CN103298475A - 作为治疗剂的寡核苷酸类似物的设计 - Google Patents

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Abstract

本发明是有关于可用于各种治疗用途的短寡核苷酸及其类似物(诸如二核苷酸及三核苷酸化合物)的设计。据信本发明化合物可用作为抗病毒剂、抗癌剂等。于若干实施例中，本发明化合物可调控免疫刺激路径及非TLR路径。本发明也是有关于设计用于治疗用途的改性寡核苷酸，通过来自该改性寡核苷酸的具有非目标效应的核苷酸节段除外。于另一方面，本发明提供包括一或多个本发明化合物的医药组成物。相信此处描述的化合物及组成物具有对抗多种疾病的治疗用途，包括病毒性疾病、自体免疫病(诸如过敏、气喘、及发炎病症)及癌症。

Description

作为治疗剂的寡核苷酸类似物的设计
技术领域
本案请求于2010年8月30日提出申请的美国临时专利申请案第61/402,380号的权益。前述申请的完整教导以引用方式并入本文。
背景技术
先天免疫力于身体对抗原核病原及真核病原，诸如病毒、细菌、真菌、寄生虫等的防御上扮演关键性要角。确实，由病毒所引起的急性感染及慢性感染造成全球重大公共卫生危机，且仍有显著医疗缺口未能满足。除了传染病之外，病毒引发全球所有癌症15至20%，包括肝癌、子宫颈癌、及胰癌，各自导致显著死亡率及罹病率。除了病人受苦之外，病毒性疾病也导致重大医疗成本支出与生产力的丧失。举例言的，全球有五亿至六亿人慢性感染B型肝炎病毒(HBV)及C型肝炎病毒(HCV)，及每年有一百万至两百万人死于病毒诱发的肝硬化及肝癌。全球有数以万计的病人迫切需要肝脏移植。人类乳突瘤病毒感染导致子宫颈癌，人类免疫缺乏病毒(HIV)感染相关卡波西氏肉瘤也已有明确的文献记载。泛流行性感冒的特征是于人类有高致死率及高发病率，且由于对流感的新抗原亚型缺乏既存的免疫力，造成感染程度及致病性增高。抗病毒药不仅可能减缓流感的传播，同时最终也将成为解决的道。
虽然疫苗可用于对抗有限数目的病毒作为预防的道，但疫苗对已感染者并无实际疗效。此外，对抗某些病毒的疫苗(例如流感疫苗)对于大流行时的致死率并无显著效果，原因在于已经辨识出新的人类流感病毒种系的后，需要时间才能生产出足够剂量的适当疫苗。
结果，人类的抗病毒防御几乎全然仰赖抗病毒药的使用。不幸地，许多医疗上重要的病毒(特别是RNA病毒)危险性高，无法以模型系统作试验，或无法传递作潜在候选药物测试。又复，也已发现病毒也持续地演化出更高明的策略来躲避宿主的免疫反应，且通过各种机转来发展抗药性。
目前已经发展多种抗病毒药呈病毒聚合酶、蛋白酶、接合酶、及进入抑制剂。但设计来抑制病毒生长的药物也对宿主细胞具有不良效应，原因在于病毒的生命周期是与正常的宿主细胞功能相嵌合。适合用于抗病毒介入的病毒性标靶有限更进一步使得抗病毒药的发现变复杂化。结果，尽管抗病毒研究已经接近五十年，但抗病毒药的武器仍然少得可怜，全球市场上只有约34种抗病毒药，大部分是对抗HIV及疱疹病毒。此外，目前用于若干慢性病毒性疾病包括HCV及HBV的治疗选项仍然极为有限且极具挑战性。确实，当治疗停止时病毒性反跳，药物诱发毒性，及在抗病毒药的选择压力下抗药性种系的出现仍然持续成为目前抗病毒治疗的重大问题。罕见能够完全根除病毒，且至多只出现在一小群的病人，原因在于目前抗病毒治疗所产生的抗病毒反应不足且不持久。
确实需要发展出具有其它抗微生物策略的新药。
发明内容
发明人发现某些短寡核苷酸化合物具有潜力能够刺激先天免疫反应，造成IRF3的活化，制造细胞干扰素，及诱导抗微生物胜肽的产生。于一个实施例中，本发明化合物乃具有刺激先天免疫反应的能力的二核苷酸及三核苷酸化合物。于若干实施例中，本发明的短寡核苷酸化合物含有至少一个化学改性。
据信本发明化合物具有抗微生物活性，因而可用作为抗微生物剂。于一个实施例中，该等化合物具有对抗多种病毒性基因型及抗药性种系的广效性抗病毒活性。
于某些情况下，本发明化合物具有对抗RNA病毒及/或DNA病毒的抑制活性。此等RNA病毒及/或DNA病毒例如可为肝炎病毒(例如HCV及HBV等)、人类乳突瘤病毒(HPV)、仙台(Sendai)病毒、牛痘病毒、流行性感冒病毒及其它黄病毒属(flaviviruses)。
本发明化合物或其医药上可接受的盐类或医药上可接受的配方是可用于病毒性感染及由肝炎病毒所引发的其它病况，诸如肝发炎、肝硬化、急性肝炎、猛爆性肝炎、慢性肝炎、及其它肝脏疾病的预防与治疗。本发明化合物及配方也可预防性地用来防止肝炎感染个体的疾病的病程。
一个实施例提供本发明化合物具有免疫刺激特性。一个实施例提供该化合物可用作为抗癌剂。
于另一个实施例中，咸信该等化合物与其它抗病毒药用于组合治疗具有协同性。于另一个实施例中，本发明化合物具有广效性抗细菌及抗寄生虫活性。
于一个方面，本发明是有关于一种式(I)化合物：
Figure BDA00003117462100021
式(I)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m=1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根。
于一个实施例中，式(I)化合物并非化合物5(参见下文)。
于一个实施例中，式(I)化合物具有抗微生物活性且能够于试管内或于活体内诱导细胞制造抗微生物胜肽。更明确言的，该化合物是为
Figure BDA00003117462100031
(化合物5)或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物。
于另一个方面，本发明提供一种式(II)化合物：
Figure BDA00003117462100032
式(II)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
X=不存在、O、NH、NR、或S；
X1=不存在、O、或NH；
A=不存在、芳基、或芳烷基；
n=0、1、2、3、4、或5；
R=烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-烷基、-O-杂芳基、或类固醇基；
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m为1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根。
于一个实施例中，式(II)化合物是非为化合物6k(参见下文)。于另一个实施例中，当m为2时，R4是非为H。
于一个实施例中，该化合物能够诱导细胞制造抗微生物胜肽。于一种情况下，该化合物是为
Figure BDA00003117462100041
(化合物6k)，
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物。
本发明也是有关于某些细胞胜肽用作为预测药物的抗微生物活性功效的生物标记的用途。举例言的，于C型肝炎及B型肝炎病人，生物标记的存在可用以预测抗病毒治疗功效，例如投予干扰素后病毒数的减少及持续性病毒性反应。
一个实施例提供一种使用细胞性红血球外衍生血色素(EEEH)蛋白质作为生物标记，而测量患有抗微生物感染的一个体的抗微生物反应的方法。
又，本发明是有关于一种于一个体调控双股RNA的免疫媒介功效的方法。于一个实施例中，该方法是包含对该个体投予有效量的具有本发明化合物的核苷酸节段的siRNA。于另一个实施例中，该方法是包含对该个体投予有效量的具有本发明化合物的二核苷酸突出部的siRNA。
也提出一种于一个体调控单股RNA的免疫媒介功效的方法。该方法是包含对该个体投予有效量的具有本发明化合物的核苷酸节段的化学改性RNA。
于另一个实施例中，本发明提出一种于一个体调控单股RNA的免疫媒介功效的方法，该方法是通过对该个体投予有效量的具有本发明化合物的核苷酸节段的化学改性RNA。
本发明也提出一种调控具有化学改性核苷酸节段的单股RNA的免疫媒介功效的方法。于一个实施例中，使用具有经化学改性的末端(诸如dA-ps-U2’OMe)的二核苷酸。
于一个方面，本发明是有关于一种最小化合成寡核苷酸的非目标效应的方法。该方法是包含：
a)识别于寡核苷酸上的化学改性，其中该化学改性将使得改性寡核苷酸具有非期望的免疫媒介效应；及
b)当设计用于治疗用途的合成寡核苷酸时，排除该化学改性。
本发明的一个方面提出一种设计增强化学改性寡核苷酸在一个体中的抗癌作用的方法。该方法是包含对该个体投予有效量的本发明化合物，该化合物是能刺激细胞雕亡路径。
又，本发明提出一种最小化化学改性寡核苷酸的非目标效应的方法，该方法是包含当本发明化合物的节段经识别已经引发非期望的免疫媒介效应时，排除该节段的使用。
于一个实施例中，本发明是有关于一种设计用于治疗用途的改性寡核苷酸的方法。该方法是包含：
a)提供化合物的核苷酸节段，其中该化合物是为：
或
Figure BDA00003117462100052
或其类似物；
b)评估该核苷酸节段的非目标效应；及
c)从该改性寡核苷酸排除该核苷酸节段。
本发明进一步提出一种通过对一个体投予任一种有效量的本发明化合物而于该个体治疗病毒性感染或癌症的方法。
于另一方面，本发明是有关于用于抑制微生物活性的医药组成物，该等医药组成物是含有有效量的本发明化合物。
也揭示一种于宿主(包括人类)治疗病毒性感染的方法，包括投予有效量的本发明化合物(包括其医药上活性盐)，其是单独投药或组合另一种或其它抗病毒剂投药或循序投药。
也揭示一种于宿主(包括人类)治疗细菌性感染的方法，包括投予有效量的本发明化合物，其是单独投药或组合另一种或其它药剂投药或循序投药。
也揭示一种于宿主(包括人类)治疗寄生虫感染的方法，包括投予有效量的本发明化合物，其是单独投药或组合另一种或其它药剂投药或循序投药。
也揭示一种于宿主(包括人类)治疗真菌性感染的方法，包括投予有效量的本发明化合物，其是单独投药或组合另一种或其它药剂投药或循序投药。
本发明化合物包括二-核苷酸及三-核苷酸。二-核苷酸及三-核苷酸的若干实施例包括但非仅限于3-dApsU2’-OMe、3’dApsA7deaza、及3’-dApsTpsC及其类似物，于该处“ps”表示硫代磷酸根核苷酸间键联。
此处描述的化合物可通过多种递送投径投予，诸如口服、静脉、舌下、鼻内、局部等。
由于许多干扰素相关基因产物能够诱发细胞雕亡，该等化合物可诱使受微生物感染(例如病毒性感染)的细胞出现选择性细胞死亡。同理，诱生细胞抗微生物胜肽也诱使癌细胞的选择性细胞雕亡。因此，此处描述的化合物及组成物可单独使用或组合其它化合物以用作为抗癌剂。
本发明也教示熟谙技艺人士核苷酸组成物于寡核苷酸(反讯息及siRNA)的最佳设计的用途，以获得RNA及蛋白质及受体(适配体、免疫调节寡核苷酸)的改良性及选择性锁定目标。
附图说明
后文中将参考下列非限制性实施例及参考下列图式进一步详细说明本发明，其中：
图1显示于接受化合物6k治疗的B型肝炎感染的基因转移小鼠体内作为抗病毒胜肽的红血球外衍生血色素(EEEH)的表现增高。
图2显示于基因转移小鼠体内以剂量相依性方式，口服投予化合物6k的抗-HBV活性与EEEH表现的相关性。
图3显示舌下投予化合物5的后抗微生物蛋白质EEEH的表现。
图4显示于土拨鼠舌下投予化合物5的后EEEH的表现。
图5为通过分子模型产生的线图，显示化合物5及6k乃腺苷三磷酸(ATP)仿真物。
图6为显微照片显示于由巨噬细胞制造介白素-2的BCG效应存在下，于使用化合物5及6k处理的PBMC中诱生IFNβ。
