一些实施方案中，受试者已诊断出患有丁型肝炎(例如，急性或慢性丁型肝炎)。在一些实施方案中，HDV感染的基因型为已知的。在一些实施方案中，受试者是初治患者。在一些实施方案中，受试者已接受先前HDV治疗。
组合疗法
在一些实施方案中，额外治疗剂可与本发明组合物一起给药以用于治疗HBV或其任何症状或相关病状。当使用组合疗法时，额外治疗剂可作为单独制剂给药或可与本发明所描述的组合物中的任一种组合。
例如，本发明所描述的方法中的任一个可进一步包括给药治疗有效量的额外药剂与式(I)或式(II)化合物组合。在一些实施方案中，额外药剂为抗病毒剂或抗癌剂。在一些实施方案中，抗病毒剂包括干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂或非干扰素免疫增强剂。在一些实施方案中，干扰素包括干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。在一些实施方案中，核苷类似物包括拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦、替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦或AGX-1009。在一些实施方案中，抗病毒剂为恩替卡韦。在一些实施方案中，抗病毒剂为替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)。在一些实施方案中，抗病毒化合物包括NOV-225、BAM 205、MyrcludexB、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。在一些实施方案中，非干扰素免疫增强剂包括日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。在一些实施方案中，抗病毒剂为衣壳蛋白抑制剂、进入抑制剂、分泌抑制剂、微RNA、反义RNA剂、RNAi剂或被设计成抑制病毒RNA的其他药剂。在一些实施方案中，抗癌剂选自氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、多柔比星、长春新碱、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、依托泊甙、顺铂、表柔比星和甲苯磺酸索拉非尼。
组合给药可以通过本领域技术人员显而易见的任何技术进行，包括例如单独的、顺序的、同时的和交替的给药。如本发明所用，“组合给药”或两种或更多种药剂的组合给药指的是两种或更多种药剂(例如本发明所述的化合物)同时或在一定的时间间隔内给药于受试者，使得每种药剂对患者的作用存在重叠。优选地，它们的施用彼此间隔在15、10、5或1分钟内。在一些实施方案中，式(I)或式(II)化合物与额外药剂的组合具有协同或累加效应。在一些实施方案中，术语“累加”是指其中当两种药剂组合使用时，药剂的组合以等于但不大于每种药剂的单独的抗HBV活性的总和的方式起作用。
在一些实施方案中，术语“协同作用”或“协同的”是指其中当联合使用两种药剂时，所述药剂的组合起作用，从而每种单独药剂的所需浓度低于不存在其他药剂时有效所需的浓度。在一些实施方案中，协同效应导致降低一种或两种药剂的最小抑制浓度，使得该效应大于各效应总和。协同效应大于累加效应。在一些实施方案中，本发明组合物中的药剂可显示出协同效应，其中特定浓度下的抗HBV活性为任一单独药剂的抗HBV活性或是任一单独药剂的抗HBV活性的至少约1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、4、5、10、12、15、20、25、50或100倍。优选地，药剂的给药间隔足够靠近，从而实现组合效应(例如协同效应)。
该组合可在用于治疗患有HBV感染、耐受性HBV感染或HBV/HDV共感染的受试者时具有协同效应。该药剂可例如以组合单位剂量同时给药(提供两种药剂的同时递送)。或者，该药剂可以指定时间间隔，例如分钟、小时、天数或周数的时间间隔给药。一般而言，该药剂在受试者中为同时生物可用的，例如可检测的。
在另一方面中，本发明的特征在于通过给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐与恩替卡韦或替诺福韦(例如，替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺)的组合治疗感染有HBV或HBV/HDV的受试者的方法。在一些实施方案中，式(II)化合物与恩替卡韦或替诺福韦的组合具有协同或累加效应。在一些实施方案中，术语“累加”是指当两种药剂组合使用时，药剂的组合以等于但不大于每种药剂各自的抗HBV或抗HDV活性的总和的方式起作用。
实施例
实施例1.式(Ia)化合物在土拔鼠HBV感染模型中的抗病毒活性。
实验研究
在此研究中使用三组五只慢性WHV携带者土拨鼠。将式(Ia)化合物腹膜内向两组给药持续总计4周。用于药物治疗的组接受10mg/kg/天或30mg/kg/天的式(Ia)化合物。第三组腹膜内接受生理盐水且作为经安慰剂治疗的对照组。
用于WHV血清学、血清HBV DNA以及血液学和生物化学特征的血液样本是在开始治疗之前获得且在其之后根据研究设计取用。在将土拨鼠麻醉并抽血时记录各受试者的体重。将经药物治疗的土拨鼠所记录的体重与经安慰剂治疗的对照组土拨鼠进行比较以评估可能的药物毒性。使用已建立的ELISA方案定性确定WHsAg和抗WHs和抗WHc抗体。使用血清稀释液以确保在饱和条件下检测这些标记物。
血清中的WHV DNA最初通过斑点印迹杂交测量，并通过使用同源探针比较测试样本的信号和已知WHV DNA浓度的标准来定量。此分析的检测限值为1×107病毒基因组当量/毫升。还使用实时PCR分析对含有低于斑点印迹分析检测极限的血清WHV DNA的样品进行定量WHV核酸分析。
根据研究计划，在全身麻醉下使用由超声成像引导的16号一次性活检针获得肝活检。将针在腹部中线尾侧附近位点插入到胸骨剑突，且经背外侧及头侧(cranially)直接进入到肝左外叶中。使用标准条件处理活检标本以用于组织病理学检查。将组织切片通过免疫组织化学进行染色以用于WHcAg和膜结合和细胞质WHsAg，并将这些研究的结果表示为计数细胞的百分比。还进行核酸分析。将表现出危及生命疾病的临床症状的土拨鼠实施安乐死。
研究结果
肝中的WHVDNA和WHV抗原。获得在用式(Ia)化合物治疗之前、在用式(Ia)化合物治疗数周之后、以及随后在研究之后在随访期间8周和16周的肝活检。这些肝活检标本显示，治疗和未治疗的土拨鼠之间的门脉肝炎和小叶性肝炎/坏死评分明显不同。
在第4周治疗期间结束时，用较高剂量的式(Ia)化合物(30mg/kg)治疗的细胞质WHcAg I肝组织的染色强度与安慰剂对照组相比显著降低(p，0.05)。经式(Ia)化合物治疗的各组中的每只土拨鼠在治疗期间显示WHcAg和WHsAg的肝表达暂时降低。停药后，存活的土拨鼠中的两种病毒标记物均增加，并且与安慰剂类似。在药物治疗期间WHcAg和WHsAg的肝表达暂时下降的土拨鼠在血清WHsAg和/或血清WHV DNA中也同样具有更显著的短暂下降。
血清中的WHVDNA及WHV抗原。用10mg/kg/天剂量的式(Ia)化合物治疗4周显示1.7至2.7个对数单位的WHV DNA下降。在治疗期间第1周、第2周、第3周和第4周，血清WHV病毒血症与经安慰剂治疗的对照组相比显著减少(p<0.05)。用30mg/kg/天剂量的式(Ia)化合物治疗诱导对该组中所有土拨鼠中的血清WHV DNA产生更快的作用，降低了2.4至4.2个对数单位。在停药后注意到病毒载量的缓慢回升。在研究期间在经安慰剂治疗的对照组土拨鼠中未观测到血清WHV DNA浓度的显著变化。
大多数土拨鼠在治疗期间未显示出明显的血清WHsAg变化。在治疗期间在任一土拨鼠中未观察到抗WHc抗体应答的变化。
此研究的结果表明式(Ia)化合物单一疗法在慢性WHV携带者土拨鼠中在治疗剂量和治疗持续时间下诱导抗病毒应答。基于剂量-响应基础，没有观察到血清WHsAg以及WHcAg和WHsAg的肝表达的一致降低，然而，在治疗期间两个给药组中的个别土拨鼠具有显著降低。
实施例2.在土拔鼠慢性乙型肝炎模型中与经口给药式(IIa)化合物的反应相关的抗病毒功效和免疫。
实验程序
将含赋形剂的式(IIa)化合物的剂量与土拨鼠饮食粉(Dyets，Bethlehem，PA)干混，随后将混合的药物悬浮于超纯水(来自J.T.Baker的高效液相色谱(HPLC)水)中。在制备药物之后1/2小时内向土拨鼠经口给药式(IIa)化合物。
此研究中所用的所有土拨鼠均在圈养下出生且在3日龄感染有含有WHV病毒株7-11(WHV7)的cWHV7P2a接种物。cWHV7P2a与亲本cWHV7P2接种物具有相同的生物学及病毒学特征，因为两者均衍生自cWHV7P1。慢性感染的动物的血清WHV DNA和WHV表面抗原(WHsAg)经确认为阳性，且在感染后大约1年具有不可检测的抗WHsAg的抗体(抗WHs)。通过超声检查确认具有低γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的土拨鼠中不存在肝肿瘤。按照性别、体重和治疗前血清标志物(WHV DNA和WHsAg负载量以及血清GGT和山梨醇-脱氢酶(SDH)水平)将慢性WHV载体土拨鼠指定并分成两组(每组n＝5)。土拨鼠每日经口用低剂量(15mg/kg)或高剂量(30mg/kg)的式(IIa)化合物治疗12周。对于选择的测定，包括来自五只年龄匹配的慢性WHV携带者土拨鼠的血液和肝脏样品，以用于比较未处理的动物中免疫应答基因的基础表达水平与经式(IIa)化合物治疗的动物中的治疗前水平。
在治疗前(T0)且随后在整个研究中每两周评估一次式(Ia)化合物的血浆含量，在给药后大约2小时进行。土拔鼠血浆是通过LC-MS分析且使用经同位素富集的内标进行定量。
根据血清浓度，如前所述，在7500实时PCR系统仪器(Applied Biosystems，FosterCity，CA)上通过斑点印迹杂交或实时PCR测定，每周定量一次WHV DNA(Menne,S.等人Antimicrob Agents Chemother(2008)52：3617-3632)。如前所述，通过WHV特异性酶免疫测定每周测量一次WHsAg和抗WHs的血清水平(Cote,P.J.等人Viral Immunol(1993)6：161-169)。使用血清样本稀释液以确保在饱和条件下检测这些标记物。两种标记物分别用已知浓度的WHsAg(较低灵敏度：50ng/mL血清)或抗WHs(较低灵敏度：100标准(Std)U/mL血清)的土拨鼠血清的标准曲线定量。
