CN109364074B

CN109364074B - 6-氨基烟酰胺作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途

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Publication number: CN109364074B
Application number: CN201811296964.XA
Authority: CN
Inventors: 陈娟; 黄爱龙; 任吉华; 任放; 胡钟文
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2038-11-01
Also published as: CN109364074A

Abstract

本发明属于生物医药研究领域，具体涉及6‑氨基烟酰胺在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，6‑AN能够抑制HBsAg的分泌，抑制HBV复制中间体，前基因组RNA(Pre genomic RNA,pgRNA)、HBV total RNA的表达。这些结果表明6‑AN是潜在的新型降低HBsAg的药物，其应用对于抗HBV药物的发展，提高乙肝功能性治愈率有重要的意义。

Description

6-氨基烟酰胺作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药研究领域，具体涉及6-氨基烟酰胺作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。

背景技术

慢性乙型肝炎是严重的公共卫生问题，全球估计有20亿人曾经感染过乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus,HBV)。目前，全球约2.92亿乙肝病毒感染者，其中五岁以下儿童感染者高达180万，有将近9400万患者需要接受抗病毒治疗，而仅有5％(480万)患者得到了治疗。病毒携带者可发展为慢性乙型肝炎患者，发生肝硬化、乙型肝炎的风险更高。因此，治疗慢性HBV感染，阻止乙肝相关性疾病的进展是事关全球公共健康的重要任务。

目前，临床上将HBV治愈分为以下的三个阶段：部分治愈、功能性治愈、完全治愈。部分治愈是指有限疗程后HBV DNA持续检测不到，但血清中HBsAg可检出；功能性治愈的指标包括有限疗程后HBsAg消失，伴/不伴HBsAb的出现，血清中HBV DNA检测不到、肝组织炎症和肝纤维化减轻，随着时间推移可降低HCC发生风险；完全治愈是指血清中 HBsAg检测不到且HBV DNA清除。相比于HBV DNA病毒载量的下降、肝功等指标的恢复，HBsAg的清除与药物疗效和疾病预后的联系更加明确，因此，有限疗程后HBsAg的消失以及血清中检测不到HBsAg是功能性治愈和完全治愈的指针。

目前，慢性乙肝病人的治疗方式包括有限疗程的长效干扰素和不限疗程的口服抗病毒药物治疗。长效干扰素可以刺激病毒的天然免疫应答，口服抗病毒药物可以抑制病毒复制至检测限以下。然而，这两种治疗方式均不能实现表面抗原的清除。有临床试验显示，长效干扰素治疗48周后，仅有4％的病人可以实现六个月的表面抗原阴转。HBeAg阳性的患者接受替诺福韦治疗48周以后，HBsAg的清除率仅3％。因此，开发新型靶向表面抗原的药物，实现有限疗程后HBsAg的消失，从而达到功能性治愈，是目前治疗乙型肝炎病毒感染的关键目标所在。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供6-氨基烟酰胺作为有效成分在制备乙型肝炎治疗药物中的用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了6-氨基烟酰胺作为有效成分用于制备乙型肝炎治疗药物的用途。

进一步地，所述乙型肝炎治疗药物至少具有以下功用之一：

抑制HBsAg分泌水平、抑制HBV复制中间体水平、抑制3.5-kb RNA水平、抑制totalHBV RNAs水平。

所述乙型肝炎治疗药物必然包括6-氨基烟酰胺，并以6-氨基烟酰胺作为前述功用的有效成分。

所述乙型肝炎治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为6-氨基烟酰胺，亦可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，6-氨基烟酰胺为所述乙型肝炎治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述乙型肝炎治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述乙型肝炎治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述乙型肝炎治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第二方面，提供了一种治疗乙型肝炎的方法，为向对象施用6-氨基烟酰胺。

所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的乙型肝炎细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述乙型肝炎细胞可以为离体乙型肝炎细胞。

所述对象可以是罹患乙型肝炎的患者或者期待治疗的乙型肝炎的个体。或者所述对象为乙型肝炎患者或者期待治疗乙型肝炎的个体的乙型肝炎细胞。

所述6-氨基烟酰胺可以在接受乙型肝炎治疗前、中、后向对象施用。

本发明的第三方面，提供一种乙型肝炎治疗药物，包括有效剂量的6-氨基烟酰胺。

进一步地，所述乙型肝炎治疗药物，包括有效剂量的6-氨基烟酰胺及药用载体。

本发明的第四方面，提供一种乙型肝炎联合治疗药物组合，包括有效量的6-氨基烟酰胺和至少一种其他乙型肝炎治疗药物。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将6-氨基烟酰胺和其他乙型肝炎治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他乙型肝炎治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他乙型肝炎治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

