CN109811030B - 盐酸安他唑啉衍生物作为hbv抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生化技术领域，提供了一种高通量筛选乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)抑制剂的方法和盐酸安他唑啉及其衍生物作为HBV抑制剂的应用。本发明首次将盐酸安他唑啉应用于抗乙型肝炎病毒，对HBVDNA的半数有效浓度(EC₅₀)可达2.910μM，可作为新型HBV抑制剂治疗HBV所引起的感染。

Description

盐酸安他唑啉衍生物作为HBV抑制剂的应用

技术领域

本发明属于生化技术领域，尤其涉及高通量筛选HBV抑制剂的方法和盐酸安他唑啉及其衍生物作为HBV抑制剂的应用。

技术背景

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)属于嗜肝DNA病毒科，主要感染人的肝细胞，可导致急性或慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，严重威胁着人们的生命健康。HBV(HepatitisB virus)完整粒子的直径为42nm，称为Dane颗粒，由外膜和核衣壳组成，有很强的感染性。我国是HBV中、高流行地区，慢性乙型肝炎是常见的多发病，给病人造成沉重的经济负担，给社会经济发展带来诸多问题，是我国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。

目前接种乙型肝炎疫苗是预防HBV感染的主要手段。95％以上的婴儿、儿童和青年接种全系列乙型肝炎疫苗后能有效预防HBV的感染。现今批准用于慢性乙型肝炎的抗病毒药物包括两类：IFN(普通INFα、聚乙二醇化INFα)和核苷(酸)类似物(拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦等)。这些药物的使用为慢性乙型肝炎抗病毒治疗提供了强有力的武器，可有效地控制HBV感染，延缓肝硬化进程，降低肝癌发病率，提高长期存活率。但现存的治疗手段并不能完全清除人体中的HBV cccDNA。

然而，在研发新型疫苗时，通常需要经过很长周期的研究开发、临床验证等阶段，需要投入大量的研发经费、时间、人力和物力，即研究开发新型疫苗的周期长且开发成本高。由于已知药物对人体的副作用研究相对比较完善，所以“已知药物新用途”可以大大地缩短药物进入临床实验的时间，节省大量的毒副作用临床验证，因此，节约了大量的研发经费、人员等的投入。这已经成为未来医药领域的药物研发的新趋势。目前盐酸安他唑啉在临床上主要用于抗组胺，还没有任何现有技术报道其在抗HBV上的应用。

本发明以乙型肝炎病毒(HBV)为研究对象，利用HepAD38细胞系建立筛选模型。其中，该模型是根据HepAD38细胞系的特点(即细胞基因组上插入HBV序列，序列上游有CMVtet启动子，可通过四环素或其类似物DOX启动HBV的复制)，通过商业化试剂盒中的核酸释放剂直接使样本中的核酸从其他物质结合的状态中释放出来，更直接高效地检测上清中HBVDNA的拷贝数，不用经过提取的过程，相比于根据Huh7细胞建立的转染和感染体系，培养时间大大缩短，且能在96孔板中实现化合物筛选实验。

发明内容

本发明公布了HepAD38高通量体外评价模型的建立。包括如下步骤：将加DOX处理一周及以上的HepAD38细胞按照每孔4×10⁴～5×10⁴个铺至96孔胶原板中，培养基含有DMEM+10％血清+1％青链霉素，撤去DOX。继续在培养箱在培养16～24h。用DMEM+10％血清+1％青链霉素+1％DMSO(二甲基亚砜)的培养基将储液形式的待测化合物稀释成10μM～100μM。将孔中的原培养基吸走，在96孔板的第2～7列中的B→J行孔中分别加入稀释好的化合物，每个化合物设置3个复孔，第11行6个孔设置3个阳性对照和3个细胞对照。置于37℃，含5％CO₂的培养箱中培养72h后，弃去上清换液。相同的稀释操作后继续置于培养箱中培养48h后，收上清待测。