在治疗前(第-1周)、治疗期间(第6周)、治疗结束时(第12周)及研究结束时(第20周)所收集的肝活检标本中确定WHV核酸的肝含量。如先前所述，通过Northern印迹杂交定量测量WHV RNA(Peek，S.F.等人Hepatalogy(2001)33：254-266)。如先前所述，通过Southern印迹杂交定量测定WHV DNA复制中间体(RI)和WHV共价闭合环状(ccc)DNA(Jacob,J.R.等人Antiviral Res(2004)63：115-121)。将福尔马林固定的肝活检标本的石蜡切片用苏木精和曙红(H&E)染色，并用如上所述的1:350稀释的抗WHV核心抗原(WHcAg)的抗体免疫染色(Cote,P.J.等人Hepatalogy(2000)31：190-200；Peek,S.F.等人Hepatalogy(2001)33：254-266)。如先前所述，使用土拨鼠特定标准进行WHV抗原表达的组织病理学检查和评估(Peek,S.F.等人Hepatalogy(2001)33：254-266)。HD组的两只土拨鼠的肝也分别使用1：125或1：200稀释度，按照制造商的说明书，用抗RIG-I和NOD2的交叉反应抗体(OrigeneTechnologies,Rockville,MD)免疫染色。
与式(IIa)化合物治疗相关的免疫应答使用PCR技术通过IFN-α、IFN-β、IFN-γ诱导的蛋白10(IP-10或CXCL10)、白细胞介素6(IL-6)、干扰素诱导的17kDa蛋白(ISG15)和2'-5'-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)在血液和肝中的RNA转录水平的变化来确定。在治疗前(第-1周和T0)、治疗期间(第6周和第12周)及随访期间(第18周)将全血收集至PAXgene血液管(Qiagen,Redwood City,CA)中，且储存在-70℃下直至使用。使用PAXgene血液miRNA试剂盒(Qiagen)，通过柱上脱氧核糖核酸酶(DNase)I消化，分离总RNA。在治疗前(第-1周)，治疗期间(第6和12周)以及研究结束(第20周)时，使用RNA抽提试剂盒(Qiagen)，使用无RNA酶的DNA抽提系统(Qiagen)，用柱上脱氧核糖核酸酶(DNase)I消化从收集的肝活检标本中进一步分离总RNA。用寡核苷酸(dT)用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)逆转录mRNA后，使用TaqMan Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems)以及土拔鼠特异性引物和探针(补充表1)在7500实时PCR系统仪器(Applied Biosystems)上扩增互补的(c)DNA样本。使用土拔鼠18S rRNA表达来标准化靶基因表达。使用式2-△△Ct将靶基因的转录水平计算为相对于在第-1周(肝)或在T0(血液)时的治疗前水平的倍数变化。分析来自LD组和HD组的土拨鼠子集的样品中式(IIa)化合物诱导的与RIG-I/NOD2途径有关的基因的表达变化，包括RIG-I、NOD2、跨膜蛋白173(TMEM173或STING)、干扰素调节因子3(IRF3)和IRF7。
在整个研究中每周至每月一次，获得不同测量值(体重、体温、临床化学和血液学)以监测药物安全性。使用具有相同方差的非配对的Student's t-检验，比较治疗前和两个剂量组之间的血清和肝脏WHV参数、宿主免疫应答参数和药物安全性参数。P值<0.05被认为是显著性差异。
结果
在慢性WHV携带者土拨鼠中的式(IIa)化合物的疗效研究。在慢性感染有WHV的成年土拨鼠中的单次药剂、重复剂量疗效研究中评估式(IIa)化合物的抗病毒效力。为了模拟人类中的垂直传播，通过新生儿WHV感染建立这些动物的慢性感染。将两组5只土拨鼠各自每日经口用低剂量(15mg/kg)或高剂量(30mg/kg)的式(IIa)化合物治疗12周。在治疗停止后，随后再追踪动物8周，直到在20周研究结束(预定的安乐死时间)。
治疗慢性WHV携带者土拨鼠导致式(IIa)化合物的剂量依赖性血浆暴露。在治疗期间，在经口给药15和30mg/kg之后，式(IIa)化合物的血浆暴露为剂量依赖性的，且与治疗前水平相比统计学上显著增加(p<0.05)，且在与低剂量组相比时，高剂量组也如此(图9和10)。
对慢性WHV携带者用式(IIa)化合物治疗诱导了对剂量依赖性血清病毒血症的抑制。式(IIa)化合物治疗诱导了血清WHV DNA相比于T0治疗前水平显着降低，这在治疗的第一周早已被注意到(图2A-2C)。在所有治疗过的土拨鼠中观察到式(IIa)化合物诱导的病毒血症降低，但在给药较高剂量的动物中比在用较低剂量治疗的动物中更显著和持久。WHVDNA的剂量依赖性下降在所有土拨鼠中一致地发生，但是在用较高剂量(F3027和F3030)治疗的两只动物中注意到抗病毒应答的一些差异性。在低剂量组和高剂量组中，平均病毒载量在治疗12周期间逐渐减少，且WHV DNA每6或3周分别减少约1log10。在第12周治疗结束时，低剂量组和高剂量组的WHV DNA平均降低分别为2.2或3.7log10(图2C和图4A)。治疗结束后，在8周随访期间，在所有土拨鼠中均观察到病毒载量的反弹，并且WHV DNA逐渐升高至治疗前水平。在用低剂量治疗的土拨鼠中，WHV DNA在式(IIa)化合物停药后3-5周内恢复至治疗前水平，但给予较高剂量的动物在2-4周内延迟了复发，因为在停药后5-7周才达到治疗前水平。高剂量组中具有最显著的WHV DNA减少的两只土拨鼠(F3027和F3030)在病毒载量方面也具有最延迟的反弹。低剂量组和高剂量组在第1-15周或第1-17周的平均病毒载量与T0治疗前水平相比分别显著降低(所有的p<0.05)。另外，在2-17周期间高剂量组的平均病毒载量显著低于低剂量组(所有的p<0.05)。
式(IIa)化合物治疗诱导了剂量依赖性的血清抗原血症减少但无血清转化。式(IIa)化合物给药在所有经治疗的土拨鼠中引起血清WHsAg相比于在T0时的治疗前含量的剂量依赖性减少(图2D-2E)，且血清WHV e抗原(WHeAg)也如此。早在第二周治疗时就观察到抗原血症减少，且在用较高剂量治疗的土拨鼠中，特别是在具有更显著的病毒血症减少的两种动物(F3027和F3030)中更显著和持久。在12周治疗之后，在低和高剂量组中观察到的最大WHsAg减少分别为0.5或1.6log10(图2F和图4B)。在式(IIa)化合物停药后，注意到抗原负载逐渐反弹至治疗前水平。在用较低剂量治疗的土拨鼠中，WHsAg在完成治疗之后1-5周内复原至治疗前含量。在给药较高剂量的动物中，观察到抗原反弹延迟了1-7周，且在治疗结束之后6-8周达到治疗前水平。与在T0时的治疗前含量相比，低剂量组和高剂量组的平均抗原负载在第10-14周或第9-16周期间显著降低(所有的p<0.05)，且在第11-16周期间高剂量组相比于低剂量组显著降低(所有的p<0.05)。在施用的剂量下给药式(IIa)化合物12周时，在经治疗的土拨鼠无法中产生可检测的WHsAg(和WHV DNA)的完全损失，没有观察到抗WHs抗体和抗WHeAg(抗WHe抗体)的抗体的血清转化(数据未显示)。
式(IIa)化合物治疗诱导了剂量依赖性的WHV核酸肝含量的减少。与第-1周的治疗前水平相比，给药式(IIa)化合物导致肝脏WHV共价闭合的环状(ccc)DNA、WHV DNA复制中间体(RI)和WHV RNA的水平的剂量依赖性降低(图3，图10)。尽管在治疗结束时不能从所有的土拨鼠采集肝活检，但这些病毒标志物的降低与血清病毒血症和抗原血症的降低密切相关(比较图2和图3)。在12周治疗之后，在低剂量和高剂量组中WHV cccDNA、WHV DNA RI和WHVRNA相比于治疗前含量的最大减少分别为16％、19％和22％或25％、38％和45％，其表明式(IIa)化合物对病毒RNA的抗病毒效果最显著(图4C-E)。在治疗停止后，在研究结束时在所有土拨鼠中观察到这些病毒标记物肝含量的反弹。在与治疗前含量相比时，低剂量组中的平均WHV cccDNA、WHV DNARI和WHV RNA水平分别在第6和12周、第12周或第6和12周时显著降低(所有的p<0.05)，然而在高剂量组中的所有三种WHV分子的水平在第6周和第12周都显著降低(所有的p<0.05)。与低剂量组相比，在高剂量组中的平均WHV cccDNA、WHV DNARI和WHV RNA水平分别在第6周、第12周或第6和12周显著减少(所有的p<0.05)。
式(IIa)化合物治疗诱导了肝WHV抗原表达下降且与肝脏炎症减少相关。相比于在第-1周的治疗前水平，式(IIa)化合物治疗导致在所有经治疗的土拨鼠中细胞质WHcAg的肝表达评分的剂量依赖性暂态降低(图5A-5B、图11)。已在6周治疗之后观察到WHcAg表达降低。WHcAg表达在剩余治疗期间继续降低，且在用较高剂量治疗的土拨鼠中在第12周的降低最显著。在完成治疗之后，注意到在研究结束时所有土拨鼠的WHcAg的肝表达评分增加。与治疗前相比，低剂量组和高剂量组的平均得分在第6和12周显著降低(所有的p<0.05)；然而，在组水平上，肝的WHcAg表达没有统计学显著性差异。
式(IIa)化合物的给药进一步与不变或甚至降低的所有治疗的土拨鼠中肝脏炎症评分在时间上相关(图5C-5D，图13)。在治疗停止后，在研究结束时小叶窦小管肝炎和门脉肝炎的复合评分在大多数(而非所有)动物中增加。肝脏炎症减少的趋势在用较低剂量或较高剂量的式(IIa)化合物治疗的土拨鼠中是类似的，在与治疗前相比或在各组之间相比时无统计学显著差异。
式(IIa)化合物治疗在慢性WHV携带者土拨鼠中的耐受性。式(IIa)化合物治疗在土拨鼠中的耐受性良好，且基于总体观察结果、体重、体温、血液学或临床化学(数据未示出)，没有明显的毒性迹象，且在研究期间未观察到死亡率。高剂量组中倾向于所估计的肿瘤体积减小(数据未示出)和GGT含量减少，GGT为患有慢性WHV感染的土拨鼠中肝肿瘤发展的已建立的癌胚胎标记物(图14)。
在式(IIa)化合物给药期间，特别是在治疗的最初4-8周期间，血清SDH水平进一步倾向于升高，在高剂量组中的升高比在低剂量组中的更明显(图6，图14)。相反地，在第12周治疗结束时且在两组中的峰值抗病毒应答时，血清SDH含量下降，且高剂量组的降低幅度更为明显。在治疗停止后，血清SDH含量在病毒血症和抗原血症初始复发时再次变得升高。在两组土拨鼠中治疗期间以及之后，丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的血清含量基本上保持不变或稍微下降。然而，在组水平上，这些总体差异在与治疗前相比或在各组之间相比时无统计学显著差异，唯一例外为在随访期间高剂量组的血清AST水平与治疗前水平和治疗水平相比时显著降低(图14)。在式(IIa)化合物治疗期间且同样在完成治疗之后病毒复发期间，也在个体层面上观察到SDH升高(以及ALT、AST及碱性磷酸酶(ALP)的不变或减少)与病毒和抗原负载的初始下降之间的时间相关性(图15)。此外，在个体层面上，峰值抗病毒应答与SDH降低之间存在时间相关性，SDH降低也与肝脏炎症减少在时间上相关。在治疗期间该SDH两相动力学在与增加的抗病毒应答及减少的肝脏炎症相关时可表明由式(IIa)化合物诱导的宿主免疫应答。