图7阐释寡核苷酸类似物(化合物5显示为SB40，及化合物6k显示为SB44)对BCG初始(primed)的巨噬细胞中的IL2表现的影响效应。
具体实施方式
病毒也已经连续演化出更聪明的策略来避开宿主免疫反应，及通过多项机转来发展出抗药性。已经认知DNA病毒及RNA病毒二者抑制I型干扰素(IFN)的制造，因而暗示控制IFN反应乃广泛范围的病毒存活所必须(Akira,S.等人，Cell,24,783-801,2006；及Katze等人，Nature Review，2，675，2002年9月)。如此，有效抗病毒治疗的发展必须涉及使用新颖类别药物的组合，各种药物具有新颖，多重作用机转包括刺激宿主免疫反应来根除病毒者。
脊椎动物系统恒常受到入侵的微生物攻击，且已经发展出免疫媒介防御来清除病原。哺乳动物免疫系统包含先天免疫成分及后天免疫成分。先天免疫系统通过有限数目的胚源编码病原辨识受体(PRR)辨识微生物(Akira,S.等人，Cell，24，783-801，2006；及Katze等人，Nature Riew，2，675，2002年9月)。吞噬细胞诸如巨噬细胞及树状细胞媒介先天免疫反应。后天免疫反应的特征为涉及淋巴细胞携带由诸如基因重排的机转所产生的抗原特异性受体的特异性。先天免疫于调节肝脏损伤、纤维化及再生扮演重要角色。例如，天然杀手细胞(NK细胞)通过干扰素活化可为治疗肝硬化的新颖策略。原因在于NK细胞的活化可杀死特异性活化的肝脏星状细胞(HSC)，由此改善肝硬化及肝肿瘤形成。因此，本发明揭示的寡核苷酸类似物可用于抑制肝纤维化及肝癌的病程。
逐渐认知细胞的病毒感染通过宿主的PRR结合至病毒产物内部的病原相连结的分子样式(PAMP)而触发免疫媒介抗病毒反应，因而导致胞内传讯路径(3,4)的活化。类铎受体(TLR)为整合细胞膜糖蛋白，其特征为含有多个白胺酸丰富重复(LRR)部分的胞外功能域及与介白素1受体同源的胞质传讯功能域。TLR在演化上从蠕虫保留至哺乳动物(Takeda,K.等人，International Immunology，17，1-14，2005)。TLR可辨识宽广多种配体，诸如脂多醣、植物二萜太平洋紫杉、RSV的融合蛋白、纤维连接蛋白、及热震蛋白全部皆具有各种不同结构式。TLR1、2、4、5及6是表现于细胞表面上，而TLR3及7-9是表现于胞内隔间诸如胞内囊胞。TLR辨识细菌包括分枝杆菌、真菌、原虫寄生虫及病毒。多种病毒结构成分包括微生物DNA、双股RNA、单股RNA、表面糖蛋白、细胞壁成分诸如胞壁醯基二肽被辨识为PAMP。TLR3、7、8及9是涉及病毒核酸包括DNA病毒的辨识。TLR9辨识单纯疱疹病毒1、2及鼠细胞巨病毒的基因体，富含CpG DNA部分。认知CpG DNA通过刺激TLR9而活化发炎性细胞激素及I型IFN的分泌。如此，由PRR辨识核酸常见诱导I型IFN的制造可活化标靶细胞的抗病毒作用。
微生物也已演化来避开保护宿主细胞免于被感染的免疫反应。确实，DNA病毒及RNA病毒二者抑制细胞IFN的制造(I型，IFN-α，IFN-β)。胞内IFN为强力抗病毒细胞激素，其表现及制造是由存在于未经感染细胞内胞质的转录因子IRF3(IFN调节因子3)媒介。一旦细胞感染则IRF3活化，病毒成分(也称作为病原相连结分子样式(PAMPS)，例如病毒基因体、病毒蛋白质等)由特化的病毒传感器或样式辨识受体(PRR)辨识。活化IRF3转位至细胞核来转移活化IFN基因的表现。IFN的制造通过多个机转诱发保护抗病毒效应(通过旁分泌及自分泌活性)诸如(i)活化先天及后天免疫反应，(ii)通过制造抗病毒因子及有益的发炎前期因子而于细胞诱生抗病毒状态，及(iii)控制病毒感染细胞的细胞雕亡。因此，PRR为IFN-反应的主要成分。最近，已经发现属于核苷酸寡聚合功能域(NOD)蛋白质家族的NOD2乃PRR，侦测包括RSV及流感A的单股RNA(ssRNA)病毒。令人感兴趣地，类似病毒传感器RIG-I，NOD2的活化也导致IFN制造及NF-κβ诱发的传讯串级，促成受控制的发炎前期反应来强化IFN的抗病毒作用。因NOD2为病毒传感器，检测宽广范围的ssRNA病毒，诸如RSV及流感A，故呈现独特的用于抗病毒发现的宿主标靶及对抗抗病毒抗药性。
类似NOD2，RIG-I为宿主胞溶蛋白，辨识双股病毒RNA为活化1型干扰素免疫防御的PAMP，由此抑制病毒复制，也遏止细胞许可病毒感染(例如参考Saito,T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,10,No.2,582-587,2007；Meylan,E.等人，Nature，437，1167-1172，2005；Hiscott,J.等人，TRENDS in Molecular Medicine，12，53-56，2006；Cui,S.等人，Molecular Cell，29，169-179，2008；Yoneyama，M.等人，Nat.Immunol.5,730-737,2004；Hornung,V.等人，Science，314，994-997，2006；Pichlmair,A.等人，Science，314，997-1001，2006；Myong,S.等人，Science，323，1070，2009；及Gack,M.U.等人，Proc Natl Acad Sci U S A.105(43):16743-8，2008)。RIG-I为检测宽广范围的RNA病毒，诸如黄病毒包括C型肝炎病毒、仙台病毒、流感病毒、以及水泡性口炎病毒、狂犬病病毒及日本脑炎病毒的病毒传感器。呈示独特的宿主标靶用以获得广效性抗病毒活性。
虽然HBV为DNA病毒，但HBV使用基因体前RNA样板来引发DNA的合成，可能因此RIG-I可为HBV pgRNA的受体。发明人发现某些二核苷酸化合物具有潜力通过RIG-I路径的活化以刺激先天免疫及诱发干扰素的制造。此等化合物也可用于预防性地对抗病毒感染，且可用于疫苗内部作为辅剂。
病毒传感器RIG-I为由C端调节功能域(RD)、两个末端卡斯伯酶(caspase)活化及召集功能域(CARDS)以及一个中央ATPase功能域所组成的多元体胞溶体蛋白。病毒双股RNA(dsRNA)及5’-三磷酸乃两种PAMP，其使得RIG-I区别病原性RNA(带有及未带有三磷酸的dsRNA)与宿主RNA(通常在末端具有一个“帽”修改)。此外，RIG-I有能力通过转位现象感测病毒性RNA(Myong等人，Science323，1070.2009)。RIG-I转位及在病毒性基因体的dsRNA上重复穿梭触发RIG-I进行构象改变，活化其ATPase，及暴露出CARDS进行泛在。于次一步骤中，CARDS与粒线体抗病毒传讯(MAVS)交互作用[也称作为干扰素β刺激剂[(IPS-1)或VISA]来提引出下游传讯结合至I型IFN表现(IFN-α,β)。
NOD2及RIG-I为多元体蛋白质，其结构及组织上极为类似。如此类似RIG-I，NOD2含有CARD功能域。此外，RIG-I及NOD2皆含有位在NBD功能域(核苷酸结合功能域)(用于NOD2)及解旋酶(helicase)(用于RIG-1)功能域的核苷酸结合口袋。分子模型研究显示某些二核苷酸组成物可重叠在结合NBD的核苷酸三磷酸(NTP)结构上。发明人假设短核苷酸作为NTP仿真物，结合至NOD2(及RIG-1)的NBD及造成其对下游抗病毒作用的活化。
又，寡核苷酸组成物作为反讯息化合物，如RNA干扰及微RNA化合物已经利用来通过抑制相对应标靶信使RNA的转译，而将标靶蛋白质表现向下调节(例如参考Iyer,R.P.等人，Drugs of the Future，2003，28，51-59；Mirabelli,C.T.等人，S.T.Crooke及B.Lebleu(编辑)CRC出版社，纽约1993，7-35；及Szymkowski,D.E.等人，Drug.Disc.Today，1996，1，415-28)。标靶信使RNA的杂交诱生抑制机转为技艺界众所周知。也已经了解此等化合物可杂交至其它偏离标靶信使RNA，及抑制蛋白质的制造。
Figure BDA00003117462100091
siRNA具有突出部
siRNA完美成对
具有2至3个核苷酸突出部的siRNA为RNAi的有效媒介
核酸也与病毒传感器诸如TLR、RIG-I、NOD2等交互作用，造成偏离标靶效应，结果导致副作用及毒性。于某些情况下，寡核苷酸组成物已经设计为适配体，其意图与目标脱序蛋白质特异性地结合且阻断其活性。于其它情况下，某些寡核苷酸组成物含有已知可刺激免疫路径的特定结构部位(例如CpG部位)。于全部此等所欲的寡核苷酸治疗应用中，寡核苷酸产生序列特异性及序列非特异性副作用及“偏离标靶”效应。
既有的范例为RNAi的特定组成物及反讯息活性及/或刺激免疫路径之外，寡核苷酸须理想上具有18至26个核苷酸链长度。例如，对于由siRNA所诱发的RNA干扰，双股RNA的各阶段长度须为19至28个核苷酸。用于反讯息应用，单股寡核苷酸的链长度须为约19至21个寡核苷酸长。然而，吾人发现较短的寡核苷酸片段具有复杂的生物效应。此等短片段可来自于较长的寡核苷酸的代谢作用，该代谢作用是由细胞内所存在的核酸内切酶及核酸外切酶媒介。此等具有特定结构属性的较短片段通过与存在于细胞的RIG-I、NOD、或TLR受体交互作用，而活化某些免疫路径。此种交互作用由于下游效应可能产生偏离标靶效应，诸如诱生化学激肽及细胞激素表现以及发炎前期因子及抗发炎因子。结果，与较长寡核苷酸相连结的偏离标靶效应及副作用可与来自于代谢产物片段相连结，诸如二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸等与细胞蛋白质及受体交互作用。如此，偏离标靶效应须通过合理的选择寡核苷酸内部的自然节段及化学改性节段加以最小化。
本发明是有关于核苷酸组成物的设计用以获得寡核苷酸(反讯息及siRNA来改进RNA的锁定目标)及蛋白质及受体(适配体、免疫调节寡核苷酸)的最佳设计。
发明人发现某些短寡核苷酸化合物具有潜力刺激先天免疫反应及造成IRF3活化，产生细胞干扰素，及诱发抗微生物胜肽的制造。于某些情况下，相信有些二核苷酸及三核苷酸化合物能够刺激先天免疫反应。
定义
“抗微生物”一词是表示可有效对抗病毒、细菌、真菌及寄生虫感染的化合物。
“癌症”一词是指通过入侵而局部性扩展以及通过转移而全身性扩展的可能无限制生长的恶性肿瘤。
如此处使用“芳基”一词是指具有一或二个芳香环的单环或多环的芳香环，其包括，但非仅限于，苯基、萘基、四氢萘基、四氢茚基、茚基等。
如此处使用“杂芳基”一词是指具有5至10个环原子的单环或多环(例如二环、或三环或以上)的芳香族基团或芳香环，其中一个或多个环原子是选自于例如S、O及N；0、1或2个环原子为分别选自于例如S、O及N的额外杂原子；及其余环原子为碳，其中环中所含的任一个N或S可选择性地经氧化。杂芳基包括但非仅限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、恶唑基、异恶唑基、噻二唑基、恶二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并恶唑基、苯并恶啉基等。
依据本发明，此处所述芳基、经取代的芳基、杂芳基及经取代的杂芳基中的任一者可为任何芳香族基。芳香族基可经取代或未经取代。
如此处使用“烷基”一词是指分别含有1至6个或1至12个碳原子的饱和直链或分支链烃基。C1-C6烷基的实例包括，但非限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、第三丁基、新戊基、及正己基；及C1-C12烷基的实例包括，但非仅限于，乙基、丙基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基。