本发明旨在提供盐酸安他唑啉作为HBV抑制剂的新用途。

本发明还提供了盐酸安他唑啉作为HBV抑制剂的应用方法，包括如下步骤：将HepAD38细胞按照4×10⁵个/孔接种于12孔胶原板中，37℃，5％CO₂孵育24h后，将储液浓度为10mM的盐酸安他唑啉用培养基稀释至30μM，并3倍浓度梯度依次稀释成10μM，3.33μM，1.11μM，0.370μM，0.123μM等5个浓度，每个浓度设置3个复孔加至2个12孔板中，并设置3个细胞对照组。37℃，5％CO₂孵育72h后换液，继续孵育48h后收上清液。用ELISA试剂盒和乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒检测培养上清中的HBeAg、HBeAg和HBV DNA。提其胞内HBV core-associated DNA并进行Southern blot。

本发明应用上述筛选方法对FDA已批准上市的成药化合物库中的近800个化合物进行筛选，选出对HBV的标志物(HBsAg、HBeAg和HBV DNA)有抑制作用的化合物。其筛选结果显示化合物Antazoline hydrochloride(盐酸安他唑啉)对HBV DNA有较好的抑制效果，其EC₅₀为2.910μM左右，CC₅₀为30μM以上。

本发明还提供了部分盐酸安他唑啉衍生物在制备抗HBV药物中的应用，后续将用作新型HBV抑制剂。

附图说明

图1a～图1c是采用本发明建立的HepAD38高通量评价模型验证LAM对HBV的抑制作用的可行性实验结果；

图2a～图2b是FDA库成药化合物对HBV DNA的抑制效果；

图3a～图3e是盐酸安他唑啉对HBV的抑制效果。

具体实施方式

本发明将盐酸安他唑啉的生物活性测试过程为具体实施例，对本发明所涉及到的给药方式和盐酸安他唑啉衍生物的具体合成路线进行说明，但实施例的选择并不意味着本发明的制备方法的任何限制。

已知LAM对HBV DNA有明显的抑制效果，而对HBeAg和HBsAg没有显著的作用，因此本发明以Lamivudine(拉米夫定，LAM)作为阳性参照验证HepAD38体外筛选模型的可行性。具体的验证操作过程如下：将LAM加至铺有HepAD38的96孔胶原板中，每孔的细胞数为4×10⁴个，用含10％FBS+1％青链霉素+1％DMSO的DMEM培养基将LAM稀释至浓度为10μM的工作液，设置一组细胞对照。分别在加LAM的第0，2，4，6天收集上清液、更换同样浓度的LAM工作液。分别通过ELISA试剂盒和乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒检测细胞培养上清液中的HBeAg、HBsAg和HBV DNA含量并记录测试数据，并利用GraphPad Prism进行数据处理。

实验验证结果详见图1a～图1c，从图1a～图1c所示结果来看，从加入LAM工作液的第4天开始，细胞培养上清液中的HBeAg、HBsAg和HBV DNA的量均有显著的变化。该实验结果表明上述的筛选模型可以用于筛选对HBV的标志物(HBsAg、HBeAg和HBV DNA)有抑制作用的化合物。

本发明采用下述筛选方法对FDA成药化合物库中的近800个化合物进行初次筛选(该FDA化合物库从MCE公司购得，共计796种化合物，包括Anti-infection Library(抗感染库)和GPCRG库)。具体的筛选流程如下：

(1)HepAD38细胞的复苏：

将冻于液氮中的HepAD38细胞在37℃水浴锅中快速解冻，加入至装有10ml培养基的培养皿中，培养基含有DMEM+10％血清+1％青链霉素，并加入10μl2mg/ml的DOX。置于37℃，含5％CO₂的培养箱中培养。

(2)HepAD38细胞的铺板和加药实验：

将HepAD38细胞以每孔4×10⁴个铺至96孔胶原板中，为防止边缘效应，只铺中间60个孔，边缘36个孔每个加入100μl PBS缓冲液。培养基含有DMEM+10％血清+1％青链霉素，撤去DOX。继续在培养箱在培养16～24h。已知FDA库中的化合物均为10mM储液，用DMEM+10％血清+1％青链霉素+1％DMSO(二甲基亚砜)的培养基将上述化合物配制成10μM/100μM进行初次筛选。将孔中的原培养基吸走，在96孔板的第2～7列中的B→J行孔中分别加入稀释好的化合物，每个化合物设置3个复孔，第11行6个孔设置3个阳性对照和3个细胞对照。置于37℃，含5％CO₂的培养箱中培养72h后，弃去上清换液。相同的稀释操作后继续置于培养箱中培养。