式(IIa)化合物治疗诱导I型IFN和ISG在慢性WHV携带者土拨鼠的血液中的剂量依赖性和有时持久的表达。式(IIa)化合物治疗倾向于在血液中诱导I型IFN(即IFN-α和IFN-β)的mRNA表达和选择抗病毒ISG(即OAS1和ISG15)，在与治疗前相比时，高剂量下的诱导显著(图7、图16)。相比之下，低剂量和高剂量在与治疗前相比时均显著诱导促炎性细胞因子、IL-6和另一种ISG(CXCL10)表达，但转录水平的增加在高剂量组中更显著。在治疗第6周在两组中且在大多数个体动物中观察到基因表达的暂态增加，高剂量组中的IFN-α和IFN-β除外，因为表达增加至第12周治疗结束时，且在第18周随访期间进一步增加。相反地，除CXCL10和OAS1在低剂量或高剂量组中的表达分别增加之外，所有其他基因的表达在治疗结束时降低且在随访期间保持类似或更低水平。然而，这些总体差异在两组之间或在各组的治疗和随访之间比较时无统计学显著差异。考虑到两个独立剂量的式(IIa)化合物治疗与显著的WHV复制抑制相关，这表明宿主先天性免疫(和相关的细胞免疫)的剂量依赖性诱导在由该化合物介导的抗病毒应答中起作用。
式(IIa)化合物治疗在慢性WHV携带者土拨鼠的肝中诱导IFN和ISG的类似及持久的表达。类似于外周中的观察，式(IIa)化合物治疗也诱导肝中IFN和ISG的mRNA表达(图8，图11)。与治疗前相比，IFN-α表达在低剂量组中被显著诱导，而在高剂量组中观察到IFN-β、IL-6和OAS1的表达显著增加。在治疗期间低剂量和高剂量组之间的OAS1(而非其他基因)表达的差异也为统计学上显著的。此外，通过在两组中治疗而显著诱导了CXCL10表达。与外周中的相反，CXCL10、OAS1和ISG15的表达在治疗期间不为暂态的，且在治疗结束时及在随访期间在两组和大多数个体动物中进一步增加(图20、图21)。在研究结束时观察到两组中CXCL10、低剂量组中OAS1和高剂量组中ISG15与治疗前相比显著升高。在随访期间低剂量组中的OAS1表达在与治疗相比时也显著升高。未观察到其他所测试基因的表达显著增加，但在随访期间IL-6和IFN-α倾向于分别在低剂量或高剂量组中增加含量。这些结果表明用两个独立剂量的式(IIa)化合物治疗诱导IFN和ISG在肝中的类似表达。由于ISG表达持续超出治疗结束时间且在病毒复发期间仍升高，这表明额外抗病毒免疫机制参与式(IIa)化合物治疗反应。
讨论
为确定与抗HBV的抗病毒应答相关的效力、安全性和药效学，将慢性WHV携带者土拨鼠用两个独立剂量的式(IIa)化合物治疗12周。式(IIa)化合物治疗在所有动物中为耐受良好且通过诱导血清WHV DNA和WHsAg的多对数减少(multi-log reduction)以及肝脏WHVcccDNA、DNARI、RNA和细胞质WHcAg的显著减少而产生剂量依赖性且一致的抗病毒效果。然而，式(IIa)化合物诱导的对WHV复制的抑制为暂态的，且在治疗停止后观察到病毒反弹，但在给药较高剂量的动物中复发显著延迟。由于两者中无一剂量的式(IIa)化合物能够产生WHsAg和WHeAg损失，未观察到抗WHs和抗WHe抗体的血清转化及HCC发病率降低。
在病毒感染期间，病毒衍生的核酸(DNA和RNA两者)主要通过位于细胞(包括肝细胞)的细胞质内的一定模式识别受体(例如RIG-1和NOD2)感应。这些病毒传感器蛋白与PAMP在病毒核酸内结合使包括线粒体抗病毒信号传导蛋白(MAVS)的下游信号传导途径活化，导致诱导IFN调节因子-3(IRF-3)和NF-κB依赖性基因表达，且随后产生I型和III型IFN和炎性细胞因子。因此，病毒核酸的感应是诱导抗病毒先天免疫反应以限制病毒复制和激活适应性免疫的关键过程。对于HBV，最近已经显示RIG-1感应是通过识别HBV pg RNA的5'末端ε区来介导的，其导致在人原代肝细胞中响应于体外感染诱导III型而不是I型IFN。另外，激活的RIG-1能够以不依赖于IFN途径的方式对抗HBV聚合酶蛋白与HBV pgRNA的相互作用，从而抑制病毒复制。在这种情况下，有必要提及的是，在体外和体内研究中，式(IIa)化合物已经显示出对许多RNA病毒(包括HCV、诺如病毒和RSV)的有效抗病毒活性。式(IIa)化合物介导的RIG-1和NOD2的激活支持广谱的抗病毒谱，包括抗HCV和HBV耐药性变体的活性，其表明这些宿主细胞质传感器应该对RNA病毒和基因型的类型是不可知的。此外，在使用HBV感染的原代人肝细胞的体外研究中，式(IIa)化合物诱导的HBV DNA水平显着降低，并且分泌的HBsAg和HBV e抗原(HBeAg)降低，与由IFN-α治疗引起的相似。总之，这些研究的总体数据支持通过作为其抗病毒活性的显著贡献者的式(IIa)化合物诱导宿主先天免疫反应。
除了宿主免疫调节活性(见下文)之外，本研究中由式(IIa)化合物诱导的抗病毒应答(图2和4)在之前在CHB的土拨鼠模型中评估的那些核苷(酸)和免疫调节剂的范围内。使用式(IIa)化合物在给药12周之后的病毒载量降低幅度类似于恩曲他滨(Emtricitabine)、替诺福韦和阿德福韦，或在部分反应者中给药15周后类似于重组土拔鼠IFN-α。由于在式(IIa)化合物治疗期间在第6周注意到SDH升高与血清WHsAg和肝脏WHVcccDNA的初始降低在时间上相关(图2-4、11)，肝酶活性的这种升高可表明细胞毒性效应细胞对受感染肝细胞的免疫介导的病毒清除。由于血清SDH活性在剩余治疗期间下降且肝脏炎症在治疗结束时减少(图5和13)，此可进一步表明其他非细胞溶解机制促成WHV复制的峰值抑制，包括感染WHV的肝细胞的细胞凋亡(尽管在肝活检组织的组织病理学检查期间在细胞水平上未观察到)。
如上文所提及，III型而非I型IFN通过RIG-1介导的感应响应于体外HBV感染在人原代肝细胞中被显著诱导。类似地，慢性HBV和WHV感染中的宿主先天性免疫应答受损，且I型IFN以及IFN-α和IFN-β刺激的基因表达在病毒感染的肝脏中受到限制。这一发现的一个解释是HBV(以及WHV类似物)的x抗原或聚合酶蛋白分别与MAVS相互作用或与TBK1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)竞争结合DDX3(DEAD盒家族的RNA解旋酶)，并抑制RIG-1介导的IFN途径，从而可使HBV逃避先天性抗病毒免疫应答。考虑到在慢性WHV感染中缺乏I型IFN应答，IFN-α和IFN-β的外周和肝脏诱导以及ISG如CXCL10、OAS1和ISG15的外周和肝脏诱导，以及促炎细胞因子、IL-6的外周和肝脏诱导非常重要，因为其表明先天性抗病毒免疫应答由式(IIa)化合物以剂量依赖性方式诱导(图7、8、16-21)。
由于一些研究已经证明IFN(IFN-α)介导的抗病毒作用可以直接抑制HBV和WHV，本研究的一个有趣的发现是对式(IIa)化合物的抗病毒应答与所测试的抗病毒ISG的持久肝表达不密切相关，其表明其他免疫反应和/或抗病毒机制可发挥作用，特别是在对治疗的峰值抗病毒应答中。由于治疗期间ISG的外周和肝脏表达被限制在给药后大约2-4小时，所以可能错过了这些ISG的最大表达，并且峰值诱导可与式(IIa)化合物的抗病毒应答有关。最后，如果考虑到最近的研究证明HBV可以抑制IFN-α信号传导，那么WHV可限制(但不消除)肝中I型IFN信号传导。考虑来源于本发明研究的所有数据，式(IIa)化合物似乎也具有直接抗病毒组分，其涉及通过式(IIa)化合物活化的RIG-1和NOD2干扰WHV聚合酶蛋白与WHV pgRNA对接，且可有助于总体治疗应答，尤其是峰值治疗应答。此假设与在RIG-I存在下式(IIa)化合物在dsRNA上的易位研究一致。我们的数据也与式(IIa)化合物在HBV转基因小鼠中表现出的有效功效一致，该转基因小鼠是一种本身具有免疫耐受性的慢性HBV感染动物模型。在HBV转基因小鼠模型中的式(IIa)化合物剂量范围研究中，每日一次经口给药式(IIa)化合物(1至100mg/kg/天)14天导致肝的HBV DNA显著减少，且在较高剂量下获得的抗病毒效果类似于使用阿德福韦作为阳性对照组的抗病毒效果。
综上所述，通过建立CHB免疫动物模型中式(IIa)化合物的有效性、安全性和药效学，本研究为这类新型抗HBV化合物的宿主免疫刺激和直接抗病毒活性提供了深入的见解。
实施例3：式(IIa)化合物与恩替卡韦的组合治疗在土拔鼠慢性乙型肝炎病毒感染模型中的研究及功效。
研究目标
本研究的目的是确定式(IIa)化合物与恩替卡韦(ETV)组合的长期治疗是否是安全的，并且在慢性感染土拨鼠肝炎病毒(WHV)的土拨鼠中是否产生持续的抗病毒活性，所述土拨鼠肝炎病毒是已建立的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的动物模型。该研究在口服给药12周、并结合使用直接作用的抗病毒剂ETV进行的4周口服治疗的过程中测试了式(IIa)化合物。一组土拨鼠在初始4周治疗期间接受ETV，随后12周给药式(IIa)化合物。另一组土拨鼠最初用式(IIa)化合物治疗12周，随后ETV治疗4周。经治疗的土拨鼠被随访总计24周，且评估血清和肝中的病毒血症和抗原血症相比于治疗前水平的变化。另外，确定血清和肝中的式(IIa)化合物浓度，外周血和肝中的宿主先天性免疫应答诱导，抗WHV表面抗原的抗体的血清转化，以及式(IIa)/ETV治疗中断的病毒血症反弹。
研究设计
使用十(10)只慢性感染有WHV的土拨鼠。土拨鼠在圈养下出生且在3日龄用cWHV7P2a接种物接种，随后饲养至11月龄。在研究前，基于现有标准，包括WHV表面抗原(WHsAg)、抗WHsAg的抗体(抗WHs)及WHV DNA的存在来确认土拨鼠为已确定的慢性WHV携带者。该研究中所用的土拨鼠在研究开始时为两种性别及大约12至14月龄。
实验计划：
在开始研究之前两周至一周，将慢性WHV携带者土拨鼠麻醉并抽取全血用于WHV血清学(确定WHV表面抗原[WHsAg]和抗WHsAg的抗体[抗WHs])、血清WHV DNA、全血细胞计数(CBC)及临床生物化学特征(参见以下汇总表)。将额外的全血等分试样抽至PAXgene血液管(Qiagen)中且储存，以通过实时PCR确定所选宿主先天性免疫应答基因的转录表达变化。获得另一全血等分试样，稍后确定血浆中的式(IIa)化合物浓度。
确定体重和体温(即，土拨鼠被植入微芯片以便准确识别，且植入物也通过手持式扫描仪记录体温)。使用上文所描述的参数，基于性别、体重、血清病毒和抗原负载和γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的血清含量将土拨鼠分为两组。在必要时，进一步基于血液学及其他临床生物化学数据将土拨鼠分类。所选土拨鼠基于低GGT含量而无HCC证据，其在通过肝超声检查到达研究位点之后确认。
两(2)组五(5)只慢性WHV携带者土拨鼠各自用于该研究中：
第1组自T0开始用0.5mg/kg每日剂量的ETV经口治疗4周，随后用30mg/kg每日剂量的式(IIa)化合物附加治疗12周。土拨鼠随后被随访总计24周。
第2组自T0开始用30mg/kg每日剂量的式(IIa)化合物经口治疗12周，随后用0.5mg/kg每日剂量的ETV附加治疗4周。土拨鼠随后也被随访总计24周。