“芳烷基”或“芳基烷基”等词涵盖经芳基取代的烷基诸如苯甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、苯基乙基、及二苯基乙基。
如此处使用“杂环系”或“杂环基”等词是指非芳香族5-、6-或7-员环或二环或三环基稠合环系，于该处(i)各环含有1至3个个别选自于氧、硫及氮的杂原子，(ii)各个5员环具有0至1个双键及各个6员环具有0至2个双键，(iii)氮及硫杂原子可选择性地经氧化，(iv)氮杂原子可选择性地经季铵化，(iv)前述任一环可稠合至苯环，及(v)其余环原子为选择性地经侧氧基取代的碳原子。代表性杂环烷基包括，但非仅限于，[1,3]二氧戊环，吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、恶唑啶基、异恶唑啶基、吗啉基、噻唑啶基、异噻唑啶基、喹恶啉基、嗒嗪酮基、及四氢呋喃基。此等杂环系基团可进一步经取代。
如此处使用“环烷基”一词表示通过去除单一氢原子而衍生自单环或多环的饱和碳环系环的一价基团。实例包括，但非仅限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、二环[2.2.1]庚基、及二环[2.2.2]辛基。
如此处使用“经取代的芳基”、“经取代的烷基”、“环烷基”等词是指如先前定义的芳基、烷基及环烷基使用取代基独立地置换其上氢原子中的一者、二者、三者或更多者，该等取代基包括但非仅限于-F、-Cl、-Br、-I、-OH、经保护的羟基、-NO2、-CN、-NH2、经保护的胺基、-NH-C1-C12-烷基、-NH-C2-C12-烯基、-NH-C2-C12-烯基、-NH-C3-C12-环烷基、-NH-芳基、-NH-杂芳基、-NH-杂环烷基、-二烷基胺基、-二芳基胺基、-二杂芳基胺基、-O-C1-C12-烷基、-O-C2-C12-烯基、-O-C2-C12-烯基、-O-C3-C12-环烷基、-O-芳基、-O-杂芳基、-O-杂环烷基、-C(O)-C1-C12-烷基、-C(O)-C2-C12-烯基、-C(O)-C2-C12-烯基、-C(O)-C3-C12-环烷基、-C(O)-芳基、-C(O)-杂芳基、-C(O)-杂环烷基、-CONH2、-CONH-C1-C12-烷基、-CONH-C2-C12-烯基、-CONH-C2-C12-烯基、-CONH-C3-C12-环烷基、-CONH-芳基、-CONH-杂芳基、-CONH-杂环烷基、-OCO2-C1-C12-烷基、-OCO2-C2-C12-烯基、-OCO2-C2-C12-烯基、-OCO2-C3-C12-环烷基、-OCO2-芳基、-OCO2-杂芳基、-OCO2-杂环烷基、-OCONH2、-OCONH-C1-C12-烷基、-OCONH-C2-C12-烯基、-OCONH-C2-C12-烯基、-OCONH-C3-C12-环烷基、-OCONH-芳基、-OCONH-杂芳基、-OCONH-杂环烷基、-NHC(O)-C1-C12-烷基、-NHC(O)-C2-C12-烯基、-NHC(O)-C2-C12-烯基、-NHC(O)-C3-C12-环烷基、-NHC(O)-芳基、-NHC(O)-杂芳基、-NHC(O)-杂环烷基、-NHCO2-C1-C12-烷基、-NHCO2-C2-C12-烯基、-NHCO2-C2-C12-烯基、-NHCO2-C3-C12-环烷基、-NHCO2-芳基、-NHCO2-杂芳基、-NHCO2-杂环烷基、-NHC(O)NH2、-NHC(O)NH-C1-C12-烷基、-NHC(O)NH-C2-C12-烯基、-NHC(O)NH-C2-C12-烯基、-NHC(O)NH-C3-C12-环烷基、-NHC(O)NH-芳基、-NHC(O)NH-杂芳基、-NHC(O)NH-杂环烷基、NHC(S)NH2、-NHC(S)NH-C1-C12-烷基、-NHC(S)NH-C2-C12-烯基、-NHC(S)NH-C2-C12-烯基、-NHC(S)NH-C3-C12-环烷基、-NHC(S)NH-芳基、-NHC(S)NH-杂芳基、-NHC(S)NH-杂环烷基、-NHC(NH)NH2、-NHC(NH)NH-C1-C12-烷基、-NHC(NH)NH-C2-C12-烯基、-NHC(NH)NH-C2-C12-烯基、-NHC(NH)NH-C3-C12-环烷基、-NHC(NH)NH-芳基、-NHC(NH)NH-杂芳基、-NHC(NH)NH-杂环烷基、-NHC(NH)-C1-C12-烷基、-NHC(NH)-C2-C12-烯基、-NHC(NH)-C2-C12-烯基、-NHC(NH)-C3-C12-环烷基、NHC(NH)-芳基、-NHC(NH)-杂芳基、-NHC(NH)-杂环烷基、-C(NH)NH-C1-C12-烷基、-C(NH)NH-C2-C12-烯基、-C(NH)NH-C2-C12-烯基、-C(NH)NH-C3-C12-环烷基、-C(NH)NH-芳基、-C(NH)NH-杂芳基、-C(NH)NH-杂环烷基、-S(O)-C1-C12-烷基、-S(O)-C2-C12-烯基、-S(O)-C2-C12-烯基、-S(O)-C3-C12-环烷基、-S(O)-芳基、-S(O)-杂芳基、-S(O)-杂环烷基-SO2NH2、-SO2NH-C1-C12-烷基、-SO2NH-C2-C12-烯基、-SO2NH-C2-C12-烯基、-SO2NH-C3-C12-环烷基、-SO2NH-芳基、-SO2NH-杂芳基、-SO2NH-杂环烷基、-NHSO2-C1-C12-烷基、-NHSO2-C2-C12-烯基、-NHSO2-C2-C12-烯基、-NHSO2-C3-C12-环烷基、-NHSO2-芳基、-NHSO2-杂芳基、-NHSO2-杂环烷基、CH2NH2、-CH2SO2CH3、-芳基、-芳基烷基、-杂芳基、-杂芳基烷基、-杂环烷基、-C3-C12-环烷基、多烷氧基烷基、多烷氧基、-甲氧基甲氧基、-甲氧基乙氧基、-SH、-S-C1-C12-烷基、-S-C2-C12-烯基、-S-C2-C12-烯基、-S-C3-C12-环烷基、-S-芳基、-S-杂芳基、-S-杂环烷基、或甲硫基甲基。须了解芳基、杂芳基、烷基等可经进一步取代。
如此处使用“类固醇基”一词是指具有17个碳原子排列成四个环作为基础的多种天然或合成脂溶性有机化合物中的任一者，包括固醇类及胆酸类、肾上腺激素及性激素、某些天然药物诸如毛地黄化合物，及某些维生素的前驱物。类固醇结构式的实例包括，但非仅限于，胆固醇、胆固烷醇、3α-环-5-α-胆固烷-6-β-醇、胆酸、甲酸胆固醇酯、甲酸胆固烷醇酯。
如此处使用“改性核苷”一词是指任何核苷，包括改性杂环碱基、改性糖部分或其组合。于若干实施例中，改性核苷为如此处所述的非天然嘧啶或嘌呤核苷。改性核苷的实例包括但非仅限于2’-经取代的核糖核苷及阿拉伯糖核苷或2’-去氧-2’-氟代阿拉伯糖苷、去吖-腺嘌呤、去吖鸟嘌呤。
“调控”一词是指响应于对本发明化合物的反应的参数的增减。
用于本发明的目的，“短寡核苷酸”(SMNH)一词是指由1至约6个链接核苷单元所形成的一核苷、二核苷或多核苷。此等短寡核苷酸可得自既有的核酸来源，包括基因体或cDNA，但较佳是通过合成方法制造。核苷残余物可通过多种已知的核苷间键联而彼此偶合。此种核苷间键联可经改性或未经改性且包括但非仅限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代磷酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯、硅氧烷、碳酸酯、烷氧基甲醯基、乙醯胺酸酯、胺基甲酸酯、吗啉基、硼烷基、硫醚、桥接磷醯胺酸酯、桥接亚甲基膦酸酯、桥接硫代磷酸酯、及砜核苷间键联。“短核苷酸”一词也涵盖具有一或多个立体特异性核苷间键联(例如(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、或磷酸三酯键联)的多核苷。本发明的短核苷酸也包括任何此等核苷间键联，无论该键联是否包含一个磷酸基。于若干较佳实施例中，此等核苷间键联可经改性或未经改性，且包括但非仅限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、或二硫代磷酸酯键联或其组合。
“短核苷酸”一词也涵盖额外取代基包括，但非仅限于，蛋白质基、亲脂基、嵌合基、二胺、叶酸、胆固醇及金刚烷。
“短核苷酸”一词也涵盖含有任何其它核碱基的聚合物，包括但非仅限于胜肽核酸(PNA)、具有磷酸基的胜肽核酸(PHONA)、经锁定的核酸(LNA)。
PNA及LNA的实例显示如下：
Figure BDA00003117462100131
PNA二核苷酸         LNA二核苷酸
“核苷酸”是指核酸亚单位[无论DNA或RNA或其类似物诸如胜肽核酸(PNA)及锁定核酸(LNA)]，包括任何核苷酸经键联、糖基及杂环碱基，诸如此等亚单位的类似物。“核苷”是指包括糖基及杂环系核碱基的核酸亚单位。须了解如此处使用“核苷”及“核苷酸”等词将包括不仅含有天然核苷酸间键联的部分(就“核苷酸”而言)诸如磷酸二酯核苷酸间键联；天然糖部分诸如核糖及去氧核糖部分；及天然核碱基诸如嘌呤碱基及嘧啶碱基，例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、或尿嘧啶(U)，同时也包括改性核苷酸间键联、改性糖部分、及改性嘌呤或嘧啶碱基或其类似物或经改性或未经改性核苷酸间键联、糖部分及嘌呤及嘧啶碱基的任一种组合。改性核苷的其它实例包括无环核苷，是由核糖及去氧核糖部分的开环版本所组成。相对应地，此等开环核苷可用以形成改性核苷。改性核苷的其它实例包括C核苷诸如假-异胞苷、及核苷仿真物包括核苷电子等排体诸如胜肽核酸单体，及锁定核酸单体。
“个体”一词包括患有诸如此种所述病况或病症的有机体。个体可为人类及非人动物、细胞、或任何活生物(例如病毒、真菌、微生物)。人类动物包括患有或容易患有如此处所述的一病症或疾病的人类病人。非人动物包括全部脊椎动物例如哺乳动物，例如啮齿类，例如小鼠及非哺乳类，诸如非人灵长类，也包括绵羊、犬、牛、鸡、两栖类及爬虫类。微生物可为任何连续存活的系统(例如动物、真菌、微生物等)。于至少某种形式中，全部生物体皆对刺激、繁殖、生长及发育有反应，且可维持整体的体内恒定。
缩写
本案使用的缩写提供如下：
AcOH表示乙酸；
Boc2O表示二碳酸二-第三丁酯；
Boc表示第三丁氧基甲醯基；
Bpoc表示1-甲基-1-(4-联苯基)乙基甲醯基；
Bz表示苯甲醯基；
Bn表示苯甲基；
BocNHOH表示N-羟基胺基甲酸第三丁酯；
t-BuOK表示第三丁氧化钾；
Bu3SnH表示氢化三丁基锡；
CDI表示甲醯基二咪唑；
CH2Cl2表示二氯甲烷；
CH3表示甲基；
CH3CN表示乙腈；
DMSO表示二甲亚砜；
EtOAc表示乙酸乙酯；
EtOH表示乙醇；
Et2O表示乙醚；
HCl表示氯化氢；
MeOH表示甲醇；
MOM表示甲氧基甲基；
Ms表示甲烷磺醯基或-SO2-CH3；
Ms2O表示甲烷磺酐或甲烷磺醯基-酐；
NaCl表示氯化钠；
NaH表示氢化钠；
NaHCO3表示重碳酸钠或碳酸氢钠；
Na2CO3表示碳酸钠；
NaOH表示氢氧化钠；
Na2SO4表示硫酸钠；
NaHSO3表示重亚硫酸钠或亚硫酸氢钠；
Na2S2O3表示硫代硫酸钠；
NH2NH2表示肼；
NH4HCO3表示重碳酸铵；
NH4Cl表示氯化铵；
OH表示羟基；
OMe表示甲氧基；