二)将6-氨基烟酰胺和其他乙型肝炎治疗药物配置成复方制剂，在将6-氨基烟酰胺和其他乙型肝炎治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明的第五方面，提供一种治疗乙型肝炎的方法，为向对象施用有效量的6-氨基烟酰胺以及向对象施用有效量的其他乙型肝炎治疗药物和/或向对象实施其他乙型肝炎治疗手段。

可以同步地或顺序地给予有效量的6-氨基烟酰胺和至少一种有效量的其他乙型肝炎治疗药物。

基于6-氨基烟酰胺为本发明首次发现的乙型肝炎治疗药物，在与6-氨基烟酰胺以外的其他乙型肝炎治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于乙型肝炎的治疗作用。

其他的乙型肝炎治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。

所述6-氨基烟酰胺可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他乙型肝炎治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物，一般采用胃肠外给药。

本发明的第六方面，提供6-氨基烟酰胺在制备具有以下任一项或多项作用的物质中的用途：

用于制备抑制HBsAg分泌水平的物质的用途、用于制备抑制HBV复制中间体水平的物质的用途、用于抑制3.5-kb RNA水平的物质的用途、用于抑制total HBV RNAs水平的物质的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，6-AN能够抑制HBsAg的分泌，抑制HBV复制中间体，前基因组RNA(Pre genomic RNA,pgRNA)、HBV total RNA的表达。这些结果表明6-AN是潜在的新型降低HBsAg的药物，其应用对于抗HBV药物的发展，提高乙肝功能性治愈率有重要的意义。

附图说明

图1：MTT实验分析6-AN对HeAD38细胞的毒性作用。

图2：ELISA法检测不同浓度6-AN对HBsAg分泌水平的影响。

图3：ELISA法检测6-AN对HBsAg分泌水平的影响。

图4：荧光定量PCR法检测6-AN对上清中HBV DNA拷贝数的影响。

图5：荧光定量PCR法检测6-AN对细胞中HBV DNA拷贝数的影响。

图6：荧光定量PCR法检测6-AN对HepAD38细胞中total HBV RNAs水平的影响。

图7：荧光定量PCR法检测6-AN对HepAD38细胞中HBV 3.5-kb RNA的影响。

图8：ELISA法检测6-AN对小鼠血清ALT水平的影响。

图9：ELISA法检测6-AN对小鼠血清AST水平的影响。

图10：ELISA法检测6-AN对小鼠血清HBsAg水平的影响。

图11：荧光定量PCR检测6-AN对小鼠血清HBV DNA拷贝数的影响。

图12：6-AN对小鼠组织HBV DNA拷贝数的影响。

图13：6-AN对小鼠组织total HBV RNAs水平的影响。

图14：6-AN对小鼠组织HBV 3.5-kb RNA水平的影响。

具体实施方式

6-氨基烟酰胺，英文全称为6-Aminonicotinamide，常简称6-AN。本发明研究发现在 HBV稳定表达细胞模型HepAD38细胞模型中6-AN能够抑制HBsAg的分泌，抑制HBV复制中间体，前基因组RNA(Pre genomic RNA,pgRNA)、HBV total RNA的表达。此外，在HBV转基因小鼠体内6-AN也能有效地抑制血清中HBsAg的表达，抑制HBV DNA的复制，并且降低小鼠肝组织中HBV DNA和RNA的表达水平。这些结果表明6-AN是潜在的新型降低HBsAg的药物，其应用对于抗HBV药物的发展，提高乙肝功能性治愈率有重要的意义。

6-氨基烟酰胺制备乙型肝炎治疗药物

以6-氨基烟酰胺为主要活性成分或主要活性成分之一制备乙型肝炎治疗药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与6-氨基烟酰胺相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

联合治疗药物组合和施用方法

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将6-氨基烟酰胺和其他乙型肝炎治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。

抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。

小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。

使用时，可将有效量的6-氨基烟酰胺和有效量的其他乙型肝炎治疗药物同时使用，也可将有效量的6-氨基烟酰胺和有效量的其他乙型肝炎治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

一、实验方法

1.细胞培养

HepAD38培养于含有10％胎牛血清、400μg/ml G418的DMEM培养基中，在含5％CO₂，37℃孵箱中常规培养。6-氨基烟酰胺(6-Aminonicotinamide，CAS号329-89-5)购于上海毕得。