向第1组和第2组土拨鼠经口给药式(IIa)化合物的剂量是基于实施例2的结果选择，在实施例2中，式(IIa)化合物以每日30mg/kg剂量经口治疗12周，其不具有毒性却产生显著抗病毒功效。ETV剂量是基于先前在土拨鼠中的短期和长期治疗研究。预期每日经口给予0.5mg/kg的ETV持续4周将使血清病毒血症抑制大约3-4log10。
式(IIa)化合物是作为预称量的粉末在单独的容器中提供。使足以每天用式(IIa)化合物治疗所有10只预称重的土拨鼠的量的粉末与土拔鼠饮食粉末(Dyets Inc.,Bethlehem,PA)直接混合，随后悬浮于HPLC水中。在T0(第2组)或在用ETV治疗4周之后(第1组)以及在其之后每天持续12周(84天)用剂量注射器经口给药药物。药物给药之后，接着给予额外2ml土拔鼠液态饮食，以确保式(IIa)化合物完全消耗。
ETV是作为粉末提供。使足以每天治疗所有10只土拨鼠的量的粉末悬浮于浓度为0.5mg/ml的等渗盐水中。然后将与单个土拨鼠的体重(kg)对应的药液体积(ml)与大约3-5ml的土拨鼠液态饮食混合，并在T0(第1组)或在用式(IIa)化合物治疗12周之后(第2组)以及在其之后每天持续4周(28天)用剂量注射器经口给药。ETV给药之后，接着给予额外2ml土拔鼠液态饮食，以确保药物完全消耗。
在T0给药式(IIa)化合物或ETV之前，随后每周直至第24周研究结束时，在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下自各土拔鼠中抽取全血样本以确定血清WHV DNA、WHsAg和抗WHs(参见以下汇总表)。如果在血清中显著降低，可以定量测定WHsAg和抗WHs。收集后将血样保持在室温，并在观察到血块回缩时收集血清。将收集的血清转移至微量离心管中并在-70℃冷冻储存直至使用。
用于确定式(IIa)化合物血浆浓度的全血样品也在药物治疗之前在T0处获得，然后在整个研究中每两周取一次(参见以下汇总表)。将全血收集至K3EDTA管中且置于湿冰上不超过30分钟，随后处理。在其之后，血液将在4℃下在大约5000g下离心15分钟，并将复制的血浆样本(各自>0.1ml)转移至新鲜储存管中。将血浆冷冻储存在-70℃下直至研究结束。
在T0开始用式(IIa)化合物或ETV治疗之前以及随后在第4周、第8周、第12周、第16周、第20周和第24周获得用于CBC的EDTA全血样本及用于生物化学特征的血清样本(参见以下汇总表)。如果显示临床异常，尤其是在用式(IIa)化合物与ETV组合治疗期间，则获得额外的CBC和生物化学特征。用于CBC测定的血液样品在收集后保持在4℃，并在同一天用制冷包发送至康奈尔大学(Ithaca,NY)的动物健康诊断中心(AHDC)。将包括血清肝酶活性的生化试验的血清样本储存在-70℃下，且在收集周期间与干冰一起发送至AHDC。
通过基于实时PCR的分析确定通过用式(IIa)化合物与ETV组合治疗的土拨鼠的外周血和肝中的先天性免疫应答诱导。在开始用式(IIa)化合物治疗之前的T0以及随后在第4周、第10周、第16周、第20周和第24周(第1组)或在第6周、第12周、第16周、第20周和第24周(第2组)获得全血样本(参见以下汇总表)。将全血在指定时间点抽至PAXgene血液管中且储存在-70℃下直至使用。使用PAXgene血液miRNA试剂盒(Quiagen)从全血中分离总RNA，并用脱氧核糖核酸酶治疗。随后通过实时PCR将mRNA逆转录为cDNA并扩增宿主免疫应答基因。土拔鼠细胞因子和干扰素刺激基因包括IFN-α、IFN-β、白细胞介素6(IL-6)、2'-5'-寡腺苷酸合成酶1(OAS-1)、干扰素诱导的17kDa蛋白(ISG15)以及干扰素γ诱导的蛋白10(IP-10或CXCL10)。使用土拔鼠18S rRNA表达来校正靶基因表达。在治疗前(即，在开始用式(IIa)化合物或ETV治疗的T0之前大约1周)，在麻醉下使用由超声成像导引的16g一次性针获得肝活检体。在第4周、第16周和第20周(第1组)或在第12周、第16周和第20周(第2组)获得额外的肝活检体。在第24周研究结束时在尸体剖检期间进行最终肝活检(参见以下汇总表)。针是经背外侧和稍微头侧插入到肝脏的较大的左外叶中。活检标本的评估包括病毒核酸(即，WHV共价闭合环状DNA、WHV DNA复制中间物和WHV RNA)的测量、肝病和肝癌(即，门脉炎症/肝炎、胆管增殖、窦小管炎症/肝炎、坏死、纤维化、脂肪变性和细胞凋亡(即凋亡小体))进展的组织学及WHV抗原(即，表面和核心)的肝表达的免疫组织化学。将肝组织在-70℃下冷冻储存直至研究结束。
在T0开始用式(IIa)化合物或ETV治疗之前以及随后直至第24周研究结束，每周记录一次土拨鼠的体重和体温(参见以下汇总表)。体温是通过皮下植入的微芯片获得的，可以用手持式扫描仪读取。如果显示临床异常(即，发热峰值)，在用式(IIa)化合物与ETV组合治疗期间获得额外的体温记录。
获得用于确定宿主先天性免疫应答的全血样本，以及用于确定式(IIa)化合物血浆浓度的血清样本。在安乐死之后和完全死后检查之前立即获得用于WHV核酸测定、组织学、免疫组织化学、宿主先天性免疫应答测量和肝脏的式(IIa)化合物浓度的肝样品。
表1.实验过程和测试的汇总表
*第1组(G1＝ETV+式(IIa)化合物组)的土拨鼠从T0开始用ETV以0.5mg/kg的剂量口服治疗4周，随后用式(IIa)化合物以30mg/kg的剂量进行12周的附加治疗。第二组(G2＝式(IIa)化合物+ETV组)的土拨鼠从T0开始用式(IIa)化合物以30mg/kg的剂量口服治疗12周，随后用ETV以0.5mg/kg的剂量进行4周的附加治疗。
a式(IIa)化合物的含量将在肝脏和血浆中确定。
b用式(IIa)化合物和ETV治疗后的肝脏和外周血中的宿主先天性免疫应答将使用基于实时RT-PCR的测定来确定。
c血液学和临床化学参数将在康奈尔大学(AHDC,Ithaca,NY)确定。
研究结果
通过比较在组合治疗期间/之后慢性WHV携带者土拨鼠的血清WHV DNA和WHsAg负载和肝WHV核酸含量与在治疗前获得的血清WHV DNA和WHsAg负载和肝WHV核酸含量来评估使用式(IIa)化合物和ETV治疗的抗病毒活性。通过比较在组合治疗期间/之后外周血和肝中的所选宿主先天性免疫应答基因的mRNA表达与在治疗前观察到的表达来评估式(IIa)化合物的免疫调节活性。在给药式(IIa)化合物和ETV之后慢性WHV携带者土拨鼠中的血清转化通过比较在组合治疗期间/之后的抗WHs含量与在治疗前获得的抗WHs含量来评估。也将在组合治疗期间/之后的肝病进展、肝WHV抗原表达和式(IIa)化合物诱导的细胞凋亡与在治疗前观察到的相同参数进行比较。与式(IIa)化合物和ETV治疗相关的可能的毒性通过以下进行评估：每日进行的临床观察；以及将在组合治疗期间/之后每周的体温和体重的测量值与在治疗前获得的测量值进行比较；及比较在研究过程期间的血液和临床化学参数。也在第1组和第2组土拨鼠之间比较上文所描述的所有参数以确定与两种组合治疗方案相关的持久抗病毒效果。
体重和体温
式(IIa)化合物组合ETV治疗的土拨鼠在整个研究期间，特别是分别在T0至第16周或第17周至第19周之间的治疗和随访期间，体重增加。总体而言，在大部分研究期间两组之间的平均体重类似，但在第21周至第24周的随访期间用式(IIa)化合物附加ETV治疗的土拨鼠在与接受ETV附加式(IIa)化合物的土拨鼠相比时体重略有下降的趋势。然而，两组之间的平均体重变化在整个研究中为类似的且无统计差异(P>0.05)，这表明不存在与式(IIa)化合物组合ETV治疗16周相关的明显毒性证据。
两组土拨鼠的平均体温随时间推移而波动但在大部分研究中基本上保持稳定。总体而言，两组土拨鼠之间的平均体温变化在整个研究中为类似的且无统计差异(P>0.05)，这表明式(IIa)化合物组合ETV治疗与个别土拨鼠中的任何持久发热峰值不相关。
血清WHV DNA
与T0治疗前含量相比，使用式(IIa)化合物与ETV组合经口给药16周对血清中的病毒标志物的治疗方案效果一致且显著(P<0.05)。在首先用式(IIa)化合物(即30mg/kg)治疗12周随后附加给药ETV(即，0.5mg/kg)4周的‘式(IIa)+ETV’组的土拨鼠中的抗病毒效果比首先给药ETV 4周随后用式(IIa)化合物附加治疗12周的‘ETV+式(IIa)’组土拨鼠更显著且更持久。由式(IIa)化合物介导的对WHV DNA和WHsAg的抗病毒效果对于大多数‘式(IIa)+ETV’组土拨鼠是一致的，而‘ETV+式(IIa)’组土拨鼠显示出更多的抗病毒应答差异，尤其在ETV治疗停止之后血清WHV标记物反弹期间以及在通过用式(IIa)化合物继续治疗的病毒抑制期间。由ETV介导的对WHV DNA(以及部分地对WHsAg)的抗病毒效果在两组土拨鼠中为显著的。
‘ETV+式(IIa)’组的所有土拨鼠在4周ETV期间的血清WHV DNA相比于治疗前含量显著减少(图27A-B)。在这组中的任何土拨鼠中，血清WHV DNA变得永远不可检测，并且在治疗期间(即土拨鼠F4009)观察到抗病毒效应的可变性。在式(IIa)化合物治疗停止后，所有土拨鼠显示病毒复制的复发，且血清病毒血症在初始2周随访期间立即增加了2.96log10，且随后直至第24周研究结束更逐渐增加了另一个1.0log10。在此组土拨鼠中，血清WHV DNA在式(IIa)化合物停药(即，研究的第18周至第22周)后2-6周内返回至治疗前含量。‘式(IIa)+ETV’组的所有土拨鼠在式(IIa)化合物治疗的12周期间血清WHV DNA显著降低，这在给药开始后第1周被注意到。在治疗的最初6周期间，随着WHV DNA每3周减少约1log10，组平均血清病毒血症的减少似乎逐渐发生。在第12周式(IIa)化合物治疗结束时，平均血清WHV DNA自治疗前含量减少了3.54log10。在附加ETV治疗4周之后，平均血清病毒血症进一步下降了2.80log10，且在第17周(即，在ETV治疗停止后一周，图27A-B)自治疗前水平降低了6.34log10。然而，血清WHV DNA在此组土拨鼠中的任一者中变得不再可检测。在ETV治疗停止后，所有土拨鼠显示出病毒复制的复发，且平均血清病毒血症在初始3周随访期间立即增加了3.26log10。在其之后，平均血清WHV DNA较不快速地增加且直至第24周研究结束仅增加了1.47log10。此组存活土拨鼠中的血清WHV DNA在随访期间从未返回至治疗前含量，且平均血清病毒血症保持低于基线1.62log10。
总之，上述血清WHV DNA的显著观察包括：1)在初始ETV和式(IIa)化合物分别治疗4周或12周期间，血清病毒血症相比于治疗前水平一致且显著(P<0.05)减少；2)血清病毒血症在‘式(IIa)+ETV’组中在式(IIa)化合物组合ETV治疗期间比在‘ETV+式(IIa)’组中在ETV组合式(IIa)化合物治疗期间相比于治疗前水平的减少更显著；及3)在‘ETV+式(IIa)’组中在式(IIa)化合物治疗停止后血清病毒血症返回至治疗前水平，该返回在‘式(IIa)+ETV’组中在ETV治疗停止后延迟。由于上述差异，在研究的第1周至第7周，‘ETV+式(IIa)’组中的血清几何WHV DNA浓度比‘式(IIa)+ETV’组显著更低(P<0.05)。然而，在第12周至第24周，‘式(IIa)+ETV’组中的血清几何WHV DNA浓度比‘ETV+式(IIa)’组显著更低(P<0.05)，其表明在血清WHV DNA减少的程度和可持续性方面对血清病毒血症的治疗方案依赖性效应。