OEt表示乙氧基；
TEA或Et3N表示三乙基胺；
TFA表示三氟乙酸；
THF表示四氢呋喃；
TPP或PPh3表示三苯基膦；
Ts表示甲苯磺醯基或-SO2-C6H4CH3；
Ts2O表示甲苯基磺酐或甲苯磺醯基-酐；
TsOH表示对甲苯基磺酸；
Ph表示苯基；
TBS表示第三丁基二甲基硅烷基；或
TMS表示三甲基硅烷基；
TMSCl表示三甲基硅烷基氯。
化合物
于一个方面，本发明是有关于一种式(I)化合物：
式(I)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m=1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根。
于一个实施例中，式(I)化合物并非化合物5。
于另一个方面，本发明提供一种式(II)化合物：
Figure BDA00003117462100161
式(II)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
X=不存在、O、NH、NR、或S；
X1=不存在、O、或NH；
A=不存在、芳基、或芳烷基；
n=0、1、2、3、4、或5；
R=烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-烷基、-O-杂芳基、或类固醇基；
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m为1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根。
于一个实施例中，式(II)化合物是非为化合物6k。于另一个实施例中，当m为2时R4是非为H。
核苷单元是以国际接受的画线习惯表示。于下示实例中，2’-经取代的核糖核苷是表示于两个现有结构式及相对应的画线格式：
于某些情况下，本发明化合物为化合物5或化合物6k。
产生α或βN-或C-核苷的附接至B1及B2的糖单位包括，但非仅限于，呋喃糖、去氧核糖呋喃糖、核糖、及阿拉伯糖。
于若干实施例中，本发明化合物包含于“天然”核酸上的一或多个改性，亦即，天然核苷间键联，或核碱基G、C、T、U、A等。改性例如包括“天然”核酸的核苷酸间键联、碱基或糖部分的改性。
核碱基包括天然嘌呤及嘧啶核碱基及改性核碱基，其包括但非仅限于甲基化嘌呤类或嘧啶类、醯化嘌呤类或嘧啶类等，或添加保护基诸如乙醯基、二氟乙醯基、三氟乙醯基、异丁醯基、苯甲醯基等。嘌呤或嘧啶碱基也可为前述类似物；适当类似物为熟谙技艺人士已知且是描述于相关文字及参考文献。常见的类似物包括但非仅限于1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊基腺嘌呤、N,N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-胺基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-(甲基胺基甲基)尿嘧啶、5-(羧基甲基胺基甲基)-尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、奎苷(queosine)、肌苷、1-甲基肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-胺基嘌呤、6-羟基胺基嘌呤、6-硫嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、5-三氟甲基胸腺嘧啶、6-氯-腺嘌呤、7-去吖-腺嘌呤。其它实施例但非限制性包括5-氟-尿嘧啶、5-三氟甲基胸腺嘧啶、6-氯-腺嘌呤、2-环戊基氧基-腺嘌呤、7-去吖-腺嘌呤。
于若该实施例中，碱基可为非天然核碱基，包括通用核碱基。此等碱基的实施例包括，但非限于，二氟甲苯基、硝基吡咯基及硝基-咪唑基等。
也须了解“改性碱基”也是指“改性核碱基”，包括可为或可非为杂环系的含氮化合物。此等较佳含氮化合物包括但非仅限于-NHR18，其中R18为氢、丁氧基甲醯基(Boc)，苯甲基氧基甲醯基、烯丙基、经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的环烷基、经取代的或未经取代的芳烷基、经取代的或未经取代的芳基、经取代的或未经取代的杂芳基、或杂环基。
“改性核碱基”一词进一步意图包括于大部分传统意义中非属核苷碱基，但可用作为核苷碱基的杂环系化合物。此等化合物包括如技艺界已知的“通用碱基”。通用碱基包括芳香环部分，其可含有或可不含有氮原子。于若干情况下，通用碱基可共价附接至核苷的五碳糖的C-1’碳。通用碱基的实施例包括3-甲基-丙炔基甲醯苯乙烯基(PIM)、3-甲基异甲醯苯乙烯基(MICS)、及5-甲基异甲醯苯乙烯基部分。额外实施例包括肌苷衍生物、唑羧醯胺类似物、硝基唑类、及硝基咪唑类。
改性核苷酸及核苷的糖部分的实施例包括但非仅限于：海藻糖、阿拉伯糖、2’-去氧基-2’-经取代的戊糖部分、2’-O-经取代的戊糖部分、核糖、来苏糖、及木糖或己糖糖基。用于本发明的目的，所述糖基中任一者的“2’-取代”一词诸如“2’-经取代的核糖核苷”或“2’-经取代的阿拉伯糖苷”包括核糖核苷或阿拉伯糖核苷，其中在戊糖部分2’-位置的羟基是经取代来制造2’-经取代的或2’-O-经取代的核糖核苷或阿拉伯糖核苷。较佳地，此种取代具有含1至6个饱和或不饱和碳原子的低碳烷基，或具有含6至10碳原子的芳基，其中此种烷基、或芳基可为未经取代或经取代，例如使用卤原子、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、醯基、醯氧基、烷氧基、羧基、烷氧甲醯基、或胺基取代。2’-O-经取代的核糖核苷或2’-O-经取代的阿拉伯糖苷的实例包括但非仅限于2’-O-甲基核糖核苷(此处又以2’-OMe指示)或2’-O-甲基阿拉伯糖苷及2’-O-甲氧基乙基核糖核苷或2’-O-甲氧基乙基阿拉伯糖苷。“2’-经取代的核糖核苷”或“2’-经取代的阿拉伯糖苷”等词也包括核糖核苷或阿拉伯糖核苷其中2’-羟基是经以含1至6个饱和或不饱和碳原子的低碳烷基取代或以胺基或卤原子取代。此等2’-经取代的核糖核苷或2’-经取代的阿拉伯糖苷的实例包括但非仅限于2’-胺基、2’-氟、2’-烯丙基、及2’-丙炔基核糖核苷或阿拉伯糖苷。
改性核苷酸间键联的实例包括，但非仅限于：经取代及未经取代的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代磷酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯、硅氧烷、碳酸酯、烷氧基甲醯基、乙醯胺酸酯、胺基甲酸酯、吗啉基、硼烷基、硫醚、桥接磷醯胺酸酯、桥接亚甲基膦酸酯、桥接硫代磷酸酯、及砜核苷间键联。改性及未经改性核苷酸间键联的取代包括下列部分：
本发明化合物可含有一或多个不对称中心，如此可出现为外消旋物及外消旋混合物、单一对映异构物、非对映异构物混合物及个别的非对映异构物。本发明的目的为包括具有5-员呋喃糖环及β-D立体化学组态的短核苷酸化合物，亦即其中于5员呋喃糖环的C-1及C-4取代基具有β-立体化学组态的短核苷酸化合物(“向上”方向于此处显示的某些化学式中是以粗体线表示)。
于若干实施例中，本发明化合物可调控免疫刺激路径，诸如类铎受体(TLR)，以及非TLR路径，诸如涉及维生素A酸诱发基因-1(RIG-I)活化，及核苷酸寡聚合蛋白质(NOD)的该等路径。已知此等路径可以其个别的配体活化可诱导各种细胞激素及化学激肽诸如介白素、干扰素的制造，同时也导致某些细胞蛋白质的诱发，因而提供抗微生物免疫力。
于另一方面，本发明提供可抑制发炎路径的化合物的设计。本发明也是有关于特别设计的化合物的合成。如所设计及合成化合物对自体免疫病具有疗效。
于若干实施例中，本发明化合物具有对抗多种疾病的治疗用途，包括病毒性疾病、自体免疫病(诸如过敏、气喘、发炎病症)及癌症。
于若干实施例中，本发明化合物作为胞内微生物传感器的活化因子，造成免疫反应的活化。该等化合物显示对抗DNA病毒(HBV)及RNA病毒诸如HCV及RSV的抗病毒活性。咸信本案请求专利的化合物不仅可用于诱生免疫反应作为促效剂，同时也可用于阻断(拮抗)自体免疫病的非期望的免疫反应。
医药组成物
本发明也是有关于包含一或多种本发明化合物或其衍生物，及医药上可接受的载剂的医药组成物。于一个实施例中，本发明提供一种经由将前述任一种化合物与医药上可接受的载剂组合所制造的医药组成物。
本发明的医药组成物包含至少一种本发明化合物作为活性成分或其医药上可接受的盐，及也可含有医药上可接受的载剂及赋形剂及选择性地其它治疗性成分。“医药上可接受的”一词表示载剂、稀释剂、或赋形剂必须与配方中的其它成分可兼容且不会对其接受者有害。该等组成物也包括适合口服、直肠、局部、肠道外(包括皮下、肌肉内、及静脉)、眼用(眼科)、经肺脏(鼻吸入或颊吸入)、或鼻内投药的组成物，虽然任一种给定的情况下最适合的途径将取决于所接受治疗病症的本质及严重程度以及取决于活性成分的本质。但组成物可方便地以单位剂型呈现且可通过制药化学界人士众所周知的方法制备。
于若干实施例中，本发明化合物可依据任一种现有制药混料技术紧密混合医药载剂作为活性成分。该载剂可呈宽广多种剂型，取决于期望用以投药的剂型，例如口服投药或肠道外投药(包括静脉)。于制备口服剂型的组成物中，可采用任一种有用的医药媒剂，诸如以口服液体制剂为例的水、二醇类、油类、醇类、矫味剂、保藏剂、着色剂等，诸如悬浮液剂、酏剂及溶液剂；或载剂诸如淀粉、糖类、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘结剂、崩散剂等用于口服固体制剂，诸如散剂、硬胶囊剂及软胶囊剂及锭剂，以固体口服制剂优于液体制剂。
锭剂及胶囊剂由于投药容易，故表示最优异的口服单位剂型，该种情况下，显然采用固体医药载剂。若有所需，锭剂可通过标准水性或非水性技术包衣。此等组成物及制剂须含有至少0.1%活性化合物。此等组成物中的活性化合物百分比当然可改变且可方便地占该单位的约2%至约60%重量比。此种治疗有用组成物中活性化合物的含量将获得有效剂量。活性化合物也可经鼻内投予，例如液体滴剂或喷雾剂剂型。
锭剂、丸剂、胶囊剂等也含有粘结剂诸如西黄蓍胶、金合欢胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂诸如磷酸二钙；崩散剂诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸；润滑剂诸如硬脂酸镁；及甜味剂诸如蔗糖、乳糖或糖精。
当单位剂型为胶囊剂时，除了前述型别的材料之外，也可含有液体载剂诸如脂肪油。也可存在有多种其它材料作为包衣或修改单位剂型的物理形式。举例言的，锭剂可使用虫胶、糖或二者包衣。糖浆剂或酏剂除了活性成分之外可含有蔗糖作为甜味剂、甲基或乙基对羟基苯甲酸酯作为保藏剂、染料及矫味剂诸如樱桃口味或柳橙口味。可添加会使稳定化活性医药成分免于分解多种安定剂，诸如胺基酸类或多胺类。其它赋形剂包括，但非仅限于，PEG400、甘胺酸、维生素E衍生物、山梨聚糖一油酸酯、甲壳聚糖、柠檬酸胆碱、山梨聚糖一硬脂酸酯、吐温(Tween)80，伊杰帕(Igepal)CA630，布里吉(Brij)35，NP-40及其类似的衍生物。