2.MTT实验

用超纯水溶解6-氨基烟酰胺，配制成20mM存储液。将1.5×10⁴HepAD38细胞或HepG2-NTCP细胞接种于96孔板中，24小时后，用DMEM培养基将20mM 6-氨基烟酰胺溶液稀释至500μM，并依次对比稀释至250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.95μM 10 个浓度，并以无药处理组为对照，纯培养基为空白，每个浓度3个复孔，每孔分别加100μl 上述溶液。72h后，加入MTT试剂10ul，37℃孵育4h，加入SDS裂解液，37℃避光孵育6h后于570nm检测OD值，计算CC50值。

3.ELISA

(1)HBV复制细胞HepAD38中检测6-氨基烟酰胺对HBV表面抗原分泌的影响：收集6-氨基烟酰胺处理后的细胞上清，2,000rpmx3min离心去除细胞碎片，取上清于新的1.5mlEP管中，生理盐水稀释1000倍，充分混匀，按照酶联免疫吸附试验试剂盒(上海科华) 操作说明，于450nm检测细胞培养上清中HBsAg的OD值。

(2)HBV转基因小鼠模型验证6-氨基烟酰胺对HBV表面抗原分泌的影响：将8次采血的小鼠血清统一储存于-80℃，于最后一次采血结束后统一检测，取1ul小鼠血清于5ml生理盐水中，充分混匀，按照酶联免疫吸附试验试剂盒(上海科华)操作说明，于450nm 检测小鼠血清中HBsAg的OD值。

(3)HBV转基因小鼠模型验证6-氨基烟酰胺对ALT、AST的影响：将8次采血的血清统一检测，按照丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶/ALT/GPT)测试盒(南京建成)和天门冬氨酸氨基转移酶(谷草转氨酶/AST/GOT)测试盒(南京建成)操作说明，检测小鼠血清中ALT、AST的OD值。

4.HBV复制细胞HepAD38中复制中间体、RNA的提取

复制中间体提取：PBS清洗细胞2次后，加入0.5ml细胞裂解液(10mM Tris-HCl pH8.0， 1mM EDTA，1％NP-40，2％sucrose)，混匀后，37℃孵育15min，收集细胞裂解液，15,000g x 5min。转移上清，并加入40U/ml DNaseI和10mM MgCl₂，37℃孵育4h后加入200μl35％ PEG8000(含1.5mol/L NaCl)，冰浴1h后11,000gx10min 4℃离心，弃上清，加入0.5ml蛋白酶K消化液(0.5％SDS，150mM NaCl，25mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA)和0.5mg/ml蛋白酶K(promega)，45℃水浴过夜。次日等体积酚氯仿抽提，70％乙醇沉淀，TE缓冲液溶解HBV DNA。

RNA提取：PBS清洗细胞2次，加入1ml Trizol裂解液，混匀后，加入200μl氯仿，vortex后，13,000rpmx10min 4℃离心，吸取上清，加入等体积异丙醇13,000rpmx10min 4℃离心进行沉淀，去除上清后，加入75％乙醇洗涤沉淀，13,000rpmx10min 4℃离心后，去除上清并干燥RNA沉淀，加水溶解，测浓度后使用TIANGEN公司Fast KingRT Kit逆转录 RNA合成cDNA。

5.HBV转基因小鼠血清中复制中间体的提取

使用Biospin病毒DNA提取试剂盒(BioFlux)，取10ul血清于190ul生理盐水中，加入10ul蛋白酶K于一只新的1.5ml离心管中，然后加入200ul裂解液，振荡混匀5-10秒。 56℃温育15分钟。于上述离心管中加入200ul无水乙醇，充分振荡混匀5-10秒。按照试剂盒操作说明，使用试剂盒中纯化柱完成病毒DNA的提取，并将DNA样品保存于-20℃。

6.HBV转基因小鼠组织中DNA、RNA的提取

分离小鼠肝脏，并于液化氮中将组织块碾磨粉碎，称取约20mg组织于1.5ml离心管中，分别用于DNA和RNA的提取

HBV转基因小鼠组织中DNA的提取：使用Biospin组织基因组DNA提取试剂盒(BioFlux)，加入600ul的FL Buffer和10ul PK solution，充分混匀，并用小型分散机(T10basic