血清WHsAg
也观察到在式(IIa)化合物组合ETV治疗16周期间‘ETV+式(IIa)’和‘式(IIa)+ETV’组土拨鼠的血清WHsAg含量的显著变化(图28A-B)。‘ETV+式(IIa)’组的大多数土拨鼠早在治疗开始后1-3周就观察到ETV给药4周期间血清WHsAg相对于治疗前水平的显著降低，土拔鼠M4002除外，其中WHsAg下降较不显著。组平均血清抗原血症的减少在与平均血清病毒血症的下降相比时似乎发生得更平缓，但WHsAg直至第8周(亦即，在ETV治疗停止后四周)才下降了1.17log10。尽管附加的式(IIa)化合物治疗自第5周开始，然而平均血清抗原血症在第13周增加了0.62log10但仍保持0.55log10，这低于治疗前水平。在剩余式(IIa)化合物治疗期间，平均血清抗原血症再次下降了0.57log10，且在第17周(在式(IIa)化合物治疗停止后一周)相比于治疗前水平降低了1.13log10。在式(IIa)化合物治疗停止后，所有土拨鼠显示病毒复制的复发，且直至第24周研究结束，血清抗原血症逐渐增加了1.15log10。在此组土拨鼠中，血清WHsAg在式(IIa)化合物停药(即，研究的第19周至第24周)后3-8周内返回至治疗前含量。‘式(IIa)+ETV’组的所有土拨鼠在式(IIa)化合物治疗的12周期间血清WHsAg显著降低，这早在开始给药后1-2周就被注意到。组平均血清病毒血症的减少似乎逐渐发生，且直至第12周式(IIa)化合物治疗结束，WHsAg下降了1.49log10。在4周附加ETV治疗之后，平均血清抗原血症进一步下降了1.38log10，且在第17周(即，在ETV治疗停止后一周)相比于治疗前水平降低了2.87log10。在ETV治疗停止后，所有土拨鼠显示病毒复制的复发，且直至第24周研究结束，平均血清抗原血症增加了2.28log10。此组存活土拨鼠中的血清WHsAg从未返回至治疗前含量且平均血清抗原血症保持低于基线0.59log10。总的来说，与T0的治疗前含量相比，‘ETV+式(IIa)’组土拨鼠的血清中的几何平均WHsAg浓度在第7周(ETV治疗4周后)最大降低了1.76log10，且在第17周(在式(IIa)化合物治疗12周之后)降低了1.10log10。在第24周随访时段结束时，血清几何WHsAg浓度稍微高于在T0的治疗前浓度。‘式(IIa)+ETV’组土拨鼠的血清中的几何平均WHsAg浓度最大降低了1.66。
总之，上述血清WHsAg的显著观察包括：1)在初始ETV和式(IIa)化合物分别治疗4周或12周期间，血清抗原血症相比于治疗前水平显著(P<0.05)降低；2)血清抗原血症在‘式(IIa)+ETV’组中在式(IIa)化合物组合ETV治疗期间比在‘ETV+式(IIa)’组中在ETV组合式(IIa)化合物治疗期间相比于治疗前水平的减少更显著；及3)在‘ETV+式(IIa)’组中在式(IIa)化合物治疗停止后血清抗原血症返回至治疗前水平，该返回在‘式(IIa)+ETV’组中在ETV治疗停止后延迟。由于上述差异，在研究的第13周至第19周及同样第21周至第23周，‘式(IIa)+ETV’组中的血清几何WHsAg浓度比‘ETV+式(IIa)’组显著更低(P<0.05)，这表明关于血清WHsAg减少的幅度及持续性对血清抗原血症的治疗方案依赖性效果。
实施例4.在慢性感染有HBV的耐受性变异体的细胞中确定式(IIa)化合物的EC50
在慢性感染有HBV的耐受性变异体的细胞中进行抗病毒分析。为了测定式(IIa)化合物和抗病毒核苷类似物拉米夫定(3TC)和阿德福韦二匹伏酯(ADV)对测试菌株的效力，使用慢性感染有HBV的六种不同的细胞样品测定体外活性(EC50,μM)。各细胞样本感染有野生型HBV或HBV的耐受性变异体，其中耐受性变异体包括在以下氨基酸位置的HBV聚合酶(P)突变：M204V、M204I、L180M、L180M/M204V和N236T。在各分析中，连续九天向细胞中每日添加式(IIa)化合物、3TC或ADV。
数据表明类似于ADV，式(IIa)化合物有效对抗感染有所有经测试的HBV病毒株(野生型及耐受性变异体)的细胞(图31)。相比之下，3TC仅有效对抗少于一半的经测试的耐受性HBV病毒株。
等效物
本发明所引用的每一专利、专利申请和出版物的公开内容均以全文引用的方式并入本发明中。虽然已参考特定方面描述本发明，但显而易见地是本领域技术人员可在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下设计其他方面和变化。所附权利要求旨在被解释为包括所有这些方面和等效变化。被认为通过引用并入本发明的任何专利、出版物或其他公开材料仅在并入的内容不与本发明中所阐述的现有定义、陈述或其他公开内容矛盾的程度上并入本发明中。因此在此程度上，如本发明中明确阐述的公开内容取代以引用的方式并入本发明中的任何矛盾内容。
虽然已参考本发明的优选的具体实施方案特别显示及描述本发明，但本领域技术人员应理解，在不脱离所附权利要求所包含的公开的范围的情况下，可以在其中进行形式和细节上的各种改变。

Claims (199)

1.一种治疗感染有乙型肝炎病毒的受试者的方法，该方法包括向该受试者给药包含剂量为约0.5mg/kg至约100mg/kg的式(I)化合物的药物组合物，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗该受试者。
2.根据权利要求1的方法，其中式(I)的前药是式(II)化合物，其中所述化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1的方法，其中所述组合物包含式(I)化合物的混合物，例如式(Ib)和式(Ic)化合物。
4.根据权利要求1的方法，其中所述组合物包含式(Ib)化合物并包含小于约5％的式(Ic)化合物(例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ic)化合物)或基本上不含式(Ic)化合物。
5.根据权利要求1的方法，其中所述组合物包含式(Ic)化合物并包含小于约5％的式(Ib)化合物(例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ib)化合物或基本上不含式(Ib)化合物)。
6.根据权利要求2的方法，其中所述组合物包含式(II)化合物的混合物，例如式(IIb)和式(IIc)化合物。
7.根据权利要求2的方法，其中所述组合物包含式(IIb)化合物并包含小于约5％的式(IIc)化合物(例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIc)化合物或基本上不含式(IIc)化合物)。
8.根据权利要求2的方法，其中所述组合物包含式(IIc)化合物并包含小于约5％的式(IIb)化合物(例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIb)化合物或基本上不含式(Ib)化合物)。
9.根据权利要求1的方法，其中式(I)或式(II)化合物经口给药(例如式(II)化合物经口给药)。
10.根据权利要求1的方法，其中式(I)或式(II)化合物经胃肠外给药(例如式(II)化合物经胃肠外给药)。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
12.根据权利要求11的方法，其中所述受试者是人。
13.根据权利要求12的方法，其中该方法包括每日给药。
14.根据权利要求13的方法，其中给药每天进行一次。
15.根据权利要求13的方法，其中所述剂量包括约0.5mg/kg至约50mg/kg。
16.根据权利要求15的方法，其中所述剂量包括5mg/kg至约50mg/kg。
17.根据权利要求1的方法，其中所述剂量包括液体或固体剂型。
18.根据权利要求17的方法，其中该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。
19.根据权利要求17的方法，其中该固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸或散剂。
20.根据权利要求1的方法，进一步包括给药治疗有效量的另外的药剂。
21.根据权利要求20的方法，其中所述另外的药剂是抗病毒剂或抗癌剂。
22.根据权利要求21的方法，其中所述抗病毒剂包括干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂或非干扰素免疫增强剂。
23.根据权利要求22的方法，其中所述干扰素包括干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。
24.根据权利要求22的方法，其中所述核苷类似物包括拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦、替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦或AGX-1009。
25.根据权利要求22的方法，其中所述抗病毒剂是恩替卡韦。
26.根据权利要求22的方法，其中所述非核苷抗病毒剂包括NOV-225、BAM 205、Myrcludex B、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。
27.根据权利要求22的方法，其中所述非干扰素免疫增强剂包括日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。
28.根据权利要求21的方法，其中所述抗病毒剂为衣壳蛋白抑制剂、进入抑制剂、分泌抑制剂、微RNA、反义RNA剂、RNAi剂或被设计成抑制病毒RNA的其他药剂。
29.根据权利要求21的方法，其中所述抗癌剂选自氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、多柔比星、长春新碱、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、依托泊甙、顺铂、表柔比星和甲苯磺酸索拉非尼。
30.根据权利要求1的方法，进一步包括直至治疗结束时至少一周一次分析受试者的体重和体温或接受对受试者的体重和体温的分析。
31.根据权利要求1的方法，进一步包括在治疗结束之前至少一次分析受试者血液样本或接受对受试者血液样本的分析。
32.根据权利要求31的方法，其中分析所述血液样本的病毒载量和表面抗原含量。
33.根据权利要求31-32中任一项的方法，其中分析所述血液样本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。