本发明化合物也可经肠道外投予。此等活性化合物的溶液剂或悬浮液剂可于水中制备适当混合界面活性剂诸如羟基丙基纤维素。分散液也可于甘油、液体聚乙二醇及其混合物于油制备。于寻常储存及使用条件下，此等制剂含有保藏剂来防止微生物的生长。适合注射用的剂型包括无菌水性溶液剂或水性分散液剂及临时重新制备无菌注射用溶液剂或分散液剂的无菌粉末。所有情况下，该形式较佳为无菌，较佳为流动性至容易抽吸的程度。于制造及储存条件下须为安定，须保藏防止微生物诸如细菌及真菌的污染。载剂可为例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液体聚乙二醇)、其适当混合物及植物油的溶剂或分散介质。
任一种适当投药途径皆可采用来对哺乳动物特别为人类投予治疗有效剂量的本发明化合物。“投药”及“投予”化合物一词须了解表示提供本发明化合物给有需要的个体。投药途径例如包括但非仅限于口服、舌下、经粘膜、静脉、皮下、鼻内、局部、阴道等。
式1-2所述化合物可用于涉及宿主免疫成分的宽广范围的治疗领域，包括但非仅限于：过敏、发炎、自体免疫病、COPD、气喘等。由于实际上此等化合物可通过多种机转用作为免疫反应的调节剂，故将于自体免疫病具有治疗用途。例如由于化合物具有刺激先天免疫反应的潜力，故可单独或组合其它药剂，以用于治疗多种癌症包括，但非仅限于，黑素瘤、骨髓瘤、癌瘤、神经胶母细胞瘤及肉瘤。例如，由于某些寡核苷酸组成物可能抑制免疫反应，故可单独使用或组合其它制剂用于多个自体免疫病的治疗，包括但非仅限于过敏、气喘、COPD及多发性硬化。
本发明的治疗方法包含对个体投予有效量或抑制量的本发明化合物，其用量及使用时间为达成期望的结果所需。本发明的额外方法是以如所需要的用量及时间使用抑制用量的本发明组成物的化合物治疗生物样本，以达成期望结果。
如此处使用，“治疗有效量”的本发明化合物一词表示足量化合物，因此于生物样本或于个体产生有利的生物反应。如医疗业界众所周知，治疗有效量的本发明化合物将以合理的效益/风险比施用至任一种医疗处理。
抑制量或抑制剂量的本发明化合物可于约0.1毫克/千克至约500毫克/千克的范围，另外于约1至约50毫克/千克的范围。抑制量或抑制剂量也随投药途径，以及随共同使用其它药剂的可能性而改变。
如此处使用，“生物样本”一词表示意图投予个体的生物来源物质。生物样本的实例包括但非仅限于血液及其成分诸如血浆、血小板、血球亚群等；器官诸如肾、肝、心、肺、脑等；精子及卵子；骨髓及其成分；或干细胞。如此，本发明的另一个实施例为一种通过该生物样本接触抑制量的本发明化合物或医药组成物，而处理生物样本的方法。
若有所需，当个体的状况改善时，可投予维持剂量的本发明化合物、组成物或组合。接着，投药剂量或频率或二者可作为症状的函数减低至可维持改善状况的程度，当症状已经改善至期望程度时须停止治疗。但个体于疾病症状有任何复发时可能需要长时间间歇治疗。但须了解本发明化合物及组成物的总每日剂量将由临床医师在深刻医疗判定范围内决定。任何特定病人的特定抑制剂量将取决于多项因素，包括接受治疗的病症及病症严重程度；采用的特定化合物活性；采用的特定组成物；病人年龄、体重、全面健康状况、性别及饮食；所采用的特定化合物的投药时间、投药途径及排泄速率；治疗持续时间；组合或与所采用的特定化合物同时使用的药物；及医疗业众所周知的其它因素。
本发明化合物以单剂、多剂或平分剂量投予个体的总每日抑制剂量可于例如0.01至50毫克/千克体重或更常见0.1至25毫克/千克体重的范围。
单剂组成物可含有此等用量或其分数以组成每日剂量。多剂可为在不同时间间隔使用的单剂。一般而言，依据本发明的治疗计画包含对需要此种治疗的病人每日以单剂或以多剂投予约10毫克至约1000毫克本发明化合物。
于一个方面，本发明提供一种治疗、调控或预防如此处所述的病况或疾病的套组。该套组可包括本发明化合物或其核苷酸节段，及使用此种套组的指示。使用指示可包括有关剂量、递送方法、套组的储存等相关信息。套组也可包括试剂，例如测试化合物、缓冲剂、培养基(例如细胞生长培养基)、细胞等。测试化合物可包括已知化合物或新发现的化合物例如化合物的组合库。
组合治疗
本发明的另一方面是有关一种使用本发明化合物组合一或多种可用于治疗疾病的药剂的治疗方法。举例言的，对病毒具有活性的药剂包括拉米威定(Lamivudine)(3TC)、阿德佛维(Adefovir)、特诺佛维(Tenofovir)、甘塞克维(Gancyclovir)、亚希克维(acyclovir)、干扰素、利巴威灵Ribavirin)、特比威定(Telbivudine)；其它对抗COPD、气喘、过敏、过敏性鼻炎的药剂，包括但非仅限于茶碱、亚维斯柯(Alvesco)(赛克索奈(Ciclesonide))、帕塔内斯(Patanase)(欧帕提定(Olapatidine)盐酸盐)、里泰瑞(Litairis)、安贝森坦(Ambresentan)(吉里(Gilead))、希佐(Xyzal)(雷佛希特金(Levocetirizine)二盐酸盐)、波瓦纳(Brovana)(阿佛摩特罗(Arformoterol)酒石酸盐)、斯比瑞瓦(Spiriva(溴化崔彻平(Tritropium bromide))、克雷瑞奈(Clarinex)、二丙酸待克罗美沙松(Declomethsone)、瑞摩杜尼(Remodunil)(崔波史特尼(treprostenil)))、索沛尼(Xopenex)、杜欧奈(Duoneb)(阿布特罗(albuterol)及溴化崔彻平、反丁烯二酸佛摩特罗(Formeterol)、崔克理(Tracleer)(波桑坦(bosantan))、崔安喜诺隆(Triamcinolone)丙酮化物、布迪索奈(Budesonide)、辛谷赖(Singulair)、塞瑞文(Serevent)、提雷德(Tilade)(吸入剂及喷雾剂)、吉佛(Zyflo)、爱克雷(Accolate)、喜德士(Cedax)、佐泰克(Zyrtec)、贺赛亭(herceptin)。抗癌剂包括例如但非限于紫杉、太平洋紫杉、希普汀(cisplatin)、贺癌汀(Herceptin)、格里法克(Gleevac)、干扰素等。
依据本发明方法，组合中的个别成分可在治疗期间的不同时间分开投予或以平分形式或单一组合形式同时投予。因此，须了解本发明涵盖全部此等同时或替代处理方案，且“投予”一词须据此解译。须了解本发明化合物与其它药剂的组合范围原则上包括与用于治疗病毒、细菌、寄生虫、真菌感染等的任一种医药组成物的任一种组合。当本发明化合物或其医药上可接受的盐是组合第二治疗剂使用时，各化合物的剂量可与单独使用化合物时的剂量相同或相异。
须了解本发明化合物与其它药剂的组合范围原则上包括与任一种用于治疗COPD、气喘、过敏性鼻炎、癌症等的医药组成物的任一项组合。当本发明化合物或其医药上可接受的盐是组合第二治疗剂使用时，各化合物的剂量可与当该化合物单独使用时剂量相同或相异。
须注意数种抗微生物胜肽可于由此处所述化学组成物的化合物进行免疫刺激时诱生。实施例包括但非仅限于称作为红血球外表现血色素(EEHP)的抗微生物胜肽。
本发明的实施例
列举下列实施例以供熟谙技艺人士完整揭示及描述如何制造及/或使用本发明化合物、检定分析、筛检及治疗方法，但非意图限制本发明人所考虑的发明范围。
后文若干实施例举例说明本发明化合物的抗病毒活性。及若干实施例举例说明抗病毒活性与胞内制造抗病毒胜肽间的相关性。
I.化学实施例-合成及制备方法
本发明化合物可通过本章节描述的方法、实施例及化学参考文献的方法合成(诸如Iyer,R.P.等人，Antimicrob.Agents Chemotherm抗微生物剂化学治疗，48(6)：2199-2205，2004；Iyer,R.P.等人，Antimicrob.Agents Chemother,48(6):2318-20，2004；Jin,Y.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.10,1921-25,2000；Jin,Y.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.11,2057-2060，2001；Iyer,R.P.等人，目前方案单元3.13，(Beaucage等人编辑)John Wiley and Sons，2006；Padmanabhan,S.等人，Tet.Lett.46,343-347，2005；及Iyer,R.P.等人，Organic Preparations&Procedural International，37，205-212，2005)。
固相合成策略及溶液相策略二者可用以制备核苷酸类似物库。该等方法可用于库的合成，而糖核酸碱基及核苷酸间键联有修改。
又，发明人进行数种技术创新有助于合成核苷酸库：a)使用固相磷酸醯胺酸酯及H-膦酸酯技术发展用于合成二核苷酸库的策略；b)将最近技术创新用于二核苷酸化合物及类似物的固相合成(参考前述参考文献)。此等晚近技术创新例如包括(i)使用微波辅助方法的胺基-，及羧基-官能化固体撑体的超快速制备；(ii)核苷载荷至固体撑体上的新颖方法。已经发展大规模制备经核苷载荷的撑体的改进方法。此种方法涉及使用二甲基甲醯胺(DMF)作为溶剂。获得80至300微莫耳/克的高核苷载荷量；及(iii)用以载荷固体撑体及固相合成协助二核苷酸的大规模合成的新颖反应器称作为洛特斯(LOTUS)。洛特斯是装配有气动阀来控制反应物的递送的多用途反应器(20-22)。
针对化合物5及6k显示举例说明的合成方案。
实施例1.化合物5的合成
硫代磷酸酯类似物3-dApsU2’-OMe(5)的Rp,Sp混合物是使用固相磷醯亚胺酸酯化学(Beaucage,S.L.；Iyer,R.P.Tetrahedron Lett.1993，49，1925)组合特别制造的洛特斯反应器以大规模合成(1毫莫耳经核苷载荷的控制孔隙玻璃(CPG)撑体)(Padmanabhan,S.；Coughlin,J.E.；Iyer,R.P.Tetrahedron Lett.2005，46，343；Iyer,R.P.；Coughlin,J.E.；Padmanabhan,S.Org.Prep.Proc.Intl.2005,37,205)。dA-链接的CPG撑体是使用发明人晚近发现的用于固体撑体的超快速官能化及载荷方法制备。用于核苷酸间二核苷亚磷酸酯偶合产物的硫化作用，采用3H-1,2-苯并二噻呃-3-酮-1,1-二氧化物(0.4M于无水CH3CN)(Iyer,R.P.；Regan,J.B.；Egan,W.；Beaucage,S.L.J.Am.Chem.Soc.1990,112,1253)。处理、层析纯化、及冻干后，获得Rp,Sp5的钠盐(约60:40混合物)，大于96%纯质，是通过31P及1H NMR加以特征化。
如此，方便进行二核苷酸化合物及类似物的焦点库的固相合成。以互补策略，溶液相合成也可用于化合物5的合成。此等方法允许合成具有各种化学改性的化合物。
实施例2.化合物6k的合成
Figure BDA00003117462100231
目标化合物6k是以二步骤制备如下：
步骤1.碳酸碘甲基异丙酯的制备：于无水碘化钠(6克，40毫莫耳)于无水乙腈(20毫升)的溶液内，以20分钟时间逐滴添加碳酸氯甲基异丙酯(2.9克，19毫莫耳)于无水乙腈(10毫升)。反应混合物覆盖铝箔(避光)于室温搅拌隔夜。分离的固体经过滤出，以乙腈洗涤，滤液于减压下浓缩。残余物溶解于水(10毫升)，有机物以醚(25毫升)萃取。醚萃取物以亚硫酸氢钠(5%，10毫升)洗涤，接着以盐水(10毫升)洗涤。有机层以无水硫酸钠脱水，过滤，浓缩及于高度减压下干燥。产率2.72(58%)；1H-NMRδ1.3(d,6H),4.95(m,1H),5.95(s,2H)。