)辅助裂解，于56℃温育15分钟使组织充分裂解后按照试剂盒操作说明，使用试剂盒中纯化柱完成病毒DNA的提取，并将DNA样品保存于-20℃。

HBV转基因小鼠组织中RNA的提取：取约20mg碾磨后的组织，加入1ml Trizol裂解液，使用小型分散机(T10basic

)辅助裂解，混匀后，加入200μl氯仿，vortex后，13,000rpmx10min 4℃离心，吸取上清，加入等体积异丙醇13,000rpmx10min 4℃离心进行沉淀，去除上清后，加入75％乙醇洗涤沉淀，13,000rpmx10min 4℃离心后，去除上清并干燥RNA沉淀，加水溶解，测浓度后使用TIANGEN公司Fast KingRT Kit逆转录 RNA合成cDNA。

7.Real-time PCR

检测细胞内HBV复制中间体：提取HBV复制中间体，按照SYBR Green(Roche,Germany)说明书配制反应体系和设置反应条件，HBV DNA引物，F：CCTAGTAGTCAGTTATGTCAAC，R:TCTATAAGCTGGAGGAGTGCGA。每个样品均设3 个复孔，每组实验重复3次。

检测小鼠血清及组织中HBV复制中间体：提取总的基因组DNA，按照SYBR Green(Roche,Germany)说明书配制反应体系和设置反应条件，HBV DNA引物， F:CCTCTTCATCCTGCTGCT(SEQ ID NO.1)；R:AACTGAAAGCCAAACAGTGV(SEQ ID NO.2)。每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次。

检测HBV RNA:逆转录RNA合成的cDNA，按照SYBR Green(Bio-Rad)说明书配制反应体系和设置反应条件，HBV 3.5-kb RNA引物为F:CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT(SE Q IDNO.3)，R:AGCACTGTGTTGGCGTACAG(SEQ ID NO.4)，total HBV RNAs引物为F:ACCGACCTTGAGGCATACTT(SEQ ID NO.5)，R:GCCTACAGCCTCCTAGTACA(S EQ ID NO.6)。每个样品均设3个复孔，每组实验重复3次。

8.统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

二、实验结果

1.MTT实验检测6-氨基烟酰胺对HepAD38细胞的毒性

接种1.5×10⁴HepAD38细胞于96孔板中，24小时后，用DMEM培养基将6-氨基烟酰胺溶液稀释500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.95μM 10个浓度，并以无药处理组为对照，纯培养基为空白，每个浓度3个复孔，每孔分别加100μl上述溶液。3d后，MTT 实验检测结果显示6-氨基烟酰胺在HBV复制细胞HepAD38中CC₅₀>500μM(图1)，表明 6-氨基烟酰胺对HepAD38细胞的毒性较小。

2.6-氨基烟酰胺抑制HBV复制细胞HepAD38中HBsAg的分泌水平

将10×10⁴HepAD38细胞接种于二十四孔板，24小时后，配制200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0μΜ6-氨基烟酰胺溶液，每孔分别加500μl上述溶液。72h 后，收集细胞培养基，用ELISA的方法检测HBsAg，结果显示，6-氨基烟酰胺在HepAD38 细胞中有效抑制HBsAg分泌的浓度为23.89μM(图2)。

将25×10⁴HepAD38细胞接种于十二孔板，24h后，配制0、12.5、25μM 6-氨基烟酰胺溶液，每孔分别加1ml上述溶液，分别于药物处理3d、6d、9d后收集细胞培养基。ELISA 检测结果显示12.5μM 6-氨基烟酰胺处理HepAD38细胞3d、6d、9d后，HBsAg的分泌分别下降至约45％，49％，33％；25μM 6-氨基烟酰胺处理HepAD38细胞3d、6d、9d后，HBsAg 的分泌分别下降至约42％，40％，28％(图3)。25nM恩替卡韦(ETV)对表面抗原的降低并不明显。

3.6-氨基烟酰胺抑制HepAD38细胞中HBV复制中间体、3.5-kb RNA、total HBVRNAs水平

将25×10⁴HepAD38细胞接种于十二孔板，24h后，配制0、12.5、25μM 6-氨基烟酰胺溶液，每孔分别加1ml上述溶液，分别于药物处理3d、6d、9d后提取细胞培养上清中和细胞内的HBV DNA及细胞内RNA。