34.根据权利要求32的方法，其中分析所述血液样本的抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。
35.根据权利要求1的方法，进一步包括在治疗结束之前至少一次分析受试者肝活检标本或接受对受试者肝活检标本的分析。
36.根据权利要求35的方法，其中分析所述肝活检标本的病毒DNA、病毒RNA、病毒抗原和cccDNA的含量。
37.根据权利要求35的方法，其中分析所述肝活检标本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。
38.根据权利要求36的方法，其中分析所述肝活检标本中抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。
39.根据权利要求36的方法，其中分析所述肝活检标本的肝脏炎症、坏死、脂肪变性或纤维化的减少。
40.一种治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，该方法包括向受试者给药式(I)化合物与恩替卡韦或其药学上可接受的盐的组合，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
41.一种治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，该方法包括向受试者给药恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程，其中该受试者先前已用式(I)化合物的疗程治疗，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
42.一种治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，其中该受试者先前已用恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程治疗，该方法包括向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
43.一种治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，该方法包括首先向受试者给药恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程，且随后向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
44.一种治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，该方法包括首先向受试者给药式(I)化合物的疗程，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，且随后向受试者给药恩替卡韦或其药学上可接受的盐的疗程，从而治疗受试者。
45.根据权利要求40-44中任一项的方法，其中式(I)的前药是式(II)化合物，其中所述化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
46.根据权利要求45的方法，其中式(I)或式(II)化合物的疗程为约1天至约24周。
47.根据权利要求45的方法，其中式(I)或式(II)化合物在整个疗程中至少每周给药一次(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次、一周七次)。
48.根据权利要求47的方法，其中式(I)或式(II)化合物在整个疗程中每日给药。
49.根据权利要求45的方法，其中恩替卡韦的疗程为约1天至约12周。
50.根据权利要求45的方法，其中恩替卡韦在整个疗程中至少每周给药一次(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次、一周七次)。
51.根据权利要求50的方法，其中恩替卡韦在整个疗程中每日给药。
52.根据权利要求45的方法，其中式(I)或式(II)化合物的剂量为约5mg/kg至约100mg/kg。
53.根据权利要求45的方法，其中式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg/kg至约50mg/kg。
54.根据权利要求45的方法，其中恩替卡韦的剂量为约0.1mg至约5mg。
55.根据权利要求45的方法，其中恩替卡韦的剂量为约0.1mg/kg至约10mg/kg。
56.根据权利要求45的方法，其中所述剂量包括液体或固体剂型。
57.根据权利要求56的方法，其中所述液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。
58.根据权利要求56的方法，其中所述固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸或散剂。
59.根据权利要求45的方法，其中式(I)或式(II)化合物或恩替卡韦经口给药(例如，式(I)或式(II)化合物是经口给药，或恩替卡韦是经口给药，或式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦两者均经口给药)。
60.根据权利要求45的方法，其中式(I)或式(II)化合物或恩替卡韦是肠胃外给药(例如，式(II)化合物是肠胃外给药)。
61.根据权利要求45的方法，其中式(I)或式(II)化合物是肠胃外给药，且恩替卡韦是经口给药。
62.根据权利要求45的方法，其中式(I)或式(II)化合物与恩替卡韦配制为固定剂量复合剂(例如，配制为液体剂型或固体剂型，例如胶囊或片剂)。
63.根据权利要求45的方法，其中式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦的给药具有协同或累加效应。
64.根据权利要求40-44中任一项的方法，其中所述组合物包含式(I)化合物的混合物，例如式(Ib)和式(Ic)化合物。
65.根据权利要求40-44中任一项的方法，其中所述组合物包含式(Ib)化合物并包含小于约5％的式(Ic)化合物(例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ic)化合物)或基本上不含式(Ic)化合物。
66.根据权利要求40-44中任一项的方法，其中所述组合物包含式(Ic)化合物并包含小于约5％的式(Ib)化合物(例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(Ib)化合物或基本上不含式(Ib)化合物)。
67.根据权利要求45的方法，其中所述组合物包含式(II)化合物的混合物，例如式(IIb)和式(IIc)化合物。
68.根据权利要求45的方法，其中所述组合物包含式(IIb)化合物并包含小于约5％的式(IIc)化合物(例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIc)化合物或基本上不含式(IIc)化合物)。
69.根据权利要求45的方法，其中所述组合物包含式(IIc)化合物并包含小于约5％的式(IIb)化合物(例如小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％的式(IIb)化合物或基本上不含式(Ib)化合物)。
70.根据权利要求45的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
71.根据权利要求45的方法，其中所述受试者是人。
72.根据权利要求45的方法，进一步包括给药治疗有效量的另外的药剂。
73.根据权利要求72的方法，其中另外的药剂是抗病毒剂或抗癌剂。
74.根据权利要求73的方法，其中所述抗病毒剂包括干扰素、核苷类似物、抗病毒化合物或非干扰素免疫增强剂。
75.根据权利要求74的方法，其中所述干扰素包括干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。
76.根据权利要求74的方法，其中所述核苷类似物包括拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦、替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦或AGX-1009。
77.根据权利要求74的方法，其中所述抗病毒化合物包括NOV-225、BAM 205、MyrcludexB、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV、ALN-HBV。
78.根据权利要求74的方法，其中所述非干扰素免疫增强剂包括日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。
79.根据权利要求73的方法，其中所述抗病毒剂为衣壳蛋白抑制剂、进入抑制剂、分泌抑制剂、微RNA、反义RNA剂、RNAi剂或被设计成抑制病毒RNA的其他药剂。
80.根据权利要求73的方法，其中所述抗癌剂选自氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、多柔比星、长春新碱、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、依托泊甙、顺铂、表柔比星和甲苯磺酸索拉非尼。
81.根据权利要求40-44中任一项的方法，其中所述受试者患有与丁型肝炎病毒(HDV)的共感染。
82.根据权利要求40-44中任一项的方法，进一步包括直至治疗结束时至少一周一次分析受试者的体重和体温或接受对受试者的体重和体温的分析。
83.根据权利要求40-44中任一项的方法，进一步包括在治疗结束之前至少一次分析受试者血液样本或接受对受试者血液样本的分析。
84.根据权利要求83的方法，其中分析所述血液样本的病毒载量和表面抗原含量。
85.根据权利要求83的方法，其中分析所述血液样本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。
86.根据权利要求83的方法，其中分析所述血液样本的抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。
87.根据权利要求40-44中任一项的方法，进一步包括在治疗结束之前至少一次分析受试者肝活检标本或接受对受试者肝活检标本的分析。
88.根据权利要求87的方法，其中分析所述肝活检标本的病毒DNA、病毒RNA、病毒抗原和cccDNA的含量。
89.根据权利要求87的方法，其中分析所述肝活检标本的干扰素(例如，干扰素α或干扰素β)、干扰素刺激蛋白(例如，ISG15、CXCL10、OAS 1)或其他细胞因子的表达水平。
90.根据权利要求87的方法，其中分析所述肝活检标本中抗WHS抗体和抗WHc抗体的存在。