步骤2.化合物5的烷基化。于化合物5(60毫克，0.098毫莫耳)于水(HPLC，400毫升)的溶液内，于搅拌下加入碳酸碘甲基异丙酯(80毫克，0.0166毫莫耳，3.33当量)于丙酮(1毫升)的溶液。添加额外丙酮(1毫升)来获得澄清溶液，避免烷化剂的球状珠粒分离。反应混合物覆盖铝箔搅拌3小时，于旋转蒸发器的条件下浓缩，及后来于高度减压下浓缩，获得反应混合物呈白色固体。此固体通过二氧化硅管柱层析术纯化，其最初使用氯仿，缓慢使用含2%甲醇及最终含8%甲醇的氯仿。组合含主要成分的分量，浓缩及于高度减压下干燥隔夜。以几乎定量产率分离期望的纯产物化合物6k(68毫克)；31P-NMR(MeOH-d4)δ27.7,28.6。
II.生物实施例及化合物的设计
实施例1.化合物6k于HBV基因转殖小鼠模式的抗HBV活性
Figure BDA00003117462100241
化合物6k是于HBV感染的基因转殖小鼠模式中评估抗HBV活性。雄基因转殖小鼠感染HBV，使用78日至108日龄。化合物6k初步是以300毫克/千克的单剂每日经口灌食投药连续14日评估。化合物是于柠檬酸中投药，使用阿德佛维(adefovir)迪皮佛席(dipivoxil)作为阳性对照。接受载媒剂的对照组是用作为阴性对照。处理后，牺牲小鼠使用南方墨点分析分析肝组织的HBV DNA。资料使用Kruskall-Wallis非参数ANOVA做统计学评估。试验结果提供于下表1。
表1
Figure BDA00003117462100242
如表1所示，化合物6k产生肝HBV DNA较未处理对照高达2log减低，于统计上有意义(p值为0.01至0.001)。
实施例2.于HBV基因转殖小鼠模式口服投予化合物6a及6k对B型肝炎病毒的效应。
(a)雄及雌基因转殖小鼠(创始1.3.32)感染人类B型肝炎病毒。感染后，动物口服投予化合物6k，或安慰剂0.05M柠檬酸，pH2.0每日一次连续14日。化合物6k的剂量为300毫克/千克/日。阳性对照ADV是以10毫克/千克/日投予。资料摘述于表1(提供如上)。
统计意义比较安慰剂载媒剂是以*P≤0.05、**P≤0.01、***P≤0.001指示。研究也确定于所采用的高剂量化合物6k不具显著毒性。
实施例3.于基因转殖小鼠口服投予化合物6k对B型肝炎的病毒的效应。
雄及雌基因转殖小鼠(创始1.3.32)感染人类B型肝炎病毒。感染后，动物口服投予化合物6k，或安慰剂0.05M柠檬酸，pH2.0每日一次连续14日。化合物6k的剂量为100、10、5及1毫克/千克/日。阳性对照ADV是以10毫克/千克/日投予。于处理组及对照组肝脏HBV DNA的资料摘述于表2。
统计意义比较安慰剂载媒剂是以*P≤0.05、**P≤0.01、***P≤0.001指示。血清HBeAg、PEI的测量值是依据国际免疫诊断标准检定分析使用波爱里区(PaulEhrlich)国际单位(PEI U)报告。结果也确定于所采用的高剂量并无显著毒性(表2)。
表2.于基因转殖小鼠化合物6k对B型肝炎病毒的一系列剂量效应。(b)于基因转殖小鼠口服投予化合物6k对B型肝炎病毒的效应。
Figure BDA00003117462100251
Figure BDA00003117462100252
实施例4.于B型肝炎感染基因转殖小鼠使用化合物6k处理红血球外衍生血色素(EEEH)作为抗病毒胜肽的表现增高。抗-HBV活性是与抗病毒胜肽EEEH蛋白质的制造相关。
收集基因转殖小鼠投予化合物6k后的血浆样本及肝样本，进行SDS PAGE来评估红血球外表现血色素(EEEH)的存在，EEEH为抗微生物胜肽，诱生作为先天免疫反应活化的一部分。此种蛋白质的分子量约为15千道尔顿。EEEH的表现显示于图式，其为表3中显示样本的SDS PAGE曲线图。如图可知，化合物6k诱发EEEH蛋白质的剂量相依性表现。图2显示口服投予化合物6k的抗HBV活性是以剂量相依性方式而与EEEH的表现相关。
表3.载荷于SDS PAGE的样本的描述，图1
线道# 样本 体积
1
2 对照小鼠血浆No DTT，1:50 10微升＝0.2微升
3
4 1毫克6k小鼠血浆No DTT，1:50 10微升＝0.2微升
5
6 10毫克6k小鼠血浆No DTT，1:50 10微升＝0.2微升
7
8 100毫克6k小鼠血浆No DTT，1:50 10微升＝0.2微升
9
10 加总小鼠血浆No DTT，1:50 10微升＝0.2微升
11
12 预染色标准STD 5微升
实施例5.通过舌下途径投予化合物5后于土拨鼠的EEEH的表现动力学。
化合物5是以20克/千克于川斯库妥(Transcutol)剂量通过舌下途径投予土拨鼠，定期抽血接受分析。试验结果提供于表4及表5及图3及图4。
Figure BDA00003117462100261
表4
表4及图3及图4所示结果指示化合物5当经舌下途径投予时可诱导EEEH的表现。
Figure BDA00003117462100262
表5
由前文可知，通过舌下途径吸收化合物5后极为快速诱生EEEH蛋白质。
实施例6.EEEH表现与双股RNA上RIG-I转位有相关性
相信作为抗病毒胜肽的EEEH是响应于干扰素媒介基因表现而表现，且是由于先天性免疫刺激的结果。
据报告RIG-I是以有限速度沿dsRNA转位(移动)，但于5’-三磷酸存在的下其移动显著加速(>20倍)，符合RIG-I的病毒特异性活化(Myong,S.等人，Science，323，1070，2009)。定名为PIFE(蛋白质诱导萤光增强)的试管试验单分子萤光检测分析采用来监视此项移动(Myong,S.等人，科学，323，1070，2009)。于化合物5存在下，RIG-I是以剂量相依性方式显示于dsRNA上的快速转位，指示化合物可诱导RIG-I的活化。
为了量化RIG-I转位，估计单分子PIFE产率。单分子PIFE产率是同时得自数百个分子，允许做统计上可靠的资料收集。此外，无活性及活性(刺激)转位信号间的资料输出是显著分歧，指示可准确的鉴别。
前述转位是使用不同浓度的核苷酸化合物进行。观察得化合物5于RIG-I转位上有清楚的剂量相依性；化合物5浓度从5μM增高至170μM，结果导致快速转位比例的相对应增高。
须注意化合物5及化合物6k各自为两种异构物的混合物。于转位检定分析中，化合物5的一种异构物标示为Rp5异构物[异构物1]，是比Sp5异构物[异构物II]具更高活性。但Rp6k异构物1的活性是与Sp6k异构物II相等。化合物5及化合物6k皆为RIG-I转位的强力活化剂。此项结果证实转位检定分析用于评估化合物5刺激RIG-I活性的功效，因此适用于其它类似物。
Figure BDA00003117462100281
实施例7.RIG-I转位的结构-活性关是
多种结构上不同的核苷酸类似物是在RIG-I检定分析(14)中评估。核苷酸类似物SB50、SB60、SB70、SB80、SB90、SB100及SB110在双股RNA上显示RIG-I不等程度的转位。
中度RIG-I活化剂
弱RIG-I活化剂
Figure BDA00003117462100283
实施例8.活性相对于无活性RIG-I转位的量化
标准dsRNA(25bp)用作为RIG-I转位检定分析的主要酶基质。具有3’-Cy3萤光基团及5’-生物素的所需dsRNA酶基质是由达马康公司(Dharmacon Inc.)制造。各个实验集合涉及多回合资料取得，由其中收集具有明确转位表现的数百个分子。快速(刺激转位)与缓慢转位间的比经计数来估计化合物强度。为了量化化合物对RIG-I或化合物对RNA酶基质的亲和力，检定分析中使用各种浓度的化合物(1至100μM范围)。如此允许计算各种化合物的结合/解离常数，此乃应用于以细胞为基础的化合物强度评估上的有用度量。
相同转位检定分析是用在dsRNA，含有5’-三磷酸部分使用及未使用化合物。试验化合物是基于分子转位数目及转位速率评级。化合物5的Rp异构物(异构物1)为全部试验的类似物中具有最高活性者。
实施例9.借助短寡核苷酸通过NOD2的活化诱生胞内IRF3。
于一次检定分析中，二核苷酸及三核苷酸化合物测试其于已知可表现NOD2的HLE A549细胞中诱生IRF3的表现。化合物5、SB43及6k显示较对照组未经处理细胞具有15至20倍的感染。相关类似物诸如二核苷酸SB50、SB110、及SB60诱导IRF3活化至较低程度。
于使用本发明化合物处理的于未经处理(UT)细胞及使用本发明化合物处理的HLE A549细胞干扰素调节因子-3(IRF3)-虫萤光素酶通报子基因的活化。
HLE细胞正常以内生性表现NOD2。为了决定短寡核苷酸化合物是否活化NOD2，采用以IRF3质体转移感染的HLE细胞。IRF3-虫萤光素酶转移感染细胞是与只有DMSO(UT)或试验化合物(1μM)一起培养。培养12小时后，依据制造商方案使用双-虫萤光素酶通报子检定分析系统(波美加(Promega))测量虫萤光素酶活性。转移感染效率是通过测量海肾虫萤光素酶的表现加以标准化。虫萤光素酶单位(亦即诱导倍数)是通过标准方法测量。检定分析结果从三个独立实验呈示为平均值±标准差(S.D.)。概略言的，二核苷酸化合物3’-dAps-2’-OMeU(5，也参考通用结构式I)及S-烷基化衍生物SB43及6k造成IRF3的15倍至25倍诱导。
于另其它组的实验中，通常不表现NOD2的HEK细胞以NOD2及IRG3转移感染，然后使用短寡核苷酸化合物处理。当使用化合物5及6k处理时，NOD2缺陷细胞无法诱生IRF3，而使用NOD2转移感染的细胞诱生IRF3。若干其它化合物于NOD-2转移感染细胞显示不同程度的IRF3活化。
实施例10：短寡核苷酸化合物对抗人呼吸融合病毒(RSV)感染的抗病毒活性。
(A)于未经处理(UT)及经SMNH处理细胞的RSV感染力。人肺上皮细胞于无(只有DMSO)或有各种SMNH化合物(1μM)存在下感染RSV(0.5MOI)。感染24小时后，收集介质上清液，上清液中的病毒力价是使用CV-1细胞单层通过溶菌斑检定分析进行检定分析。100%RSV感染表示得自与只有DMSO培养细胞(UT细胞)的病毒力价。数值表示三次独立测定的平均值±标准差。S.D.是以误差柱显示。
(B)典型溶菌斑检定分析显示于未经处理(UT)细胞及经SMNH感染细胞的RSV。得自RSV感染细胞(+/-SMNH)的细胞上清液是以1X105的稀释倍数添加至CV-1。观察溶菌斑，并在其使用结晶紫染色的后于甲基纤维素上定量。
Figure BDA00003117462100301
*二核苷酸；6k的Rp-异构物；$三核苷酸；#于经SMNH处理相对于未经处理细胞；n.d.，未测定
表6
于各种化合物中NOD2活化剂5及6k提引出最大抗病毒活性，造成使用其它显示不等程度抗病毒活性化合物于1μM浓度的RSV感染力的60%至80%抑制作用(参考表6)。
实施例11.分子模型研究：
使用分子模型，化合物5及6k显示为腺苷三磷酸(ATP)仿真物。化合物良好重叠于ATP结构式上。如此，化合物5及6k可于RIG-1及NOD2结合至核苷结合功能域，然后造成此等蛋白质的活化，结果导致IFN路径的诱导。
实施例12：于试管试验中对肝炎病毒的抗病毒研究。
选择性化合物是于试管试验中基于细胞HepG2.2.15HBV检定分析进行评估。化合物5及6k为强力抗HBV化合物，发现于试管试验可抑制野生型及抗药性种系的胞内HBV复制，具有EC50于0.3至2微莫耳浓度的范围。