(3)培养48h后，收上清待测。每孔加入含有10μl WST-1的培养基100μl。在培养箱中孵育1h后，在酶标仪下检测每孔在450nm和630nm处的吸光值，分别计算在加药浓度下，化合物对细胞的毒性。细胞培养上清用ELISA试剂盒和乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒检测其中的HBeAg、HBsAg和HBV DNA的含量，并用Microsoft Excel计算作图。

其中初筛结果详见图2a～图2b，图2a～图2b给出了FDA库成药化合物对HBV DNA的抑制效果。并且，结合下表1可以看出，在初始加药浓度为10μM时，显示出盐酸安他唑啉对细胞培养上清中HBV DNA的抑制率达到80％以上。因此，可初步确定盐酸安他唑啉对HBV DNA有抑制作用，且在10μM下，对细胞没有明显的毒性。

表1

根据上述初筛结果，本发明提出了盐酸安他唑啉作为HBV抑制剂的应用方法，该方法包括如下步骤：

(1)HepAD38细胞的铺板和加药实验：

将HepAD38细胞以每孔4×10⁵个铺至12孔胶原板中，培养基含有DMEM+10％血清+1％青链霉素，撤去DOX。继续在培养箱在培养16～24h。将盐酸安他唑啉粉末溶解在DMSO(二甲基亚砜)中，配制成10mM储液。用含DMEM+10％血清+1％青链霉素+1％DMSO的培养基将盐酸安他唑啉储液配制成30μM，10μM，3.33μM，1.11μM，0.370μM，0.123μM 6个浓度梯度，每个浓度设置3个复孔加至2个12孔板中，并设置3个阳性对照和3个细胞对照。置于37℃，含5％CO₂的培养箱中培养72h后，弃去上清换液，相同的稀释操作后继续置于培养箱中培养。

(2)培养48h后，收上清用ELISA试剂盒和乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒检测其中的HBeAg、HBsAg和HBV DNA的含量。其中HBeAg和HBsAg的吸光值通过酶标仪读取，HBVDNA的拷贝数通过Real-time PCR仪检测，所得数据通过GraphPad Prism作图，结果详见图3a～图3d所示。

(3)提取胞内HBV core-associated DNA

a.用预冷的PBS洗涤细胞2次，每孔加入400μl细胞裂解液(50mM Tris-HCl，50mMNaCl，1mM EDTA，1％NP-40，pH7.4)，在冰上放置10min。

b.用枪头吹打细胞30次，转移至1.5ml EP管，上下颠倒混匀，在冰上放置10min。4℃，14000r/min离心5min，将上清转移至新的1.5ml EP管中。

c.加入4μl 1M MgCl₂和4μl 10mg/ml的DNaseⅠ，颠倒混匀后在37℃水浴锅孵育30min。

d.加入20μl 0.5M EDTA(pH8.0)，上下颠倒混匀。加入10μl 20mg/ml蛋白酶K和40μl 10％SDS，颠倒混匀，55℃水浴锅孵育2h。

e.加入各250μl的Tris饱和酚和氯仿(1:1)，颠倒混匀10次，室温放置10min。4℃，12000×g离心10min，将上层液体转移至新的1.5ml EP管中。

f.加入0.7倍体积的异丙醇，0.1倍体积NaAc(3M，pH5.2)和15μg tRNA，-20℃放置过夜。

g.4℃，14000r/min离心15min，弃去上清，不要触动沉淀。加入1ml 70％乙醇溶液，4℃，14000r/min离心1min。

h.弃去上清，自然风干5min后，每个加入20μl RNase水，70℃干浴10min。每个加入4μl 10×loading buffer，冻存于-20℃冰箱。

(4)DNA电泳及真空转膜：

a.将上述样品点在不加EB的1％琼脂糖凝胶，50V恒压电泳4h。

b.将DNA胶放入变性缓冲液中，摇床上变性30min，弃去变性液。再将DNA胶放入中和缓冲液中，摇床上中和30min，弃去中和液。

c.在支撑板上依次放上2张20×SSC浸润的滤纸，DNA胶和尼龙膜。在DNA胶的四周覆盖上封口膜。再在尼龙膜上放置2张浸润的滤纸和一叠吸水纸。最后在吸水纸的上方压上重物，使其转膜过夜。