91.根据权利要求87的方法，其中分析所述肝活检标本的肝脏炎症、坏死、脂肪变性或纤维化的减少。
92.一种治疗受试者中丁型肝炎病毒的方法，该方法包括向受试者给药式(I)化合物与恩替卡韦或其药学上可接受的盐的组合，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
93.根据权利要求92的方法，其中式(I)的前药是式(II)化合物，其中所述化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
94.根据权利要求93的方法，其中式(I)或式(II)化合物的疗程为约1天至约24周。
95.根据权利要求93的方法，其中式(I)或式(II)化合物在整个疗程中为至少每周给药一次(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次、一周7次)。
96.根据权利要求93的方法，其中式(I)或式(II)化合物在整个疗程中是每日给药。
97.根据权利要求93的方法，其中恩替卡韦的疗程为约1天至约12周。
98.根据权利要求93的方法，其中恩替卡韦在整个疗程中是至少每周给药一次(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次、一周7次)。
99.根据权利要求93的方法，其中恩替卡韦在整个疗程中是每日给药。
100.根据权利要求93的方法，其中式(I)或式(II)化合物的剂量为约5mg/kg至约100mg/kg。
101.根据权利要求93的方法，其中恩替卡韦的剂量为约0.1mg/kg至约10mg/kg。
102.根据权利要求93的方法，其中所述剂量包括液体或固体剂型。
103.根据权利要求102的方法，其中所述液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。
104.根据权利要求102的方法，其中所述固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸或散剂。
105.根据权利要求93的方法，其中式(I)或式(II)化合物或恩替卡韦是经口给药(例如，式(I)或式(II)化合物是经口给药，或恩替卡韦是经口给药，或式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦两者均经口给药)。
106.根据权利要求93的方法，其中式(I)或式(II)化合物和恩替卡韦的给药具有协同或累加效应。
107.根据权利要求92的方法，其中该组合物包含式(I)化合物的混合物，例如式(Ib)和式(Ic)化合物。
108.根据权利要求93的方法，其中该组合物包含式(II)化合物的混合物，例如式(IIb)和式(IIc)化合物。
109.根据权利要求92-93中任一项的方法，其中所述受试者是人。
110.根据权利要求92-93中任一项的方法，进一步包括给药治疗有效量的额外药剂。
111.根据权利要求110的方法，其中所述另外的药剂是抗病毒剂或抗癌剂。
112.根据权利要求111的方法，其中所述抗病毒剂包括干扰素、核苷类似物、抗病毒化合物或非干扰素免疫增强剂。
113.根据权利要求112的方法，其中所述干扰素包括干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。
114.根据权利要求112的方法，其中所述核苷类似物包含拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦、替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦或AGX-1009。
115.根据权利要求112的方法，其中所述抗病毒化合物包括NOV-225、BAM 205、Myrcludex B、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV、ALN-HBV。
116.根据权利要求112的方法，其中所述非干扰素免疫增强剂包括日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。
117.根据权利要求111的方法，其中所述抗病毒剂为衣壳蛋白抑制剂、进入抑制剂、分泌抑制剂、微RNA、反义RNA剂、RNAi剂或被设计成抑制病毒RNA的其他药剂。
118.根据权利要求111的方法，其中所述抗癌剂选自氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、多柔比星、长春新碱、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、依托泊甙、顺铂、表柔比星和甲苯磺酸索拉非尼。
119.根据权利要求92-108中任一项的方法，其中所述受试者患有与乙型肝炎病毒(HBV)的共感染。
120.一种治疗受试者中乙型肝炎病毒的方法，该方法包括向受试者给药式(I)化合物与替诺福韦或其药学上可接受的盐组合，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
121.根据权利要求120的方法，其中式(I)的前药是式(II)化合物，其中所述化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
122.根据权利要求120-121中任一项的方法，其中替诺福韦包括替诺福韦二匹伏酯或替诺福韦艾拉酚胺。
123.根据权利要求120-121中任一项的方法，其中所述受试者患有与丁型肝炎病毒(HDV)的共感染。
124.一种治疗感染有乙型肝炎病毒(HBV)的耐药性菌株的受试者的方法，该方法包括向受试者给药式(I)化合物，其中该化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者，且其中在给药除式(I)化合物以外的抗HBV剂之后，受试者中HBV生物标记物的含量没有显著降低。
125.一种治疗感染乙型肝炎病毒(HBV)的耐药性菌株的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给药式(I)化合物，其中所述化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐从而治疗受试者，并且其中所述乙型肝炎耐药型病毒株对除式(I)化合物以外的抗HBV剂具有抗性。
126.一种治疗感染有乙型肝炎病毒(HBV)的受试者的方法，所述受试者先前已被给药抗HBV剂，所述方法包括向受试者给药式(I)化合物，其中所述化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐，从而治疗受试者。
127.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中式(I)的前药为式(II)化合物，其中所述化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
128.根据权利要求124的方法，其中所述HBV生物标记物包括病毒载量、HBsAg含量、HBeAg含量或cccDNA含量。
129.根据权利要求124的方法，其中HBV生物标记物的含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物以外的抗HBV剂而明显降低。
130.根据权利要求128的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。
131.根据权利要求128的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的病毒载量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。
132.根据权利要求128的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。
133.根据权利要求128的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
134.根据权利要求128的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。
135.根据权利要求134的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的HBsAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
136.根据权利要求128的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。
137.根据权利要求128的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
138.根据权利要求128的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量由式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐明显降低。
139.根据权利要求138的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的HBeAg含量在给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐之后减少了多于约1个对数单位、约1.5个对数单位、约2个对数单位、约2.5个对数单位、约3个对数单位、约3.5个对数单位、约4个对数单位、约4.5个对数单位、约5个对数单位或更多。
140.根据权利要求128的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂而明显降低。
141.根据权利要求128的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量在给药除式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐以外的抗HBV剂之后减少了少于约2个对数单位、约1.5个对数单位、约1个对数单位、约0.5个对数单位、约0.1个对数单位或更少。
142.根据权利要求128的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株的cccDNA含量由于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐而明显降低。
143.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中所述抗HBV剂是干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂、免疫增强剂或直接作用的抗病毒剂。