抗病毒分析。针对抗病毒分析，2.2.15细胞的融合培养于含2%胎牛血清的RPMI1640培养基内维持于96孔平底组织培养孔板上。培养(两个复制孔板上针对每种试验浓度有6个培养)测试连续9日试验化合物的每日剂量。培养基每日更换新鲜试验化合物。末次处理后24小时测量HBV核酸及蛋白质含量。胞外(病毒粒子)HBV DNA含量是通过定量墨点杂交评估。胞内HBV DNA浓度是通过定量南方墨点杂交测量。
使用中性红染料的吸收来测定末次处理后24小时的相对毒性程度。使用内化染料于510nM的吸光比(A510)作为半量化分析。数值是以维持在96孔板上9个未经处理细胞的分开培养的平均A510值(±标准差)的百分比呈现，该等培养是使用用于抗病毒分析的相同备用细胞汇集物同时接种且以相同方式维持。各浓度的试验化合物共处理三个培养。抗病毒检定分析是使用野生型及抗药性基因型进行，结果摘述于表7。
Figure BDA00003117462100311
表7
实施例13.活体试验抗病毒研究
(a)于基因转殖小鼠腹内投予化合物5对B型肝炎的功效。
化合物5是于表现B型肝炎病毒(HBV)的转殖基因小鼠评估。化合物5于食盐水或聚氧乙烯(cremaphor):乙醇：食盐水载媒剂，以100毫克/千克/日剂量腹内投予每日一次连续14日，显著减少肝HBV DNA (P≤0.001)。其活性也类似阿德佛维(adefovir)迪皮佛席(dipivoxil)(ADV)抗-HBV活性；但两种化合物似乎抑制不同的HBV DNA种属。ADV于南方墨点分析无法去除极低尺寸的病毒带，且优先去除较高尺寸的病毒带。相反地，化合物5显然未加鉴别地去除全部HBV DNA种类，包括典型由ADV所留下的带，可反映出与传统链终结不同的作用机转。血清HBe、肝HBs、及HBc不受化合物5处理影响，与使用可阻断mRNA合成“下游”的病毒感染，诸如阻断聚合酶活性的化合物的转殖基因小鼠符合一致。最低有效剂量经决定为1.6至0.5毫克/千克/日，类似1.0毫克/千克/日的ADV最低有效剂量(表8)。表8显示每日一次连续14日接受腹内处理的雄转殖基因小鼠化合物5对HBVDNA的效应。
Figure BDA00003117462100312
表8
a样本数。样本数与活存/总数间的差异是由于某些样本制剂已经不完整或不合所需而无法适当完成分析。
b阿德佛维迪皮佛席
c聚氧乙烯：乙醇：食盐水(10:10:30)
***P≤0.001与载媒剂安慰剂比较
**P≤0.05与载媒剂安慰剂比较
*P≤0.01与载媒剂安慰剂比较
实施例14.化合物6k对C型肝炎病毒的抗病毒活性
a.一次抗HCV检定分析
对HCV的抗病毒活性是于3日检定分析评估(Okuse等人，2005；Antiviral Res.65:23；Korba等人，2008，Antiviral Res.77:56)，该检定分析是使用稳定表现中的HCV复制子细胞系AVA5(亚基因体(CON1)，表现型1b)(Blight等人，2000，Science290:1972)于96孔板上维持为亚融合培养。抗病毒活性是通过胞内HCV RNA的墨点杂交分析决定(标准化至各个培养样本中的细胞B-肌动蛋白RNA浓度)。胞毒性是通过维持于平行板的培养中中性红染料的吸收进行评比。
EC50、EC90、及CC50值是使用得自全部处理培养基的组合资料通过线性回归分析计算(MS EXCEL，QuattroPro)(Korba&Gerin，1992，抗病毒研究19:55；Okuse等人，2005，Antivir.Res.65:23)。EC50值及EC90值的标准差是从回归分析所产生的标准误差计算。EC50及EC90为分别观察得胞内HCV RNA(相对于未经处理培养的平均浓度)抑制2倍或10倍的药物浓度。化合物6k具有2微莫耳浓度的EC50及约8微莫耳浓度的EC90。CC50亦即观察得中性红染料吸收(相对于未经处理培养的平均浓度)低2倍的药物浓度是大于100微莫耳浓度。使用重组人干扰素2b(PBL实验室公司(PBL laboratories,Inc.))用作为检定分析对照。化合物6k具有1至2微莫耳浓度的EC50；Sp6k具有0.3μM的EC50；化合物5具有约3μM的EC50。Rp5具有0.16μM的EC50。
b.二次抗HCV检定分析
本检定分析评估使用针对一次检定分析格式对抗额外基因型的活性。含括对基因型1b HCV的活性做比较。使用含H/FL-Neo的复制子细胞系(基因型1a(H77)，全长建构体)(Blight等人，2003，J.Virol.77:3181)。化合物6k具有1微莫耳浓度的EC50及约6微莫耳浓度的EC90。
实施例15.组合其它抗病毒剂时化合物6k组合其它抗病毒剂时对HCV的协同活性。
为了证实组合其它抗病毒剂可获得协同效果，进行与已知抗HCV聚合酶及蛋白酶抑制剂，以及利巴威灵及干扰素的组合研究。
组合处理是如前述进行。简言的，两种药剂以预定浓度比混合。个别药剂的相对比例是基于各种化合物的单一治疗值(观察得HCV RNA减低10倍的药物浓度[EC90s])。针对各种药剂组合，使用三种浓度比，取中于使用具有等长度抗病毒浓度化合物。然后于各稀释步骤中两种药剂维持相同浓度比产生一系列稀释(六个三倍浓度阶，始于约略EC90s)。各种抗病毒剂于相等浓度的单一治疗的分开稀释系列也用在相同实验中处理培养。如前述对单一治疗进行毒性分析。组合研究中药物交互作用分析是通过CALCUSYN程序(生物软件公司(Biosoft，Inc.)，英国剑桥)测定。本程序通过使用数种方法评估协同性、加成性、或拮抗性，该等方法包括Chou及Talalay方法，统计分析采用蒙特卡罗技术来提供可靠度极限、分量-影响-可靠度区间(FA-CI)作图、等效线图、及中数-效应作图[Belenkii,M.S.Schinazi,R.使用统计分析分析组合治疗的方法，抗病毒研究25，11，2005]。
化合物6k对HCV基因型1b(约1至2微莫耳浓度EC50)具有活性，于复制子检定分析中当组合其它类别的抗HCV药物时显示协同活性。结果摘述于下表。
于试管试验中6k证实与数种药物组合具有协同性1
Figure BDA00003117462100331
表9
若干其它化合物于复制子检定分析中也显示不等程度的抗病毒活性。
除了干扰素刺激活性之外，值得一提者为核苷酸化合物也可直接作用在其它病毒标靶上作为病毒复制的抑制剂，由此提供抗病毒作用的多重机转。因此，此等化合物预期可以其它抗病毒剂具有协同性，可组合具有清除病毒潜力的疗法使用。此等化合物也预期对多种病毒基因型及抗药性种系具有广效性抗病毒活性。由于此等化合物具有免疫刺激潜力，故也可作为预防用途及/或用作为疫苗的辅剂。
实施例16：化合物对流感病毒的抗病毒活性
为了评估于试管试验及活体试验中，化合物是否抑制流感病毒的复制，使用小鼠适配的1N1流感A/WSN/33及A/PR8/34病毒。用于试管试验研究，细胞使用各种(0.5-10μM)浓度的化合物处理，通过决定于感染后各个时间点的HA及pfu力价而在单周期及多周期复制研究中确定此等细胞用于抑制流感病毒复制的能力。细胞毒性是通过细胞力价96细胞增殖检定分析(波美加)监视，结果用来计算IC50值(导致50%病毒复制抑制的抑制浓度)。为了用作为抑制作用的阳性对照以及用于比较目的，使用FDA核准的神经醯亚胺酶抑制剂(欧斯特米维(oseltamivir))。
为了研究化合物于活体试验的抗病毒活性，使用流感病毒感染的小鼠模式。Balb/c小鼠鼻内感染流感PR8病毒，结果导致严重肺炎，具有103pfu的LD50及感染后约7至8日的死亡时间，此时感染小鼠将已减轻超过25%体重，肺脏组织病理学显示肺脏结构破坏、高度嗜中性细胞、单核细胞及淋巴细胞浸润，损失支气管的上皮细胞内衬。于小鼠进行先驱研究来估计先驱化合物的MED(最低有效剂量)及MTD(最低耐受剂量)。例如，当经口投予B型肝炎基因转殖小鼠模式时，化合物6k的EC50约为10毫克/千克。为了评估化合物的MTD，每组5头小鼠每日投予不等浓度的先驱化合物，采用鼻内投药连续5日，称量体重连续1周评估耐受性，随后将牺牲小鼠，准备其肺脏的组织病理切片来检验是否有任何损伤征象。一旦决定MED及MTD，每组19头小鼠鼻内感染10LD50s的PR8病毒及每日使用化合物鼻内治疗。于第2日、第4日及第6日牺牲三头小鼠，测定病毒力价且于其肺脏进行组织病理切片(各头小鼠的一个肺用于病毒力价而另一个肺用于组织病理)。其余10头小鼠用来监视存活率。任何体重的损失皆监视作为疾病的指针，若体重的损失已经超过20%，则依据既有的IACUC推荐将小鼠安乐死且记录为死亡。未治疗小鼠及使用欧斯特米维处理小鼠用作为对照。为了证实化合物用在RIG-I传讯活性作用的特异性，含括RIG-I-/-小鼠于活体试验感染研究。野生型小鼠但非RIG-I-/-小鼠使用化合物处理显示存活率提高及病毒力价减低，肺脏的免疫病理学及血清转变减低。设计来评估保护免于感染的保护实验中，小鼠于暴露于流感PR8病毒1日、2日、及3日时使用化合物处理。
实施例17.化合物使用一组细胞系预测肝、肾、骨髓及粒线体毒性的试管试验胞毒性研究。
化合物5及6k于多个细胞系具有优异的安全性轮廓，具有CC50>1000微莫耳浓度。使用波美加细胞力价96非放射活性细胞增殖检定分析套组结合96孔板读取器(舍摩美(ThermoMax)，分子装置(Molecular device))，及MDBK、Vero、及HFF细胞系(得自ATCC)与96孔板进行标准MTT检定分析。采用若干对照包括核苷类似物3TC、AZT、及ddC，及不含药物的培养基。SDS用作为阳性胞毒性对照。化合物重复三次以100、300及1000μM测试。使用试验物质经24小时细胞培养后进行MTT检定分析。全部试验化合物显示CC50>1000微莫耳浓度，指示化合物具有高度安全性。
实施例18：于使用BCG及化合物处理的PBMC诱生干扰素。
用于本检定分析，PBMC是以每毫升1百万个细胞接种于24孔板。各组孔板使用BCG、BCG+化合物处理，及培养24小时。细胞经溶解，收获上清液。细胞激素及I型干扰素的制造是使用ELISA检定分析利用标准套组评估。由相同实验BCG确实诱生其它细胞激素(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10及TNF)。使用BCG及化合物处理的细胞比较单独使用BCG处理的细胞诱生干扰素的制造增加。结果显示于图6。
实施例19：化合物5及6k对通过巨噬细胞制造介白素-2的效应。
为了评估化合物诱生介白素-2的制造，巨噬细胞使用化合物及BCG处理。使用的对照细胞为未经处理的细胞，及使用BCG处理的细胞。培养18小时后，巨噬细胞上方铺上T细胞，及定量IL-2浓度。也接受BCG的该等细胞比较单独使用BCG的该等细胞，化合物5及6k显示诱生IL-2(参考图7)。
摘要言的，本发明化合物用作为胞内微生物传感器活化剂，造成免疫反应的活化。化合物也显示对DNA病毒(HBV)及RNA病毒诸如HCV及RSV的抗病毒活性。本案请求专利的化合物不仅可用来诱发免疫反应作为促效剂，同时也可阻断(拮抗)自体免疫病中非期望的免疫反应。因此，此等化合物也可用于多种治疗计画其包括，但非仅限于，癌症及自体免疫病。

Claims (25)

1.一种短寡核苷酸化合物或其类似物，包含至少一个化学改性，其中该短寡核苷酸化合物或其类似物是具有抗微生物活性。
2.如权利要求1所述的短寡核苷酸化合物或其类似物，其是具有对抗RNA病毒及/或DNA病毒的抑制活性。
3.如权利要求2所述的短寡核苷酸化合物或其类似物，其中该RNA病毒及/或DNA病毒是选自C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)、人类乳突瘤病毒(HPV)、仙台(Sendai)病毒、牛痘病毒、流行性感冒病毒及其它黄病毒属(flaviviruses)。