d.将转过夜的尼龙膜放在紫外交联仪下，1200J/cm²交联固定。放置在4℃冰箱中保存。

(5)Southern blot

合成DNA探针后与上述保存的尼龙膜杂交过夜，用Solution1和Solution2洗涤后，用保鲜膜包好放置在已清屏的磷屏中间，在暗盒中过夜。最后用磷屏成像仪(Phospho-Imager，Cyclon，Parkard Instrument)读取磷屏上的信号。本发明中盐酸安他唑啉给药后的细胞胞内HBV DNA的Southern blot结果见图3e。

从图3a～图3d的测试结果中可以看出，当初始加药浓度为30μM时，对上清液中的HBV DNA抑制效果达到60％，EC₅₀为2.910μM左右，CC₅₀为30μM以上。且随着浓度的降低，对HBV DNA的抑制效果也呈现逐渐下降趋势。对上清液中HBeAg和HBsAg没有明显抑制作用。

提取其细胞内HBV core-associated DNA并进行Southern blot实验发现，盐酸安他唑啉对细胞内HBV DNA也有不同程度的抑制效果，且呈现浓度依赖性(实验结果如图3e所示)。

综上所述，盐酸安他唑啉可应用于治疗乙型肝炎病毒感染。此外，本发明可大大地缩短研发新的抗HBV药物进入临床实验的时间，节省大量的毒副作用临床验证，节约了大量的研发经费、人员等的投入，对于未来的抗HBV药物的进一步研发具有重要的指导意义。

盐酸安他唑啉衍生物的化学合成：

实施例1

(1)在干热的HMPA/DMPU中依次加入无水的10mmol的N-苄基苯胺，15mmol的氯乙腈，再加入10mmol的K₂CO₃和10mmol的NaI。反应体系在100℃中加热45min。反应产物用水稀释后，通过EtOAc(4×50cm³)萃取。将混合萃取液用水(3×50cm³)洗涤，然后用无水Na₂SO₄干燥。将溶剂蒸发后得到棕色残余物，将残余物通过硅胶柱色谱[乙烷：CHCl₃(50:50)]纯化，得到相应的产物B。

(2)将产物B(10mmol)，硫代乙酰胺(1mmol)在乙二胺(7cm³)中搅拌，并回流3h。将反应混合物用水稀释，用CHCl₃(4×50cm³)萃取。将CHCl₃萃取混合液用水(3×50cm³)洗涤，然后用无水Na₂SO₄干燥。蒸发溶剂后用石油醚(60:80)研磨得到的残余物即为相应的分析纯的安他唑啉衍生物，然后通过CHCl₃和己烷重结晶进一步纯化即得产物C，收率为84％。

实施例2

取50ml圆底烧瓶依次加入2mmol化合物D，6mmol化合物E，慢慢向体系中加入40mgPd，160℃中反应12h后结束，即得产物F，收率为87％。

实施例3

取50ml圆底烧瓶依次加入0.5mmol化合物G，0.75mmol苄基溴，缓缓向体系中加入2.5mol％的[RuCl₂(p-cymene)]₂和1.5倍体积的PhSiH₃作为催化剂，加入0.5ml的CH₃CN，80℃水浴反应16h后结束，即得产物I，收率为78％。

实施例4

取50ml圆底烧瓶依次加入2mmol化合物J，6mmol化合物K，慢慢向体系中加入40mgPd，160℃中反应12h后结束，即得产物L，收率为95％。

实施例5

取50ml圆底烧瓶依次加入0.5mmol化合物M，0.75mmol的化合物N，缓缓向体系中加入2.5mol％的[RuCl₂(p-cymene)]₂和1.5倍体积的PhSiH₃作为催化剂，并加入0.5ml的CH₃CN和10mol％的PPh₃，80℃水浴反应14h后结束，即得产物O，收率为76％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.盐酸安他唑啉在制备HBV抑制剂中的用途，其特征在于：所述HBV抑制剂为HBV DNA抑制剂。

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