144.根据权利要求124-125中任一项的方法，其中所述耐药型乙型肝炎病毒株为HBV变异株或HBV突变株。
145.根据权利要求144的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒株包括HBsAg、HBcAg、HBeAg、L、M、P或X蛋白的变异体或突变形式。
146.根据权利要求145的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒变异株包括HBsAg蛋白的序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列相比。
147.根据权利要求146的方法，其中HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括位于100位氨基酸与200位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。
148.根据权利要求147的方法，其中HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括在115、118、120、123、126、129、131、133、134、142、143、144、145或154位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。
149.根据权利要求146的方法，其中HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括位于150位氨基酸与200位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。
150.根据权利要求149的方法，其中HBsAg蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括在161、172、173、175、176、193、194或196位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。
151.根据权利要求145的方法，其中耐药型乙型肝炎病毒变异株包括P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)，例如与参考序列相比。
152.根据权利要求151的方法，其中P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括位于60位氨基酸与275位氨基酸之间的突变，例如与参考序列相比。
153.根据权利要求152的方法，其中P蛋白序列中的氨基酸突变(例如，氨基酸取代、加成或缺失)包括在80、169、173、180、181、184、169、202、204、215、233、236或250位氨基酸处的突变，例如与参考序列相比。
154.根据权利要求124的方法，其中所述耐药型乙型肝炎病毒株对除式(I)或式(II)化合物以外的抗HBV剂具有抗性。
155.根据权利要求128的方法，其中HBV生物标记物的含量没有由于暴露于除式(I)或式(II)化合物以外的抗HBV剂而明显降低。
156.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中向所述受试者给药式(I)化合物的混合物，例如式(Ib)和式(Ic)化合物。
157.根据权利要求127的方法，其中向所述受试者给药式(II)化合物的混合物，例如式(IIb)和式(IIc)化合物。
158.根据权利要求127的方法，其中式(I)或式(II)化合物经口给药(例如式(II)化合物经口给药)，经肠胃外给药(例如式(I)化合物经肠胃外给药)，或经静脉内给药(例如式(I)化合物经静脉内给药)。
159.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中所述受试者是人。
160.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中该方法包括每日给药所述剂量。
161.根据权利要求160的方法，其中每天给药一次。
162.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中所述剂量包括液体或固体剂型。
163.根据权利要求162的方法，其中该液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。
164.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中该固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸、散剂、丸剂或微胶囊剂型。
165.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中该化合物以约5mg/kg至500mg/kg的剂量给药。
166.根据权利要求127的方法，其中式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于1μM(例如式(II)化合物为小于1μM)。
167.根据权利要求127的方法，其中式(I)或式(II)化合物的IC50值为小于0.1μM(例如式(II)化合物为小于0.1μM)。
168.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中所述受试者感染有HBV基因型A(例如，HBV-A1-7)、HBV基因型B(例如，HBV-B2-5)、HBV基因型C(例如，HBV-C1-16)、HBV基因型D(例如，HBV-D1-7)、HBV基因型E、HBV基因型F(例如，HBV-F1-4)、HBV基因型G、HBV基因型H、HBV基因型I或HBV基因型J。
169.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中式(I)或式(II)化合物具有泛基因型活性。
170.根据权利要求124的方法，其中所述受试者是初治患者。
171.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中所述受试者先前已针对HBV感染进行治疗。
172.根据权利要求171的方法，其中对HBV感染的先前治疗已失败。
173.根据权利要求171的方法，其中受试者已复发。
174.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中受试者已诊断出患有肝硬化。
175.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中受试者已诊断出患有肝细胞癌。
176.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中受试者正在等待肝移植。
177.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中受试者不具有肝硬化或尚未诊断出患有肝细胞癌。
178.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中受试者已进一步诊断出患有HIV。
179.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中受试者进一步被给药额外药剂或治疗剂或其药学上可接受的盐。
180.根据权利要求179的方法，其中额外药剂或治疗剂包括干扰素、核苷类似物、非核苷抗病毒剂或免疫增强剂。
181.根据权利要求180的方法，其中所述干扰素包括干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、复合α干扰素或聚乙二醇干扰素(例如，聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b)。
182.根据权利要求180的方法，其中所述核苷类似物包括拉米夫定、阿德福韦二匹伏酯、恩替卡韦、替比夫定、克来夫定、利巴韦林、替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺、拜斯福韦或AGX-1009。
183.根据权利要求180的方法，其中非核苷抗病毒剂包括NOV-225、BAM 205、MyrcludexB、ARC-520、BAY 41-4109、REP 9AC、Alinia(硝唑尼特)、Dd-RNAi、NVR-121(NVR 3-778)、BSBI-25、NVP-018、TKM-HBV或ALN-HBV。
184.根据权利要求180的方法，其中所述免疫增强剂包括日达仙(胸腺素α-1)、GS-4774、CYT107(白细胞介素-7)、Dv-601、HBV核心抗原疫苗或GS-9620。
185.根据权利要求124-126中任一项的方法，其中式(I)或式(II)化合物配制为药物组合物。
186.根据权利要求185的方法，其中该药物组合物还包含药物载体或赋形剂。
187.药物组合物，其包含式(I)化合物和恩替卡韦或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐。
188.药物组合物，其包含式(I)化合物和替诺福韦(例如替诺福韦二匹伏酯、替诺福韦艾拉酚胺)或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：
或其前药或药学上可接受的盐。
189.根据权利要求187-188中任一项的方法，其中式(I)的前药为式(II)化合物，且所述化合物选自：
或其药学上可接受的盐。
190.根据权利要求187-188中任一项的组合物，其中所述药物组合物包含口服剂型。
191.根据权利要求190的组合物，其中口服剂型是液体剂型或固体剂型。
192.根据权利要求191的组合物，其中所述液体剂型包括悬浮液、溶液、甜浆剂、乳液、饮料、酏剂或糖浆。
193.根据权利要求191的组合物，其中所述固体剂型包括胶囊、片剂、糖衣丸或散剂。
194.根据权利要求188的组合物，其中式(I)或式(II)化合物的剂量为约5mg/kg至约100mg/kg。
195.根据权利要求188的组合物，其中式(I)或式(II)化合物的剂量为约10mg/kg至约50mg/kg。
196.根据权利要求188的组合物，其中恩替卡韦的剂量为约0.1mg至约5mg。
197.根据权利要求188的组合物，其中恩替卡韦的剂量为约10mg至约500mg。
198.根据权利要求188的组合物，其中所述组合物包含式(I)化合物的混合物，例如式(Ib)和式(Ic)化合物。
199.根据权利要求190的组合物，其中所述组合物包含式(II)化合物的混合物，例如式(IIb)和式(IIc)化合物。
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