4.如权利要求1所述的短寡核苷酸化合物或其类似物，其是具有免疫刺激活性。
5.如权利要求4所述的短寡核苷酸化合物或其类似物，其中该化合物或其类似物是为抗癌剂。
6.一种式(I)的化合物：
Figure FDA00003117462000011
式(I)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m=1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根；但限制条件为该式(I)化合物是非为化合物5。
7.如权利要求6所述的化合物，其中该化合物是具有抗微生物活性，且能于试管内或于活体内诱导细胞制造抗微生物胜肽。
8.一种式(II)的化合物：
Figure FDA00003117462000021
式(II)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
X=不存在、O、NH、NR、或S；
X1=不存在、O、或NH；
A=不存在、芳基、或芳烷基；
n=0、1、2、3、4、或5；
R=烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-烷基、-O-杂芳基、或类固醇基；
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m为1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根，
但限制条件为于该式(II)化合物中，当m为2时，R4是非为H。
9.如权利要求8所述的化合物，其中该化合物是能诱导细胞制造抗微生物胜肽。
10.一种于患有抗微生物感染的一个体测量抗微生物反应的方法，该方法是包含使用细胞性红血球外衍生血色素(EEEH)蛋白质作为生物标记。
11.一种于一个体调控双股或单股RNA的免疫媒介功效的方法，该方法是包含对该个体投予有效量的化学改性siRNA。
12.如权利要求11所述的方法，其中该方法调控双股或单股RNA的免疫媒介功效，且该化学改性siRNA具有以下式(I)化合物：
Figure FDA00003117462000031
式(I)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物的核苷酸节段，
其中
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m=1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根。
13.如权利要求12所述的方法，其中该化合物是为
Figure FDA00003117462000041
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物。
14.如权利要求11所述的方法，其中该方法是调控单股RNA的免疫媒介效应，该化学改性siRNA是具有式(I)化合物：
Figure FDA00003117462000042
式(I)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物的二核苷酸突出部，
其中
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m=1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根。
15.如权利要求11所述的方法，其中该方法是调控单股RNA的免疫媒介效应，该化学改性siRNA是具有式(II)化合物：
Figure FDA00003117462000051
式(II)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物的二核苷酸节段，
其中
X=不存在、O、NH、NR、或S；
X1=不存在、O、或NH；
A=不存在、芳基、或芳烷基；
n=0、1、2、3、4、或5；
R=烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-烷基、-O-杂芳基、或类固醇基；
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m为1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根。
16.如权利要求11所述的方法，其中该化合物是为
Figure FDA00003117462000052
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物。
17.如权利要求11所述的方法，其中该方法是调控双股RNA的免疫媒介效应，该化学改性siRNA是具有式(II)化合物：
Figure FDA00003117462000061
式(II)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物的二核苷酸突出部，
其中
X=不存在、O、NH、NR、或S；
X1=不存在、O、或NH；
A=不存在、芳基、或芳烷基；
n=0、1、2、3、4、或5；
R=烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-烷基、-O-杂芳基、或类固醇基；
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m为1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根。
18.如权利要求11所述的方法，其中该化学改性siRNA是包含dA-ps-U2’OMe的二核苷酸节段。
19.如权利要求11所述的方法，其中该方法是调控双股RNA，该化学改性RNA是具有式(II)化合物：
Figure FDA00003117462000071
式(II)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物的核苷酸节段，
其中
X=不存在、O、NH、NR、或S；
X1=不存在、O、或NH；
A=不存在、芳基、或芳烷基；
n=0、1、2、3、4、或5；
R=烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-烷基、-O-杂芳基、或类固醇基；
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m为1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根。
20.一种最小化合成寡核苷酸的非目标效应的方法，该方法是包含a)识别于寡核苷酸上的化学改性，其中该化学改性将使得改性寡核苷酸具有非期望的免疫媒介效应；及
b)当设计治疗用途的该合成寡核苷酸时，排除该化学改性。
21.一种设计治疗用途的改性寡核苷酸的方法，该方法是包含：
a)提供化合物的核苷酸节段，其中该化合物是为
Figure FDA00003117462000081
或
Figure FDA00003117462000082
或其类似物；
b)评估该核苷酸节段的非目标效应；及
c)从该改性寡核苷酸排除该核苷酸节段。
22.如权利要求21所述的方法，其中该改性寡核苷酸是为siRNA或反讯息、或其类似物。
23.一种增强的化学改性寡核苷酸于一个体中的抗癌功效的方法，该方法是包含对该个体投予有效量的式(I)化合物：
式(I)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m=1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根；
或有效量的式(II)化合物：
式(II)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
X=不存在、O、NH、NR、或S；
X1=不存在、O、或NH；
A=不存在、芳基、或芳烷基；
n=0、1、2、3、4、或5；
R=烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-烷基、-O-杂芳基、或类固醇基；
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m为1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根；
其中该式(I)化合物或式(II)化合物是能刺激细胞雕亡路径。
24.一种于一个体治疗病毒性感染或癌症的方法，该方法是包含对该个体投予有效量的式(I)化合物：
Figure FDA00003117462000101
式(I)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m=1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根；
或有效量的式(II)化合物：
Figure FDA00003117462000102
式(II)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
X=不存在、O、NH、NR、或S；
X1=不存在、O、或NH；
A=不存在、芳基、或芳烷基；
n=0、1、2、3、4、或5；
R=烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-烷基、-O-杂芳基、或类固醇基；
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m为1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根。
25.一种抑制微生物活性的医药组成物，该医药组成物是包含有效量的式(I)化合物：
式(I)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
R3是选自氢、烷基、经取代的烷基、-C(O)-烷基、-C(O)O-烷基、-C(O)-芳基、-C(O)O-芳基、-C(O)NH-烷基、-C(O)NH-芳基；
Y及Z各自独立地为O或S；
B1及B2于各次出现时独立地为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基、或改性核苷部分；
m=1、2、3、4、5、或6；
R4于各次出现时独立地为一磷酸根、二磷酸根、或三磷酸根；
或有效量的式(II)化合物：
Figure FDA00003117462000121
式(II)
或其医药上可接受的盐、消旋物、对映异构物、非对映异构物、几何异构物、或互变异构物，
其中
X=不存在、O、NH、NR、或S；
X1=不存在、O、或NH；
A=不存在、芳基、或芳烷基；
n=0、1、2、3、4、或5；
R=烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-烷基、-O-杂芳基、或类固醇基；
R1及R2各自独立地为H、OH、-O-烷基、烷基、经取代的烷基、环烷基、芳基、经取代的芳基、芳烷基、杂环基、-O-芳基、或-O-杂芳基芳基；
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