Real-time PCR结果显示，和阴性对照组相比，12.5μM 6-氨基烟酰胺处理3d、6d、9d 后，HepAD38细胞培养上清中HBV DNA分别下降至70％、79％、77％，细胞中HBV DNA 分别下降至约85％、51％、51％；25μM 6-氨基烟酰胺处理3d、6d、9d后，HepAD38细胞培养上清中HBV DNA分别下降至73％、77％、73％，细胞中HBV DNA分别下降至约59％、 42％、45％；25nM恩替卡韦处理3d、6d、9d后，HepAD38细胞培养上清中HBV DNA分别下降至52％、41％、6％，细胞中HBV DNA分别下降至30％、30％、15％(图4、图5)。

Real-time PCR检测HBV RNA结果显示，和阴性对照组相比，12.5μM 6-氨基烟酰胺处理3d、6d、9d后，HepAD38细胞中total HBV RNAs水平下降至85％、73％、64％，HBV 3.5-kb RNA水平下降至85％、75％、35％；25μM 6-氨基烟酰胺处理3d、6d、9d后，HepAD38细胞中total HBV RNAs水平下降至80％、63％、55％，HBV 3.5-kb RNA水平下降至74％、64％、34％；25nM恩替卡韦对total HBV RNAs和HBV 3.5-kb RNA无明显影响(图6、图7)。

4.HBV转基因小鼠模型验证6-氨基烟酰胺对HBV表面抗原分泌的影响

选取15只，年龄12-14周，重量21±2g的HBV转基因小鼠(HBV-Tg C57BL/6)。眼眶采血150-200μl，4℃静置过夜，离心1,500rpmx15min，转移血清至干净EP管中(约 50-200μl)。使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(TIANGEN，货号DP315)提取血清中 HBV DNA，检测HBV DNA拷贝数。分别使用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)(上海科华)检测血清中HBsAg。选取HBV DNA拷贝数及HBsAg水平相近且较高的小鼠12只，将小鼠随机分为4组：阴性对照(0.9％生理盐水)、阳性对照(恩替卡韦 0.02mg/kg)、低浓度实验组(6-氨基烟酰胺2.5mg/kg)、高浓度实验组(6-氨基烟酰胺5mg/kg)，每组3只。腹腔注射生理盐水及6-氨基烟酰胺，口服恩替卡韦，隔天给药，每四天采血一次，分离血清，提取血清HBVDNA。最后，分离小鼠肝组织，液氮碾磨后取20mg左右的肝组织，分别提取小鼠肝脏基因组DNA和总RNA。

ELISA检测结果显示，6-氨基烟酰胺对小鼠血清ALT、AST均无明显影响，说明6-氨基烟酰胺基本没有肝毒性(图8、图9)。

ELISA检测结果显示，和0mg/kg组相比，2.5mg/kg、5mg/kg 6-氨基烟酰胺组血清中HBsAg 水平分别降低至约55％和53％；0.02mg/kg的恩替卡韦对血清中HBsAg分泌几乎没有影响 (图10)。

Real-time PCR检测血清中HBV DNA拷贝数结果显示，与0mg/kg组相比，2.5mg/kg、5mg/kg 6-氨基烟酰胺组HBV DNA拷贝数分别降低至约30％和2％；0.02mg/kg的恩替卡韦作为阳性对照，HBV DNA拷贝数下降至0.52％(图11)。

Real-time PCR检测肝脏中HBV DNA拷贝数结果显示，与0mg/kg组相比，2.5mg/kg、5mg/kg 6-氨基烟酰胺组HBV DNA拷贝数分别降低至约56％和48％；0.02mg/kg的恩替卡韦作为阳性对照，HBV DNA拷贝数下降至22％(图12)。

Real-time PCR检测肝脏中total HBV RNAs和HBV 3.5-kb RNA水平结果显示，与0mg/kg组相比，6-氨基烟酰胺组HBV 3.5-kb RNA水平降低至40％(图13)，total HBV RNAs水平降低至55％(图14)，0.02mg/kg恩替卡韦对3.5-kb RNA及total HBV RNAs水平无明显影响。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.6-氨基烟酰胺作为有效成分用于制备乙型肝炎治疗药物的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述乙型肝炎治疗药物至少具有以下功用之一：抑制HBsAg分泌水平、抑制HBV复制中间体水平、抑制3.5-kb RNA水平、抑制total HBVRNAs水平。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述乙型肝炎治疗药物必然包括6-氨基烟酰胺，并以6-氨基烟酰胺作为所述功用的有效成分。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述6-氨基烟酰胺为所述乙型肝炎治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述乙型肝炎治疗药物的形式选自固体、液体、凝胶、半流质、气雾。